способ лиофильной сушки эритроцитарного диагностикума

Формула изобретения

Способ лиофильной сушки эритроцитарного диагностикума, включающий глубокое замораживание препарата, перемещение в камеру для лиофилизации и его дальнейшую сублимацию в условиях вакуума с последующим формированием лиофилизата, отличающийся тем, что на подготовительной стадии после осаждения методом центрифугирования, отделения супернатанта эритроциты разбавляются в соотношении 1:9 средой высушивания, состоящей из раствора реополиглюкина 15 мас.%, сахарозы 7,5 мас.% в дистиллированной воде, а температура полки и давление в камере для сублимации не изменяются первые 8 ч и составляют соответственно 15°С и 30 Pa, затем в течение последующих 14 ч плавно меняются соответственно со скоростью (2,6±0,4)°С/ч и (2±0,1) Ра/ч до 22°С и 3 Pa и при указанных параметрах выдерживается не менее 3 ч.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к способам лиофильного высушивания медицинских иммунобиологических и диагностических препаратов, которые должны сохранять свою иммунохимическую или биологическую активность длительное время после высушивания. Изобретение может найти свое применение в области биологической химии, иммунодиагностики и фармацевтики.

Как правило, высокая биологическая активность эритроцитарных препаратов и лекарственных средств обусловлена тонкими и сложными структурами белков, углеводов и других веществ, которые определяют биохимическую или иммунологическую активность препарата. При сушке структура белков может меняться, происходят необратимые изменения, которые влияют на активность препаратов вплоть до полной потери первоначальных свойств.

Объекты изобретения были выбраны не случайно, т.к. именно эритроцитарные диагностикумы относятся к препаратам, наиболее чувствительным к лиофильной сушке, и любые, даже незначительные отклонения от оптимального режима сублимации вызывают их частичную (на 2-3 лунки и более) потерю активности или даже полную непригодность из-за появления спонтанной агглютинации эритроцитов в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Об этом же свидетельствует тот факт, что, несмотря на многочисленные изыскания, до сих пор не найден способ лиофилизации донорской крови (основа которой - эритроциты), позволяющий полноценно использовать ее после регидратации.

В качестве объектов лиофилизации были выбраны диагностикумы: эритроцитарный сапной и мелиоидозный иммуноглобулиновый производства ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ Роспотребнадзора, препарат весьма лабильный и склонный к снижению активности после лиофилизации из-за наличия нестойкой связи сывороточных иммуноглобулинов с поверхностью эритроцитов и особенностей структуры клетки самого эритроцита, а также диагностикум эритроцитарный мелиоидозный антигенный экспериментальные серии той же организации.

Лиофилизация относится к одному из наиболее щадящих способов сушки биологически активных веществ и применяется на заключительных стадиях производства различных продуктов иммунохимии и фармацевтики. Этот технологический этап позволяет стабилизировать свойства препарата и многократно увеличить срок его хранения. Однако подбор параметров лиофилизации в каждом конкретном случае является сложной технологической задачей. Поскольку процесс связан с изменением агрегатного состояния препарата, он напрямую влияет на иммунохимическую и биологическую активность после регидратации препарата и стабильность его свойств при длительном хранении.

Авторы полагают, что предложенное изобретение позволит проводить лиофильную сушку широкого класса иммунобиологических препаратов с высокой и средней лабильностью иммунохимических свойств.

Известен способ лиофилизации, при котором подогрев полок в рабочей камере начинается со 2 часа сушки при неизменной температуре +50°С и максимальной величине вакуума, определяемой типом используемого насоса. Этот способ применяется в основном для лиофилизации пищевых продуктов и непригоден для иммунобиологических препаратов из-за резких перепадов температуры продукта и потери его активности (1).

Известен способ лиофилизации (2), при котором давление остается постоянным на протяжении всей сушки и составляет 3·10^-2 мм рт.ст. при температуре плавления сухого льда в течение 18 ч. Недостатки - метод требует наличия сухого льда и длительного времени досушивания препарата после окончания основной сушки.

Известен способ лиофильной сушки биопрепарата путем введения в раствор биопрепарата перед сушкой защитной среды для создания преимущественно аморфно-кристаллической структуры при последующем замораживании [3]. Является наиболее близким к заявляемому способу - прототип. Описан процесс обезвоживания биопрепарата, в котором сушка проводится при неизменной температуре полки -40°С в течение 20 ч, а нагревание полки включается только на этапе досушивания, при этом скорость нагревания составляет 4-6°С/ч. Недостатком такого способа является наличие в защитной среде солей натрия, калия или глицина, которые запредельно снижают температуру эвтектики (коллапса) препарата (до -45°С), что заставляет вести основную сушку при пониженных температурах (-40°С), и необходимость дополнительного сложного и дорогого термического, или рентгено-фазового анализа для подбора вещества - наполнителя (смеси компонентов) с требуемой температурой замерзания в составе жидкой фазы биопрепарата, а также необходимость проведения дополнительных пробных лиофильных сушек материала. Кроме того, предложенный способ разработан для лиофилизации преимуществнно вирусных препаратов и не может быть использован для лабильных эритроцитарных диагностикумов.

Целью данного изобретения является разработка способа лиофилизации диагностических препаратов - эритроцитарных диагностикумов, который позволяет максимально сохранить первоначальные свойства и биологическую активность высушенного продукта.

Для реализации поставленной цели нами предложен способ лиофильной сушки эритроцитарного диагностикума, который основан на следующей совокупности признаков (необходимых операций с продуктом): на подготовительной стадии после осаждения эритроцитов методом центрифугирования и отделения супернатанта эритроциты разбавляются в соотношении 1:9 средой высушивания, состоящей из раствора реополиглюкина 15 мас.%, сахарозы 7,5 мас.% в дистиллированной воде. Концентрация и состав среды подобраны экспериментально и являются результатом предварительных научно-исследовательских работ. Отсутствие или изменение данной среды высушивания влечет снижение биологической активности препарата.

Затем препарат помещают в холодовой шкаф, где проходит глубокое замораживание препарата при температуре -(60±10)°С слоем не более 1 см в течение 18 ч, далее его перемещают в камеру для лиофилизации на 22-27 ч и проводят дальнейшую сублимацию в условиях вакуума с последующим формированием лиофилизата, который от известных способов лиофилизации отличается тем, что температура полки и давление в камере не изменяются первые 8 ч и составляют соответственно -15°С и 30 Па.

Затем, в течение последующих 14-16 ч постепенно меняется температура полки до 22°С со скоростью (2,6±0,4)°С /ч и давление до 3 Па со скоростью (2±0,1) Па/ч. При этом увеличение скорости изменения параметров снижает качественные характеристики продукта, а их уменьшение - нецелесообразно по экономическим соображениям из-за увеличения времени сушки.

Параметры лиофилизации в камере можно также задавать дискретно (ступенчато) при количестве ступеней не менее 10. При таком изменении параметров величина ступени будет соответствовать (4±3)°С по температуре и (6±5) Па по давлению. При меньшем количестве ступеней происходит скачкообразное изменение температуры препарата, что неблагоприятно сказывается на качестве высушенного продукта. Увеличение количества ступеней более 10 потребует дополнительных программных ресурсов управления сублимацией, что не всегда возможно из-за их ограничений, введенных изготовителем в конструкцию установки.

Обоснование параметров. При увеличении показателя давления в камере для сублимации выше 30 Па происходит оттаивание препарата (подгар) и теряется иммунологическая активность препарата, при уменьшении - снижается температура препарата вследствие интенсивного испарения кристаллов, из-за чего возрастает время сушки, что является нецелесообразным. При увеличении температуры полки выше -15°С также возможно оттаивание (подгар) препарата и дальнейшее скачкообразное увеличение его температуры, что снижает иммунологическую активность продукта (см. Рис.1). При уменьшении температуры полки ниже -15°С происходит увеличение времени сушки, что ухудшает экономические параметры лиофилизации.

Конечная температура лиофилизации 22°С является комнатной и установлена общепринятыми нормами. Конечное давление 3 Pa позволяет в достаточно мягких условиях и при относительно небольшом времени (около 3 ч) провести окончательную досушку препарата, не изменяя его активности, и выйти на необходимый уровень регламентированного показателя остаточной влажности препарата (потеря в массе при высушивании - не более 3 мас.%).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Сублимационная сушка диагностикума эритроцитарного сапного и мелиоидозого иммуноглобулинового. (Вариант 1 - плавное изменение параметров)

Подготовительная стадия - эритроцитарный диагностикум после этапа сенсибилизации и отмывания осаждают методом центрифугирования, отделяют супернатант и разбавляют 9 частями среды высушивания. Конечная концентрация эритроцитов 10 об.%. Среда высушивания состоит из раствора реополиглюкина - 15 мас.%, сахарозы 7,5 мас.% в дистиллированной воде.

Диагностикум разливают по 1 мл в ампулы объемом 5 мл, при этом высота слоя не превышает 1 см.

Замораживание - ампулы помещают в холодовую установку при температуре -(60±10)°С и выдерживают в течение 18 ч.

Сублимационную сушку проводят на установке «COOLSAFE - 100-9» фирмы «SCANVAC», Дания. После загрузки в камеру сразу включают вакуум и в течение первых 8 ч давление устанавливают на уровень 30 Па. Температуру полок задают на первые 8 ч сушки на уровень -15°С. Следующие 14 ч сушки температуру и давление плавно изменяют соответственно со скоростью (2,6±0,4)°С/ч и (2±0,1) Па/ч до величины 22°С и 3 Па соответственно. При указанных параметрах препарат выдерживают не менее 3 ч.

Результат: чувствительность высушенных препаратов в РНГА после сушки и регидратации практически не изменилась и составила, как и перед сушкой, 4·10 ⁵ - 8·10⁵ м.т./мл, при наличии четких контролей. Время растворения таблетки - 1 мин, форма таблетки - нормальная, потеря в массе при высушивании 2,4 мас.%. Срок хранения (наблюдаемый) 1 год. Препарат соответствует требованиям нормативной документации.

Пример 2. Лиофилизация диагностикума эритроцитарного мелиоидозного антигенного. (Вариант 2 - ступенчатое изменение параметров)

Подготовительная стадия - эритроцитарный диагностикум после этапа сенсибилизации и отмывания осаждают методом центрифугирования, отделяют супернатант и разбавляют 9 частями среды высушивания. Конечная концентрация эритроцитов 10 об.%. Среда высушивания, как в примере 1. Диагностикум разливают по 1 мл в 5 мл ампулы, при этом высота слоя не превышает 1 см.

Замораживание - ампулы помещают в холодильную камеру при температуре -(60±10)°С и выдерживают в течение 18 ч.

Лиофилизацию проводят в сублимационной установке «COOLSAFE - 100-9» фирмы «SCANVAC», Дания. После загрузки сразу включают вакуум и дальнейшую лиофилизацию ведут ступенчатым изменением режима установки - согласно таблицы 1.

Результат: иммунохимические параметры препарата до сушки и после сушки и регидратации практически не изменились. Титр гомологичной иммунной сыворотки в РНГА 1:3200 - 1:6400, время растворения таблетки - 1 мин, форма таблетки - нормальная, потеря в массе при высушивании 2,2 мас.%. Срок хранения (наблюдаемый) 1 год. Препарат соответствует требованиям нормативной документации.

Таким образом, благодаря предложенному способу можно проводить лиофильную сушку в максимально щадящих условиях, при которых практически полностью сохраняется активность высушенных эритроцитарных диагностикумов после длительного хранения и регидратации.

Литература

1. Камовников Б.П., Малков Л.С., Воскобойников В.А. Вакуум-сублимационная сушка пищевых продуктов (Основы теории, расчет и оптимизация). - М.: Агропромиздат. - 1985. - 288 с.

2. Ф.Герхардт. Методы общей бактериологии. Том 1. М.: Мир, 1984. - 1272 с.

3. Шалаев Е.Ю., Франкc Ф., Вараксин Н.А., Рукавишников М.Ю. Способ лиофильной сушки биопрепарата. Пат. RU 2111426, F26B 5/06, опубл. 20.05.1998. (Прототип)