циклический нонапептид, обладающий способностью ингибировать киназу легких цепей миозина

Формула изобретения

Пептид цикло [-Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-].

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к биологически активным пептидам, способным ингибировать киназу легких цепей миозина и тем самым предотвращать повышение проницаемости сосудистого эндотелия, и может найти применение в медицине в качестве противоотечного средства.

Отек жизненно важных органов (легких, мозга и др.) является грозным осложнением различных патологических состояний, с которым нередко сталкиваются врачи-кардиологи, инфекционисты, токсикологи, нейрохирурги, специалисты в области военно-полевой медицины и медицины катастроф. Развитие отека легких является показанием к преждевременной отмене агрессивной терапии у некоторых групп онкологических больных. Отек тканей является отрицательным побочным действием терапевтического ангиогенеза с помощью фактора роста сосудистого эндотелия, приводящего к образованию т.н. «текущих» капилляров.

Несмотря на достижения в медицинских технологиях смертность от острого отека легких в России и развитых странах мира остается высокой, что связано, в частности, с отсутствием эффективных противоотечных препаратов. Сегодня арсенал врача ограничен диуретиками - веществами, улучшающими выведение жидкости из организма через почки, кристаллоидами, повышающими внутрисосудистое осмотическое давление, и стероидными гормонами. Эти соединения не воздействуют на основное патогенетическое звено в развитии отека - на эндотелиальную выстилку микрососудов.

По современным представлениям, для эффективной борьбы с развитием острого отека и постишемическим повреждением ткани необходимо ослабить сократительную реакцию микрососудистого эндотелия, воздействуя на критические звенья этого процесса, а именно на основной моторный белок эндотелия немышечный миозин II типа и/или на его активаторы. Ключевым активатором миозина II типа в эндотелиальных и других клетках является киназа легких цепей миозина (КЛЦМ, КФ 2.7.11.17). КЛЦМ вовлечена в регуляцию различных двигательных реакций, таких как сокращение гладких мышц, подвижность нейтрофилов, фибробластов, проницаемость эндотелиальных и эпителиальных монослоев. Ингибиторы КЛЦМ снижают клеточную подвижность и поэтому могут быть использованы в медицине при ряде патологических состояний, в частности как средство для снижения повышенной проницаемости эндотелия микрососудов и предотвращения острого отека жизненно важных органов [1].

Однако большинство из синтезированных ранее ингибиторов КЛЦМ не подходит для применения у человека по причине низкой специфичности, следствием которой может быть возникновение серьезных побочных эффектов. В связи с этим поиск высокоспецифичных ингибиторов КЛЦМ весьма актуален.

Одним из таких соединений является низкомолекулярный ингибитор на основе аминопирадазина [2-4]. В последние годы в мире разрабатываются пептидные ингибиторы КЛЦМ, влияющие на проницаемость кишечного эпителия в эксперименте и не обладающие выраженной токсичностью [5]. Известен нонапептид - производное последовательности автоингибиторного участка КЛЦМ H-Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-NH₂ (L-ПИК) [6, 7]. Этот пептид in vitro способен оказывать влияние на проницаемость клеток кишечного эпителия [7]. Однако в силу особенностей его химической структуры он чрезвычайно подвержен действию протеолитических ферментов и поэтому вряд ли способен проявлять активность in vivo и не может претендовать на использование в практической медицине. Известен также амид нонапептида формулы H-(N -Me)-Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-NH₂ [8, 9] (выбранный прототипом), способный in vitro предотвращать острое повышение проницаемости сосудистого эндотелия. Этот пептид более устойчив к действию протеолитических ферментов, чем L-ПИК, так как содержит в N-концевой части остаток N -метиларгинина, что повышает его устойчивость к действию аминопептидаз. Однако следует отметить, что синтез N-метилированных аналогов аминокислот вообще, а производных аргинина в особенности, является многостадийным, трудоемким и дорогостоящим процессом, что существенно удорожает подобные соединения [10].

Задачей изобретения является поиск соединений, которые бы обладали выраженной способностью ингибировать киназу легких цепей миозина и тем самым регулировать изменение проницаемости сосудистого эндотелия, а также технологически были более доступны, что в дальнейшем, с большей вероятностью, позволит обеспечить отечественную практическую медицину эффективными препаратами противоотечного действия.

Поставленная задача решается путем синтеза циклического нонапептида формулы

цикло[-Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-].

Поскольку в ряду пептидных аналогов не существует четкой взаимосвязи структура - активность, способность выбранного соединения ингибировать киназу легких цепей миозина не является очевидной. Заявляемый пептид получали твердофазным методом пептидного синтеза с использованием Fmoc-технологии, затем проводили его циклизацию, соединяя амидной связью, «голова к хвосту», N- и С-концевую аминокислоты способом, описанным ниже в примере 1.

Пример 1. Синтез заявляемого пептида

цикло[-Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-] (I)

Список сокращений:

АсОН - уксусная кислота;

Boc - трет-бутилоксикарбонил;

ВОР - гексафторфосфат O-(бензотриазол-1-ил)-трис-диметиламино)фосфония;

Bu^t - трет-бутил;

DIC - N,N'-диизопропилкарбодиимид;

DIPEA - N,N-диизопропилэтиламин;

DCM - дихлорметан;

Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил;

HOBt - 1-гидроксибензотриазол;

Me - метил;

Mops - 3-[N-морфолино]пропансульфоновая кислота;

NMP - N-метилпирролидон;

Pip - пиперидин;

Pmc - 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил;

TIBS - триизобутилсилан;

TFA - трифторуксусная кислота;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ДТТ - дитиотреитол;

КЛЦМ - киназа легких цепей миозина;

РЛЦ - регуляторные легкие цепи миозина;

ЭГТА - этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты.

В работе использованы производные L-аминокислот (Bachem, Швейцария), DIC, DIPEA, HOBt, TIBS (Fluka, Швейцария). Для синтеза применяли N-метилпирролидон, дихлорметан, пиперидин, метанол и TFA (Applied Biosystems GmbH, Германия). Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе (Gilson, Франция), использовали колонку Nucleosil 100 С18, 5 мкм (4.6×250 мм) (Sigma, США), в качестве элюентов использовали буфер А - 0.1% TFA, буфер Б - 80% ацетонитрила в буфере А, элюция градиентом концентрации буфера Б в буфере А от 0% до 60% за 30 мин. Скорость потока 1 мл/мин, детекция при 220 нм. Для тонкослойной хроматографии использовали пластики с силикагелем фирмы Merck (Германия) и хроматографические системы хлороформ - МеОН - АсОН (90:10:5) (система 1) и хлороформ - МеОН - 32% АсОН (15:4:1) (система 2). Для проявления хроматограмм использовали раствор нингидрина и хлор-бензидиновый реактив. Структура полученных пептидов доказана спектрами ¹Н-ЯМР и данными масс-спектрометрии. Масс-спектры получали на масс-спектрометре с времяпролетной базой VISION 2000 (Termobioanalsis corp., Finnigan, США), снабженном импульсным азотным лазером класса 3В с длиной волны излучения 337 нм, методом MALDI с использованием 2,4,6-тригидроксиацетофеноновой матрицы.

Полузащищенный линейный предшественник нонапептида Н-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bu^t)-Lys(Boc)-Tyr(Bu ^t)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-OH (II) был получен автоматическим твердофазным методом. Для твердофазного синтеза использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола с 2-хлортритил-хлоридной - якорной группой (2-Clorotrityl chloride resin) фирмы Iris Biothech (Германия), предназначенный для получения защищенных пептидов со свободной карбоксильной группой, содержащий 1.56 ммоль Cl/г полимера. Стартовую аминокислоту - Fmoc-Lys(Boc)-OH присоединяли к полимерному носителю путем двукратной обработки (2 раза в течение 1 ч) соответствующей диизопропилэтиламмониевой солью аминокислоты в дихлорметане [11]. Остаточный хлор отщепляли обработкой аминоацилполимера 10% раствором DIPEA в метаноле (2 раза по 1 мин), затем аминоацилполимер последовательно промывали DMF (3×1 мин), i-PrOH (3×1 мин), DMF (3×1 мин), МеОН (3×1 мин), DCM (3×1 мин) и сушили. Степень замещения полимера-носителя стартовой аминокислотой, определенная спектрофотометрически [12], составила - 0.42 ммоль аминокислоты/г аминоацилполимера. Синтез нонапептида проводили с С-конца, ступенчато (присоединяя по одной аминокислоте), исходя из 0.43 г (0.25 ммоль) Fmoc-Lys(Вос)-полимера. Последующие 8 циклов синтеза проводили в автоматическом режиме на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 431А по стандартной программе для однократной конденсации Fmoc-аминокислот. Для блокирования гуанидиновых групп остатков аргинина использовали Pmc-защиту, для -аминогрупп лизина - Вос-защиту, а для гидроксильных групп тирозина - трет-бутильную-защиту. Для отщепления Fmoc-защит применяли 25% раствор 4-метилпиперидина в NMP (См. протокол твердофазного синтеза).

Протокол твердофазного синтеза
№	Операция	Реагент	Время обработки
Циклы 1-8
1	Промывка	5×NMP	3 мин
2	Деблокирование б-аминогрупп	25% 4-MePip/NMP	10 мин
3	Промывка	5×NMP	3 мин
4	Активация	1 ммоль Fmoc-AA+1 ммоль HOBt+1 ммоль DIC в NMP	20 мин
5	Конденсация	1 ммоль активированного производного Fmoc-AA в NMP	90 мин
6	Промывка	5×NMP	3 мин

Для контроля качества синтезированного линейного предшественника нонапептида проба пептидил-полимера (50 мг) была полностью деблокирована последовательной обработкой 1) 25% раствором 4-MePip/NMP для удаления Fmoc-группы, 2) TFA со скевенджерами для отщепления всех остальных защит и полимерного носителя. Полученный продукт H-Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-OH судя по данным аналитической ВЭЖХ содержал 94.6% целевого вещества (R_t - 8.7 мин, колонка Kromasil 4.6×25 мм, 5 мкм, детекция при 220 нм; буфер А - 0.1% водная TFA, буфер Б - 80% ацетонитрил; градиент - от 10 до 70% буфера Б за 30 мин).

Для получения защищенного нонапептида Fmoc-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bu ^t)-Lys(Boc)-Tyr(Bu^t)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-OH (III) 0.74 г (0.14 ммоль) нонапептидилполимера обрабатывали смесью 1 мл уксусной кислоты и 2 мл трифторэтанола в 7 мл DCM в течение 1 ч. (В этих условиях все защиты боковых цепей аминокислот устойчивы, расщепляется наиболее кислотолабильная связь пептид - полимер.) Полимер отфильтровывали, промывали деблокирующей смесью и DCM, фильтрат упаривали, продукт осаждали диэтиловым эфиром. Осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром и сушили. Получено 0.33 г (82%) защищенного нонапептида (III). R_f 0.48 (система 1); 0.9 (система 2).

Для получения линейного предшественника нонапептида H-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bu ^t)-Lys(Boc)-Tyr(Bu^t)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-ОН (II) 0.33 защищенного пептида (III) обрабатывали 5 мл 50% раствора морфолина в DMF в течение 1 ч, реакционную смесь упаривали, продукт осаждали эфиром. Осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром и сушили. Получено 0.29 г (80% на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимеру). R_f 0.31 (система 1).

Для циклизации 0.093 г (0.035 ммоль) линейного нонапептида (II) растворяли в 100 мл DMF, прибавляли 0.011 г (0.07 ммоль) HOBt, 0.031 г (0.07 ммоль) реагента Кастро - ВОР [13] и 0.03 мл (0.15 ммоль) DIPEA. Для контроля происходящих превращений применяли ТСХ. Через 1 ч реакционную смесь упаривали, продукт осаждали эфиром. Осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром и сушили. Получено 80 мг (87%) защищенного циклического нонапептида, R_f 0.50 (система 1).

Заключительное деблокирование циклического нонапептида проводили путем обработки соответствующего защищенного продукта смесью 10 мл TFA, 0.25 мл деионизованной воды и 0.25 мл TIBS в течение 16 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой эфир. Осадок отфильтровывали, промывали DCM (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Сырой продукт твердофазного синтеза (0.036 г) с содержанием основного вещества 86% очищали с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе Beckman (США), используя колонку Диасорб - С16 130Т (2.5×250 мм), размер частиц сорбента 10 мкм. В качестве элюентов использовали буфер А - 0.1% раствор TFA и буфер Б - 80% ацетонитрила в воде. Элюцию проводили градиентом 0.5% в минуту буфера Б в буфере А от 100% буфера А со скоростью 10 мл/мин. Пептиды детектировали при длине волны 220 нм. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли, ацетонитрил упаривали и лиофилизовали. В итоге получили 0.026 г (56.8%) циклического нонапептида (I). Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 93.1%. Масс-спектр: 1307.5 [М+Н]⁺, 1329.5 [M+Na]⁺ , 1345.5 [M+K]⁺, вычислено для C₆₀H ₁₀₃N₂₃O₁₀: 1306.6.

Пример 2. Фосфорилирование регуляторных легких цепей миозина КЛЦМ в присутствии пептида I in vitro.

Влияние пептида I на фосфорилирование регуляторных легких цепей (РЛЦ) миозина гладких мышц in vitro проверяли, анализируя динамику включения фосфата в серин-19 РЛЦ по интенсивности связывания РЛЦ с соответствующими фосфоспецифическими антителами методом дот-блот (фиг.1А, 2А). КЛЦМ и РЛЦ были выделены из мускульного желудка кур, а белок кальмодулин - из мозга быка. Фосфорилирование проводили в реакционной смеси следующего состава: 100 мМ NaCl, 1 мМ дитиотрейтола, 1 мМ MgCl₂, 0.5 мМ CaCl₂ , 0.3 µМ кальмодулина, 5 нМ КЛЦМ, 20 µM РЛЦ, 10 мМ MOPS при температуре 30°С. Пептиды использовали в концентрации 5 µМ. Реакцию инициировали внесением в пробу раствора Mg ²⁺-АТФ до конечной концентрации 0.5 мМ. Пробы отбирали в течение 20 мин после начала реакции. Реакцию останавливали внесением пробы в 15 мМ раствор EGTA. Уровень фосфорилирования РЛЦ определяли методом дот-блот. Пробы с исследуемыми белками (2 µл) наносили на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, США) в виде капли, фиксировали в течение 10 минут 0.25% глутаровым альдегидом и инкубировали в 5% растворе обезжиренного молока в TBS в течение 40 мин. Затем последовательно инкубировали мембраны с мышиными антителами против монофосфорилированной формы РЛЦ (Cell Signaling Technology, США) в разведении 1:1200 и затем 1 ч со вторичными антителами против IgG мыши, конъюгированными с пероксидазой, в разведении 1:25000. После каждой стадии проводили отмывку мембран в растворе TBST 3 раза по 5 минут. Образовавшиеся иммунные комплексы идентифицировали методом ECL с помощью растворов фирмы Pierce (США). В предварительных экспериментах с помощью окрашивания мембран антителами к РЛЦ (Proteintech Group, Inc., США) была подтверждена одинаковая нагрузка всех образцов по общему количеству РЛЦ. Полученное изображение на рентгеновской пленке Retina (Германия) сканировали и обсчитывали в программе ImageJ (США). Данные обрабатывали в программе Excel и строили график зависимости величины сигнала (отн. ед.) от времени реакции. Сравнение ингибиторных эффектов пептидов проводили по величинам сигналов на десятой минуте реакции.

На фигуре 1А представлены экспериментальные данные по фосфорилированию регуляторных легких цепей миозина КЛЦМ в присутствии пептида I и L-PIK в сравнении с двумя контролями - фосфорилированием РЛЦ в отсутствие пептида и в присутствии смеси аминокислот, из которых состоят вышеназванные пептиды, взятых в соответствующих молярных концентрациях. Видно, что в контрольных реакциях фосфорилированные РЛЦ выявляются антителами уже на 1.5 минутах реакции, и к 5 минутам реакция заканчивается, поскольку на более поздних сроках изменения плотности окраски нанесенных капель реакционной смеси не происходит. В то же время в присутствии пептида I окрашивание развивается, начиная с 5 мин, и не достигает интенсивности окрашивания в контроле к концу эксперимента (20 мин). В присутствии L-PIK окрашивание мембраны не детектируется в течение всего времени эксперимента. Оцифрованные данные этого эксперимента представлены на фигуре 1Б, из которой следует, что на 5 мин пептид I ингибирует реакцию фосфорилирования РЛЦ КЛЦМ на 92.5%, на 10 мин - на 90% и на 20 мин - на 85%, а L-PIK ингибирует КЛЦМ на 100% в течение всего времени эксперимента. Этот эксперимент повторяли два раза со сходным результатом - пептид I практически полностью ингибировал каталитическую активность КЛЦМ in vitro.

На фигуре 2А представлены результаты точно такого же опыта, как тот, который показан на фигуре 1, где в качестве ингибиторных пептидов использовали прототип заявляемого пептида I - [N MeArg¹]-L-PIK и L-PIK. В этом эксперименте контрольная реакция фосфорилирования РЛЦ КЛЦМ также завершалась к 5 мин, а в присутствии [N MeArg¹]-L-PIK и L-PIK фосфорилирования РЛЦ не происходило в течение 20 мин эксперимента. Таким образом, активность КЛЦМ была полностью ингибирована. Оцифрованные результаты этого эксперимента представлены в виде графика на фигуре 2Б. Видно, что в присутствии [N MeArg¹]-L-PIK и L-PIK достигается 95-100% ингибирование КЛЦМ. Опыт, представленный на фигуре 2Б, повторяли три раза со сходным результатом: [N MeArg¹]-L-PIK и L-PIK практически полностью подавляли каталитическую активность КЛЦМ in vitro.

Поскольку оба эксперимента были проведены в одинаковых условиях и в обоих случаях одним из исследуемых пептидов был L-PIK, результаты этих экспериментов можно сравнивать между собой. Из сравнения следует, что заявляемый пептид и прототип проявляют ингибиторные свойства практически в равной степени. Следовательно, in vitro и заявляемый пептид (I), и L-PIK, и прототип [N MeArg¹]-L-PIK обладают высокой и равноценной ингибиторной активностью. И хотя в описанных опытах L-PIK полностью подавляет активность КЛЦМ in vitro, он быстро теряет свою ингибиторную активность in vivo в присутствии протеолитических ферментов [14]. Циклизация пептидов является общепризнанным методом ограничения стерической подвижности молекулы и повышения ее устойчивости к деградации пептидазами [15], однако не гарантирует сохранения биологической активности, присущей соответствующему линейному пептиду. Поскольку циклический пептид I сохраняет активность линейного предшественника, он должен быть более эффективным, чем L-PIK и [N MeArg¹]-L-PIK, ингибитором КЛЦМ в биологических системах, где присутствуют протеолитические ферменты, например, при его введении в кровоток, желудочно-кишечный тракт, легкие.

Заявляемый пептид нетоксичен, поскольку является аналогом эндогенного фрагмента автоингибиторного участка КЛЦМ и состоит из остатков природных аминокислот, которые обычно присутствуют в организме.

Список литературы

1. Ширинский В.П. Роль киназы легких цепей миозина в барьерной функции эндотелия и перспективы использования ее ингибиторов при нарушении сосудистой проницаемости. Кардиологический Вестник. 2006. 2, с.39-42.

2. Behanna H.A., Watterson D.M., Ranaivo H.R. Development of a novel bioavailable inhibitor of the calmodulin-regulated protein kinase MLCK: a lead compound that attenuates vascular leak. Biochim. Biophys. Acta. 2006. 1763 (11): 1266-1274.

3. Rossi J.L., Velentza A.V., Steinhorn D.M., Watterson D.M., Wainwright M.S. MLCK210 gene knockout or kinase inhibition preserves lung function following endotoxin-induced lung injury in mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2007. 292 (6): L1327-1334.

4. Wainwright M.S., Rossi J., Schavocky J., Crawford S., Steinhorn D., Velentza A.V., Zasadzki M., Shirinsky V., Jia Y., Haiech J., Van Eldik L.J., Watterson D.M. Protein kinase involved in lung injury susceptibility: evidence from enzyme isoform genetic knockout and in vivo inhibitor treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. 100 (10): 6233-6238.

5. Clayburgh D.R., Barrett T.A., Tang Y., Meddings J.B., Van Eldik L.J., Watterson D.M., Clarke L.L., Mrsny R.J., Turner J.R. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 2005. 115 (10): 2702-2715.

6. Lukas T.J., Mirzoeva S & al. J.Med. Chem. 1999. V.42. P.910-919.

7. Zolotarevsky Y., Hecht G., Kuotsouris A., Gonzalez D.E., Quan С., Тоm J., Mrsny R.J., Turner J.R. A membrane-permeant peptide that inhibit MLC kinase restores barrier function in vitro models of intestinal disease. Gastroenterology 2002. 123, p.163-172.

8. Беспалова Ж.Д, Бушуев В.Н., Куликова Т.Г., Марченко А.В., Молокоедов А.С., Секридова А.В., Сидорова М.В., Степанова О.В., Ширинский В.П. Амид нонапептида, обладающий способностью предотвращать повышение проницаемости эндотелия сосудов. Положительное решение от 05.05.2010 по патентной заявке 2009116126.

9. Марченко А.В., Степанова О.В., Секридова А.В., Сидорова М.В., Бушуев В.Н., Беспалова Ж.Д., Ширинский В.П. Новые пептидные ингибиторы киназы легких цепей миозина подавляют гиперпроницаемость эндотелия сосудов. Биофизика, в печати.

10. Хuе Chu-Biao, DeGrado W.F. Novel synthesis of N -methyl-arginine and N -methyl-ornithine derivatives. Tetrahedron Lett. 1995. V.36, N 1, p.55-58.

11. Barlos К., Chatzi O., Gatos D., Stavropoulos G. Studies on anchoring of Fmoc-amino acids and peptide cleavage. Int. J. Peptide&Protein Res. 1991. V.37, N 6, p.5130-520.

12. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A practical approach / Ed. W.C.Chan, P.D.White. Oxford University Press. 2000.

13. Castro В., Dormoy J.R., Evin G., Selve C. Tetrahedron Lett. 1975. V.14. P.1219-1222.

14. Секридова А.В., Сидорова М.В., Азьмуко А.А., Молокоедов А.С., Бушуев В.Н., Марченко А.В., Щербакова О.В., Ширинский В.П., Беспалова Ж.Д. Пептидные ингибиторы киназы легких цепей миозина, устойчивые к действию пептидаз. Биоорганическая химия. 2010. Т.36. № 4, с.498-504.

15. Moore M.L., Grant G.A. Peptide design consideration In: Synthetic peptides / A user's guide. Second edition. Ed. By G.A.Grant. New York Oxford University Press 2002. P.10-92.

15. Х.Д.Якубке, X.Ешкайт. Аминокислоты, пептиды, белки. Пер. с нем. под ред. Ю.В.Митина. М.: Мир. 1985.