средство, усиливающее действие биологически активных веществ и лекарственных препаратов

Формула изобретения

Применение иммобилизированной с помощью электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы в качестве средства, усиливающего действие биологически активных веществ и лекарственных препаратов разных фармакологических групп, позволяющего значительно снижать их эффективные терапевтические дозы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и медицине.

Существуют средства, обладающие способностью модулировать влияние отдельных биологически активных веществ, а также усиливающие действие лекарственных препаратов [1, 2].

Недостатком данных средств является их высокая специфичность. Каждое из существующих средств способно оказывать свое влияние в отношении либо конкретного эндогенного биологически активного вещества или ограниченной группы веществ, либо лекарственного препарата и контролируемой им функции [2]. Кроме того, имеющиеся средства являются недостаточно эффективными.

Известно средство, представляющее собой иммобилизированную с помощью ионизирующего излучения (нанотехнологии электронно-лучевого синтеза) гиалуронидазу. Показано, что данное средство способно увеличивать резерв стволовых клеток в организме [3].

Авторами впервые выявлены его выраженная потенцирующая активность в отношении действия биологически активных веществ (в том числе эндогенных гормонов, факторов роста и др. цитокинов) и лекарственных препаратов разных фармакологических групп, позволяющая снижать их эффективные терапевтические дозы.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности действия биологически активных веществ и лекарственных препаратов.

Поставленная задача достигается применением иммобилизированной с помощью технологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы в качестве средства для усиления действия биологически активных веществ и лекарственных препаратов разных фармакологических групп.

Новым в предлагаемом изобретении является применение иммобилизированной гиалуронидазы в качестве средства для усиления действия биологически активных веществ и лекарственных препаратов разных фармакологических групп.

Используемое авторами оригинальное средство иммобилизированной с помощью ионизирующего излучения на низкомолекулярном носителе гиалуронидазы было разработано и получено НИИ фармакологии СО РАМН (г.Томск) совместно с ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент» (г.Новосибирск).

Гиалуроновая кислота (ГК) является одним из основных компонентов межклеточного матрикса тканей организма. При этом важная роль в метаболизме данного гликозаминогликана (ГАГ) принадлежит ферменту - гиалуронидазе, под действием которого происходит расщепление ГК до полимеров с различной молекулярной массой и биологическими свойствами [4, 5].

В то же время показано, что гиалуронидаза способна повышать проницаемость тканевых барьеров, тем самым изменяя фармакокинетику ряда лекарственных средств, повышать их эффективность за счет увеличения концентрации препаратов в организме [1]. При этом препараты гиалуронидазы («Лидаза», «Лонгидаза») неспособны усиливать эффекты высокорастворимых (свободно проникающих через биологические барьеры) веществ, а также лекарственных средств рецепторного действия в случае их использования в максимально эффективных дозах. Кроме того, препараты нативной гиалуронидазы не могут быть использованы в нетоксичных дозах [4] в качестве средства для получения системных терапевтических эффектов (связанных с резорбтивным действием лекарственного средства), что обусловлено высоким содержанием эндогенных ингибиторов гиалуронидазы в тканях и сыворотке крови млекопитающих [6], предопределяющих ее быструю инактивацию при введении в организм.

Вместе с тем известно, что иммобилизация гиалуронидазы на полимерном носителе с помощью технологии/нанотехнологии электронно-лучевого синтеза (направленным потоком ускоренных электронов с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенной дозой от 2 до 10 кГр, скоростью набора дозы 1,65 кГр/час) сопровождается значительным повышением ее физической стабильности и устойчивости к протеазам, что делает возможным получение системных/резорбтивных эффектов данного фермента/средства [3]. В частности, установлена возможность повышения функциональной активности стволовых клеток в организме, связанное с деградацией ГК межклеточного матрикса и образованием значительного количества ее средне- и низкомолекулярных форм [3].

В то же время гиалуроновая кислота входит в состав не только межклеточного матрикса, но и гликокаликса клеток и их рецепторов к различным биологически активным веществам [7]. Однако зависимость степени сродства (аффинности) рецепторов к лигандам от состояния гиалуроновой кислоты, входящей в состав соответствующих рецепторов, до сих пор не изучена.

Факт применения иммобилизированной гиалуронидазы (имГД) с достижением нового технического результата, заключающегося в усилении действия биологически активных веществ, в том числе эндогенных гормонов, факторов роста, цитокинов и других субстанций, а также лекарственных препаратов разных фармакологических групп, для специалиста является не очевидным.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на мышах-самцах линии CBA/CaLac в количестве 268 штук массой 18-20 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Оценка влияния иммобилизированной гиалуронидазы на способность прогениторных клеток различных классов отвечать на специфические и неспецифические ростовые факторы

Моделью для изучения чувствительности клеточных элементов (способности реагировать) к гемопоэтическому фактору роста - гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (Г-КСФ), гормону - эритропоэтин, и полифункциональному и плейотропному регулятору функций прогениторных клеток - фактору роста фибробластов, служили клетки костного мозга мышей.

Моделью для изучения чувствительности клеточных элементов (способности реагировать) к раннедействующему стимулятору функций стволовых клеток - фактору роста стволовых клеток, служили клетки печени мышей. В работе использовались культуральные методы исследования [8].

Для изучения влияния имГД проводили преинкубацию исследуемого материала в среде, содержащей данный фермент. Преинкубацию цельного костного мозга и диссоциированной ткани печени (2 млн/мл) осуществляли в жидкой культуральной среде (DMEM, «Sigma», США), содержащей 0,1; 0,5 и 1 ЕД/мл имГД. Время преинкубации в растворе, содержащем 0,1 ЕД имГД, составляло 10, 30 и 60 мин. В случае использования других концентраций имГД преинкубацию проводили в течение 60 мин. После этого исследовали способность миелокариоцитов образовывать КОЕ-Ф в полувязкой среде [8], в которую добавляли фактор роста фибробластов, а также способность паренхиматозных клеток-предшественников печени формировать тканеспецифические колонии в присутствии фактора роста стволовых клеток.

Преинкубацию неприлипающих миелокариоцитов костного мозга (2 млн/мл) осуществляли в жидкой культуральной среде (DMEM, «Sigma», США), содержащей 0,1; 0,5 и 1 ЕД/мл имГД в течение 60 мин. Затем изучали образование эритроидных (КОЕ-Э) и грануломоноцитарных (КОЕ-ГМ) колоний в полувязкой среде, содержащей соответственно рекомбинантные эритропоэтин («Рекормон», Хоффман-ля-Рошше, Швейцария, в дозе 2 ЕД/мл) и Г-КСФ («Нейпоген», Хоффман-ля-Рошше, Швейцария, в дозе 5 нг/мл) [8].

Для клонирования предшественников из костного мозга использовали среду следующего состава: 1% метилцеллюлозы, 80% среды DMEM, 19% эмбриональной телячей сыворотки, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина (а также вышеуказанные факторы роста), и инкубировали в CO ₂-инкубаторе при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 3 сут при изучении роста КОЕ-Э и 7 сут при исследовании роста КОЕ-ГМ и КОЕ-Ф.

Для клонирования предшественников из печеночной ткани использовали среду: 90% среды DMEM, 10% эмбриональной телячей сыворотки, 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 8000 МЕ/л гепарина, 25 мг/л инсулина, 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток («Sigma», США), и инкубировали в CO₂-инкубаторе при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 10 сут.

Контролями во всех случаях служила колониеобразующая способность клеток, не обработанных гиалуронидазой, и таковая при культивировании клеточного материала в среде, не содержащей фактора роста.

В ходе эксперимента было обнаружено, что предварительная обработка миелокариоцитов либо печеночных клеток ферментом сопровождается значительным усилением выхода КОЕ-Э, КОЕ-ГМ, КОЕ-Ф и клеток-предшественников печени (КОЕ-Печ) в среде, не содержащей дополнительных ростовых факторов. При этом колониестимулирующая активность питательной среды определялась совокупностью биологически активных веществ эмбриональной телячьей сыворотки [8] (табл.1).

Таблица 1
Рост КОЕ-Э, КОЕ-ГМ, КОЕ-Ф и КОЕ-Печ при добавлении соответственно эритропоэтина, Г-КСФ, фактора роста фибробластов и фактора роста стволовых клеток, а также рост колоний после преинкубации миелокариоцитов в растворе имГД, (X±m)
Сроки исследования, сутки	КОЕ-Э, на 105 миелокариоцитов	КОЕ-ГМ, на 105 миелокариоцитов	КОЕ-Ф, на 105 миелокариоцитов	КОЕ-Печ, на 105 нуклеаров
фон	контроль	3,83±0,31	2,17±0,31	12,67±0,33	5,7±0,56
фактор роста	7,83±0,6*	5,5±0,5*	27,5±2,17*	14,67±1,3*
0,1 ЕД имГД 10 мин	контроль	-	-	26,83±1,47*	13,1±1,1*
фактор роста	-	-	41,0±0,97*& #	27,6±2,4*&#
0,1 ЕД имГД 30 мин	контроль	-	-	22,33±2,69*	15,6±0,98*
фактор роста	-	-	40,67±3,79* &#	28,9±2,6*&#
0,1 ЕД имГД 60 мин	контроль	10,83±0,79* &	6,17±0,4*	21,83±2,52*	19,4±3,1*
фактор роста	16,0±0,37*& #	11,0±0,86*&#	43,5±4,4*#	31,6±0,82*&#
0,5 ЕД имГД 60 мин	контроль	10,5±0,89*&	8,67±1,15*&	16,17±1,08* &	14,3±0,6*
фактор роста	16,83±0,7*& #	15,67±1,05*&#	33,5±1,77*& #	26,7±0,45*&#
1 ЕД имГД 60 мин	контроль	5,17±0,31*&	7,83±0,98*	12,5±1,18&	6,8±0,62
фактор роста	7,5±0,43*#	8,67±0,88*&	10,17±1,05&	7,3±0,54
* - отмечена достоверность различия показателя от его фонового значения без добавления факторов роста при p<0,05;
& - отмечена достоверность различия показателя от его фонового значения с добавлением факторов роста при p<0,05;
# - отмечена достоверность различия показателя от контрольного значения без добавления фактора роста при p<0,05.

Кроме того, клеточные элементы, полученные после их инкубации с имГД по разным схемам, обладали существенно более выраженной восприимчивостью к ответу (чем интактные нуклеары) и на специфические факторы роста (табл.1). Так, значительно усиливалась способность кроветворных и мезенхимальных клеток-предшественников реагировать на эритропоэтин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и фактор роста фибробластов, а паренхиматозных стволовых клеток печени - на фактор роста стволовых клеток.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о прямом влиянии имГД на клеточные элементы, предопределяющем их чувствительность к различным биологически активным веществам и экспрессию их функций.

Пример 2

Изучение стимулирующего действия имГД в отношении гипогликемической активности сахароснижающих препаратов

В качестве сахароснижающих препаратов использовали препарат инсулина короткого действия («Актропид», Ново Нордиск) и пероральный сахароснижающий препарат «Глюкобай» («Байер», Германия).

Изучение влияния имГД на активность инсулина и перорального сахароснижающего средства определяли на модели сахарного аллоксанового диабета у мышей линии BALB/c [9]. Препарат инсулина использовали подкожно в дозе 2 МЕ/кг, а глюкобай перорально в дозе 50 мг/кг. До применения препаратов (за 1 час) животные опытных групп внутрижелудочно получали препарат иммобилизированной гиалуронидазы (имГД) в дозе 50 ЕД/кг. Через 2 ч, 4 ч, 6 ч и 24 ч после введения сахароснижающих препаратов определяли содержание глюкозы в периферической крови (прибор «SmartScan» («Johnson & Johnson соmаnу», США). Забор крови осуществляли из хвостовых сосудов. В ходе эксперимента животные имели свободный доступ к воде и пище.

В ходе эксперимента курсовое введение аллоксана приводило к развитию стойкой гипергликемии, сопровождаемой гибелью животных (16% к концу эксперимента) (табл.2).

Введение исследуемых препаратов во всех случаях оказывало в разной мере выраженное сахароснижающее действие. Причем наличие гипогликемической активности было выявлено и у иммобилизированной ГД, эффект которой проявлялся в течение всего периода наблюдения. При этом обнаруженный феномен (самостоятельная гипогликемическая активность имГД), очевидно, был связан с изменением/повышением чувствительности тканей организма под влиянием фермента к эндогенному инсулину.

Парентеральное применение стандартного препарата инсулина короткого действия закономерно приводило к нормализации содержания глюкозы в периферической крови на 2 и 4 час после его использования. Более того, корригирующее влияние на гипергликемию данного средства отмечалось также через 6 и 24 часа. Вместе с тем предварительное введение имГД в значительной степени усиливало специфическую активность гормона. В частности, через 2 часа после применения инсулина у всех животных развилась гипогликемическая кома (длилась около 8-10 часов, гибель через 24 часа составила 40%). При этом концентрация сахара в крови во все сроки наблюдения была существенно ниже, чем при использовании только инсулина, и достигала наименьших значений через 4 часа (1,94 ммоль/л).

Наименее выраженными гипогликемическими свойствами обладал глюкобай. Так, пероральное использование указанного вещества сопровождалось лишь развитием тенденции к снижению уровня глюкозы в крови в ранние сроки (2, 4 часа) и достоверному, но не столь выраженному, как в предыдущих случаях (при введении других средств), уменьшению данного показателя относительно контрольных значений к концу эксперимента (6, 24 часа).

В то же время совместное использование глюкобая с имГД приводило к существенно более значимой коррекции гипергликемии, чем при использовании одного перорального сахароснижающего средства.

Таблица 2
Динамика содержания глюкозы в периферической крови (ммоль/л) при аллоксановом диабете (СД) и при введении иммобилизированной гиалуронидазы (ГД), инсулина, глюкобая и совместного применения препаратов инсулина и глюкобая с гиалуронидазой на фоне моделирования СД, (X±m)
Группы	Интакт	СД (до введения гиалурони- дазы) (745)	До введения препаратов инсулина (в 3-х группах после введения гиалурони- дазы) (1000)	Через 2 часа после введения препаратов инсулина (1200 )	Через 4 часа после введения препаратов инсулина (1400)	Через 6 часов после введения препаратов инсулина (1600 )	Через 24 часа после введения препаратов инсулина (1000)
Контроль (СД)	1	7,78±0,23	28,54±1,07*	29,66±1,57*	24,36±2,51*	21,1±1,13*	32,88±0,42*	30,48±1,37*
СД + ГД	2	16,78±2,74*#	12,02±0,7#	15,42±0,43*#	31,2±1,08*	13,02±1,07*#
СД + инсулин	3	26,64±1,88*	4,91±1,25*#	3,96±0,66*#	17,71±3,97*#	17,64±1,94*#
СД + инсулин + ГД	4	19,44±2,71*#&	2,08±0,12*#&	1,94±0,16*#&	3,9±0,68*#&	9,17±0,43*#&
СД + глюкобай	5	29,53±2,24*	21,08±1,38*	16,8±4,04*	26,18±2,82*#	20,72±2,33*#
СД + глюкобай + ГД	6	17,63±1,93*#&	8,48±0,2*#&	12,9±0,33*#&	26,04±1,73*#	16,62±1,57*#
* - отмечена достоверность различия показателя от его значения у интактных животных при 0,05;
# - отмечена достоверность различия показателя от его значения у контрольных животных (СД) при p 0,05;
& - отмечена достоверность различия показателя от его значения у животных, получавших препарат инсулина или глюкобай совместно с гиауронидазой, при p 0,05.
Примечание: Схема введения препаратов и регистрации уровня содержания глюкозы в крови по времени и группам: 745 - определение глюкозы во всех группах (СД); 800 - введение имГД во 2, 4, 6 группах; 1000 - определение глюкозы во всех группах; 1000 - введение препаратов инсулина в 3, 4, 5, 6 группах; 1200, 1400, 16 00, 1000 - определение глюкозы во всех группах.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о значительной потенцирующей способности иммобилизированной гиалуронидазы в отношении специфической гипогликемической активности как эндогенного (самостоятельная гипогликемическая активность препарата), так и вводимого извне инсулина и перорального сахароснижающего лекарственного средства.

Пример 3.

Исследование потенцирующего влияния иммобилизированной гиалуронидазы на эритропоэзстимулирующее действие эритропоэтина

Экспериментальной моделью служила цитостатическая миелосупрессия у мышей, вызванная введением карбоплатина в дозе 100 мг/кг (максимально переносимая доза) однократно внутрибрюшинно.

Препарат эритропоэтина («Рекормон», Хоффман-ля-Рош, Швейцария) вводили в течение 5-ти дней, начиная со следующего дня после введения карбоплатина в дозе 5 ЕД/мышь п/к. Указанная доза в предварительных экспериментах была определена как максимально эффективная терапевтическая доза (ее дальнейшее увеличение не сопровождается повышением эффективности терапии). Иммобилизированную гиалуронидазу начинали вводить одновременно с рекормоном в дозе 5 ЕД/кг 1 раз в день в течение 2 дней, внутрибрюшинно. В качестве препарата сравнения использовали препарат «Лонгидазу» (НПО Петровакс Фарм. Россия), представляющую собой химический конъюгат гиалуронидазы («Лидаза») с полиоксидонием, которую вводили в аналогичном режиме и эквивалентной дозе.

Состояние системы крови изучали с помощью стандартных и культуральных гематологических методов по содержанию эритроидных прекурсоров (КОЕ-Э) и эритрокариоцитов в костном мозге, а также ретикулоцитов и эритроцитов в периферичекой крови [8].

Таблица 3
Динамика показателей эритроидного ростка кроветворения у мышей линии CBA/CaLac, получавших однократно карбоплатин (1), карбоплатин и эритропоэтин (2), карбоплатин, эритропоэтин и лонгидазу (3), карбоплатин, эритропоэтин и препарат иммобилизированной гиалуронидазы (4), (X±m)
Сроки исследования, сутки	КОЕ-Э в костном мозге, на 105 миелокариоцитов	Эритрокариоциты в костном мозге, ×106	Ретикулоциты, промилли	Эритроциты, Т/л
фон	14,45±1,22	2,13±0,2	12,4±0,7	9,04±0,12
3-е	1	5,4±0,3*	0,89±0,03*	2,3±0,42*	9,01±0,31
	2	7,5±0,2*#	0,94±0,02*	4,1±0,3*#	9,1±0,24
	3	7,54±0,36*#	0,97±0,03*	3,87±0,5*#	9,2±0,58
	4	9,87±0,47*#&	1,3±0,04*# &	5,7±0,4*#&	9,14±0,36
5-е	1	8,8±0,9*	1,1±0,02*	9,7±0,56*	8,74±0,2
	2	14,6±0,5#	1,5±0,03*#	18,9±0,5*#	8,81±0,12
	3	13,7±0,64#	1,4±0,02*#	19,7±0,97*#	8,8±0,1
	4	18,5±0,71*#&	1,8±0,01*#&	25,6±0,7*#&	8,4±0,3
7-е	1	21,3±1,4*	1,07±0,01*	19,8±0,3*	7,52±0,19*
	2	24,3±2,3*	1,57±0,02*#	29,3±1,5*#	8,4±0,1*#
	3	23,7±1,7*	1,56±0,01*#	28,7±1,67*#	8,36±0,12#*
	4	29,81±1,32*#&	2,4±0,03#&	34,1±0,78*#&	8,6±0,17*#
10-е	1	7,9±0,56*	1,89±0,02*	22,1±0,65*	8,7±0,14
	2	8,97±0,34*	2,3±0,04#	39,7±0,44*#	9,2±0,09#
	3	7,98±0,46*	2,4±0,1#	40,1±1,3*#	9,13±0,08#
	4	11,3±0,55#&	2,78±0,01*#&	44,6±0,82*#&	11,2±0,05*#&
14-е	1	12,3±1,4	2,4±0,1	13,2±1,3	7,6±0,16*
	2	13,5±0,98	2,89±0,06*#	16,2±0,52*#	10,4±0,3*#
	3	14,6±0,75	2,67±0,1*#	15,8±0,63*#	9,89±0,34*#
	4	12,9±0,61	3,4±0,7*#&	18,1±1,1*#&	12,5±0,2*#&
* - отмечена достоверность различия показателя от его значения у интактных животных при p 0,05;
# - отмечена достоверность различия показателя от его значения у контрольных животных (карбоплатин) при p 0,05;
& - отмечена достоверность различия показателя от его значения у животных, получавших препарат эритропоэтина, при p 0,05.

В ходе эксперимента введение карбоплатина приводило к выраженной депрессии эритроидного ростка кроветворения (табл.3). При этом введение эритропоэтина сопровождалось закономерным ускорением регенерации кроветворной ткани, проявляющимся в более раннем и выраженном возрастании количества эритроидных КОЕ и эритрокариоцитов в костном мозге, а также ретикулоцитов и эритроцитов в периферической крови. При этом дополнительное введение лонгидазы не приводило к усилению действия препарата эритропоэтина.

В отличие от существующего препарата гиалуронидазы применение заявляемого средства на основе данного фермента (гиалуронидазы, иммобилизированной с помощью технологии электронно-лучевого синтеза) приводило к еще более резкому увеличению в гемопоэтической ткани числа КОЕ-Э (5-е сут) и эритрокариоцитов (5, 7, 10-е сут). Указанные изменения костномозгового кроветворения сопровождались закономерно более высокими значениями циркулирующих зрелых клеток красной крови (7, 10, 14-е сут) по сравнению с группой животных, получавших только эритропоэтин (табл.3).

Таким образом, иммобилизированная с помощью электронно-лучевого синтеза гиалуронидаза оказывала выраженный потенцирующий эффект в отношении эритропоэстимулирующего действия рекомбинантного эритропоэтина в максимально эффективной дозе.

Пример 4.

Исследование влияния иммобилизированной гиалуронидазы на гемопоэзстимулирующую активность гранулоцитарного колониестимулирующего фактора

Моделирование цитостатической миелосупрессии осуществляли путем однократного внутрибрюшинного введения циклофосфана в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) в 0,3 мл физиологического раствора.

Опытным животным на фоне моделирования миелосупрессии вводили подкожно препарат Г-КСФ («Нейпоген», Хоффман-ля-Рош, Швейцария) в дозах 2 и 125 мкг/кг 1 раз в день в течение 5 сут. Доза 125 мкг/кг в предварительных экспериментах была определена как максимально эффективная, а 2 мкг/кг - как неэффективная доза.

Иммобилизированную гиалуронидазу вводили перорально, начиная одновременно с препаратом Г-КСФ в дозе 20 ЕД/кг 1 раз в день в течение 7 дней.

Состояние системы крови изучали с помощью стандартных и культуральных гематологических методов по содержанию грануломоноцитарных прекурсоров (КОЕ-ГМ), незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге, а также нейтрофилов в периферической крови [8].

Введение циклофосфана закономерно приводило к выраженной депрессии костномозгового кроветворения. Отмечалось падение содержания незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге. При этом указанная динамика сменялась в дальнейшем нормализацией показателя зрелых нейтрофильных гранулоцитов и увеличением количества эритрокариоцитов и незрелых нейтрофильных гранулоцитов на 10, 14-е сут относительно фоновых значений, свидетельствующее о высокой интенсивности регенераторных процессов в гемопоэтической ткани. Отражением состояния костномозгового кроветворения явилась картина периферической крови (табл.4).

Препарат Г-КСФ значительно стимулировал процессы регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения, но только в случае его использования в дозе 125 мкг/кг. При этом практически во все сроки опыта отмечалось существенное увеличение содержания кроветворных прекурсоров в гемопоэтической ткани относительно цитостатического контроля.

Изменения состояния пула родоначальных клеток закономерно приводили к более быстрому и значительному возрастанию числа нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге и нейтрофилов в периферической крови (табл.4).

Таблица 4
Динамика показателей грануломоноцитопоэза у мышей линии CBA/CaLac, получавших однократно циклофосфан (1), циклофосфан и Г-КСФ в дозе 2 мкг/кг (2), циклофосфан и Г-КСФ в дозе 125 мкг/кг (3), циклофосфан, Г-КСФ в дозе 2 мкг/кг и имГД (4), циклофосфан, Г-КСФ в дозе 125 мкг/кг и имГД (5), (X±m)
Сроки исследова- ния, сутки	КОЕ-ГМ в костном мозге, на 105 миелокариоцитов	Незрелые нейтрофильные гранулоциты в костном мозге	Зрелые нейтрофильные гранулоциты в костном мозге	Палочкоядерные нейтрофилы периферической крови, Г/л	Сегментоядерные нейтрофилы периферической крови, Г/л
фон	5,6±0,37	1,08±0,03	4,68±0,22	0,2±0,01	2,79±0,09
3-е	1	3,4±0,21*	0	0	0	2,6±0,04
	2	3,42±0,3*	0	0	0	2,67±0,03
	3	9,4±0,37*#	0,07±0,01*	0	0,01±0,01*	2,97±0,04
	4	5,7±0,23#&	0,06±0,01*	0	0,01±0,01*	2,98±0,05
	5	17,3±0,78*#&	0,07±0,01*	0	0,01±0,01*	2,78±0,06
5-е	1	8,9±0,27*	0,05±0,01*	1,76±0,09*	0,24±0,02*	3,64±0,1*
	2	9,4±0,56*	0,04±0,01*	1,89±0,24*	0,23±0,01*	3,67±0,15*
	3	24,6±1,7*#	0,24±0,01*#	2,59±0,6*#	0,67±0,01*#	6,4±0,22*#
	4	18,4±0,6*#&	0,26±0,01*#&	2,47±0,53*#&	0,56±0,02*#&	6,37±0,34*#&
	5	32,7±0,81*#&	0,45±0,01*#&	3,67±0,54#&	0,89±0,02*#&	7,8±0,1*#&
7-е	1	6,5±0,23*	0,87±0,02*	3,98±0,2	0,37±0,01*	2,8±0,1
	2	7,1±0,45*	0,92±0,04*	4,1±0,34	0,41±0,02*	2,86±0,4
	3	14,2±0,63*#	1,97±0,03*#	6,89±0,8*#	0,98±0,02*#	6,78±0,3*#
	4	18,7±0,5*#&	2,14±0,02*#&	6,91±0,74*#&	0,97±0,02*#&	6,65±0,33*#&
	5	25,7±0,3*#&	2,87±0,04*#&	8,1±0,9*#&	1,2±0,03*#&	9,64±0,17*#&
* - Отмечена достоверность различия показателя от его значения у интактных животных при p 0,05;
# - Отмечена достоверность различия показателя от его значения у контрольных животных (циклофосфан) при p 0,05;
& - Отмечена достоверность различия показателя у животных, получавших совместно Г-КСФ и имГД, от значений аналогичных показателей у мышей, которым вводили только Г-КСФ в соответствующей дозе, при p 0,05.

Совместное применение иммобилизированной гиалуронидазы и Г-КСФ в дозе 125 мкг/кг приводило к существенно более выраженным изменениям со стороны грануломоноцитопоэза. ИмГД усиливала специфическое действие Г-КСФ на КОЕ-ГМ, что приводило к более значительному повышению количества предшественников и морфологически распознаваемых элементов гранулоцитарного ряда в костном мозге: незрелых нейтрофильных гранулоцитов на 87,5%, а зрелых нейтрофильных гранулоцитов на 41,7% на 5 сут опыта относительно группы животных, которые получали только 125 мкг/кг Г-КСФ. При этом указанные изменения приводили и к более существенному возрастанию числа нейтрофилов в периферической крови.

Кроме того, дополнительное применение имГД сопровождалось значительной активацией грануломоноцитопоэза в случае использования Г-КСФ в дозе 2 мкг/кг. При этом наблюдалось статистически значимое повышение величин всех исследуемых показателей по сравнению как с цитостатическим контролем, так и относительно соответствующих показателей у мышей, которым вводили только Г-КСФ в дозе 2 мкг/кг (табл.4).

Полученные результаты указывают на значительное повышение гранулоцитопоэзстимулирующей активности у препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора под действием имГД. При этом данные эксперимента свидетельствуют о возможности использования имГД в качестве средства для снижения эффективной терапевтической дозы лекарственных средств.

Пример 5.

Изучение способности иммобилизированной гиалуронидазы усиливать терапевтическую активность антикоагулянтов

Эксперименты проводились на интактных мышах линии CBA/CaLac.

Опытным животным однократно внутривенно вводили гепарин (ОАО «Синтез») в дозе 200 ЕД/кг, либо гепарин совместно с «Лидаза» (ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ) (внутрибрюшинно) в дозе 10 ЕД/кг, либо гепарин совместно с иммобилизированной гиалуронидазой (внутрибрюшинно) в дозе 1 ЕД/кг. Через 1 час изучали активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) и тромбиновое время (ТВ). Доза гепарина выбрана в предварительных экспериментах как доза, при которой используемые методы считаются не чувствительными (АЧТВ увеличивается менее чем в 2, а ТВ менее чем в 4 раза [10]).

В ходе эксперимента введение низкой дозы гепарина не приводило к значимым изменениям времени свертывания плазмы в тесте АЧТВ и ТВ (табл.5) и составляло соответственно 45,7±1,4 и 34,2±0,87 сек. Существенных изменений также не регистрировалось при использовании указанной дозы (1 ЕД/кг) имГД и совместном применении гепарина со стандартным препаратом гиалуронидазы («Лидаза»).

Таблица 5
Показатели гемостаза у животных, которым вводили гепарин (1), иммобилизированную гиалуронидазу (2), гепарин совместно с лидазой (3) и гепарин совместно с иммобилизированной гиалуронидазой (4), (X±m)
Сроки исследования, сутки	АЧТВ, сек	ТВ, сек
фон	28,65±1,23	19,4±0,7
1 час	1	45,7±1,4	34,2±0,87
	2	31,57±0,98	25,4±0,3
	3	46,1±1,73	33,6±0,54
	4	81,7±0,69	56,9±0,48

В то же время у животных, которым помимо гепарина вводили имГД, наблюдалось достоверное увеличение обоих показателей, отражающих состояние системы гемостаза (табл.5). При этом АЧТВ составляло 81,7±0,69, а ТВ 56,9±0,48.

Исходя из результатов исследования следует, что дополнительное использование препарата имГД на фоне введения низких доз гепарина приводит к значительному повышению степени его антикоагулянтной активности.

Пример 6.

Исследование влияния иммобилизированной гиалуронидазы на специфическую активность иммуномодуляторов

В исследовании были использованы 240 мышей-самцов линии CBA/CaLac. Экспериментальным животным вводили реаферон-ЕС-липинт (ЗАО «ВЕКТОР-МЕДИКА») внутрибрюшинно в течение 5-ти суток в дозе (185715 МЕ/кг) в объеме 0,2 мл стерильного физиологического раствора, либо реаферон-ЕС-липинт (ЗАО «ВЕКТОР-МЕДИКА») совместно с иммобилизированной гиалуронидазой (внутрибрюшинно) в дозе 10 ЕД/кг, контрольные животные получали в эквивалентном объеме растворитель (физиологический раствор). При этом используемая доза реаферон-ЕС-липинта в предварительных экспериментах была определена как максимально эффективная.

Изучали влияния препаратов на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов, общее количество спленоцитов, атителобразующих клеток, содержание IgM, IgG. При этом при исследовании фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов в качестве фона использовали интактных животных соответствующего пола и возраста. При исследовании влияния препаратов на гуморальный иммунный ответ (на 4-е сут) в качестве фона использовали мышей, получивших антиген, но без курсового введения физиологического раствора [10].

В ходе эксперимента было обнаружено, что применение имГД значительно повышало клеточный иммунный ответ: фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов экспериментальных животных (ФЧ) по сравнению с контролем (реафероном-ЕС-липинт). У мышей, получавших оба препарата, отмечалось не только достоверное повышение среднего количества поглощенных одной клеткой бактерий, но и увеличение доли активных перитонеальных макрофагов (ФИ) (табл.6).

Иммобилизированная гиалуронидаза усиливала также влияние иммуномодулятора на гуморальный иммунный ответ. В данной группе животных также имело место и было более значительное увеличение числа спленоцитов после иммунизации, а также относительного и абсолютного количества антителообразующих клеток в селезенках. Кроме этого в этой группе отмечалось значительное повышение титров IgM, IgG и суммарных антител в сыворотке крови по сравнению с группой животных с применением реаферона-ЕС-липинт (табл.7).

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что дополнительное применение иммобилизированной гиалуронидазы способно значительно усиливать стимуляцию клеточного и гуморального иммунного ответа иммунотропных препаратов (в частности, реаферона-ЕС-липинт).

Таблица 6
Влияние препаратов на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей линии CBA/CaLac
Показатели	Фон	Контроль	РФН-ЕС-л	РФН-ЕС-л+имГД
ФИ, %	22,50±0,92	25,0±1,37	21,83±0,87	73,50±0,96*#
ФЧ	2,54±0,26	5,15±0,44*	4,53±0,25*	20,82±1,38*#
* Отмечена достоверность различия показателя от его значения у интактных животных при p 0,05;
# Отмечена достоверность различия показателя от его значения у животных, получавших только реаферона-ЕС-липинт при p 0,05.

Таблица 7
Влияние препаратов на показатели гуморального иммунного ответа мышей линии CBA/CaLac после иммунизации, (X±m)
Показатели	Фон	Контроль	РФН-ЕС-л	РФН-ЕС-л+имГД
Общее количество спленоцитов, ×106	193,40±2,89	204,0±3,05*	213,0±5,44*	344,83±2,11*#
Антителообразующие клетки, %	11,92±0,28	15,30±0,30*	14,23±0,34*	35,80±0,87*#
Антителообразующие клетки, ×106	23,08±0,88	32,86±1,52*	30,36±1,28*	48,77±3,02*#
IgM, log2T	2,80±0,37	2,80±0,37	4,60±0,40*	12,0±0,71*#
IgG, log 2T	7,80±0,58	7,0±0,55	5,20±0,20*	11,20±0,58#
IgM+IgG, log2T	10,60±0,60	9,80±0,73	9,80±0,37	17,20±0,20#
* Отмечена достоверность различия показателя от его значения у интактных животных при p 0,05;
# Отмечена достоверность различия показателя от его значения у животных, получавших только реаферона-ЕС-липинт при p 0,05.

В целом, полученные данные свидетельствуют о выраженной потенцирующей способности иммобилизированной гиалуронидазы в отношении действия различных биологически активных веществ (гормонов, факторов роста, цитокинов и др.), в том числе эндогенных, а также лекарственных препаратов разных фармакологических групп, позволяющей значительно снижать их эффективные терапевтические дозы. При этом механизмом усиления эффектов биологически активных веществ и фармакологических средств является непосредственное влияние средства на клеточные структуры (рецепторы, биологические мембраны и др.) либо гуморальные факторы регуляции, ответственные за выполнение определенных функций. Причем способность имГД потенцировать действие эндогенных регуляторов физиологических функций, очевидно, можно рассматривать как повышение под ее влиянием эффективности регуляторного воздействия биологически активных веществ и оптимизации их обмена.

Литература

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 15 изд. перераб., испр. и доп. - М.: ООО «Издательство Новая волна», 2005. - С.717.

2. Эпштейн О.И., Штарк М.Б., Дыгай A.M. и др. Фармакология сверхмалых доз антител к эндогенным регуляторам функций. - М.: Изд-во РАМН, 2005. - 224 с.

3. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. - 2009. - № 11. - С.7-10.

4. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. и др. Роль гиалуронидазы в регуляции функций мезенхимальных клеток-предшественников // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007. - № 2. - С.115-119.

5. Noble P.W. Hyaluronan and its catabolic products in tissue injury and repair // Matrix Biol. - 2002. - № 21. - P.25-29.

6. Stern R. Devising a pathway for hyaluronan catabolism: are we there yet? // Glycobiology. - 2003. - Vol.13. - № 12. - P.105-115.

7. Henry C.B., Duling, B.R. Permeation of the luminal capillary glycocalyx is determined by hyaluronan // Am. J. Physiol. - 1999. - № 277. - P.508-514.

8. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.

9. Ермакова Н.Н., Жданов В.В., Дыгай A.M. и др. Механизмы влияния сверхмалых доз антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору на восстановление поврежденной ткани поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2009. - Том 148. - Приложение. - С.190-194.

10. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред Р.У.Хабриева. - 2 изд. - М.: ОАО «Изд-во «Медицина», 2005. - С.466-471.