экстракт семян fraxinus excelsior и его терапевтическое применение

Формула изобретения

1. Экстракт семян Fraxinus excelsior, способный активировать PPAR-альфа, содержащий:

от 1% до 15% по массе нуженида,

от 1% до 17% по массе GI3,

от 0,5% до 1% по массе сложного метилового эфира олеозида,

от 0,03% до 0,12% по массе эксельсида В,

от 0,1% до 1,7% по массе GI5

и от 0,08% до 0,7% по массе салидрозида,

где экстракт является водным, водно-спиртовым или спиртовым.

2. Применение экстракта семян Fraxinus excelsior по п.1 для получения средства для лечения состояния, при котором полезна активация PPAR-альфа.

3. Применение по п.2, где лечение осуществляется посредством блокирования синтеза жиров и/или обеспечения гипогликемической активности, и/или уменьшения массы тела, и/или уменьшения ожирения, и/или контроля уровней инсулина в плазме натощак, направленного против гиперинсулинемии, и/или стимуляции чувствительности к инсулину и обеспечения полезного быстрого инсулинотропного эффекта.

4. Применение по п.2, где лечение включает лечение метаболического синдрома и/или лечение сахарного диабета 2 типа, и/или предупреждение гиперинсулинемии.

5. Способ лечения субъекта, у которого присутствует состояние, при котором полезна активация PPAR-альфа, где способ включает введение экстракта семян Fraxinus excelsior по п.1.

6. Способ по п.5, где лечение осуществляется посредством блокирования синтеза жиров, и/или обеспечения гипогликемической активности, и/или уменьшения массы тела, и/или уменьшения ожирения, и/или контроля уровней инсулина в плазме натощак, направленного против гиперинсулинемии, и/или стимуляции чувствительности к инсулину и обеспечения полезного быстрого инсулинотропного эффекта.

7. Способ по п.5, где лечение включает лечение метаболического синдрома и/или лечение сахарного диабета 2 типа, и/или предупреждение гиперинсулинемии.

8. Способ по любому из пп.5-7, где субъектом является человек.

9. Способ получения экстракта семян Fraxinus excelsior по п.1, включающий экстракцию и выделение композиции из семян Fraxinus excelsior с помощью процесса, включающего:

измельчение семян Fraxinus excelsior на частицы;

контактирование измельченных частиц со смесью растворителей;

отделение измельченных частиц от смеси растворителей;

растворение порошка в спирте

и выпаривание спирта,

где температура экстракции составляет от 50°C до 70°C,

отношение растительного материала к смеси растворителей составляет от 1:1 до 1:10 в расчете на грамм на миллилитр, и

смесью растворителей является вода, смесь вода-спирт или спирт.

10. Способ по п.9, где измельченные частицы имеют диаметр от 0,1 мм до 30 мм.

11. Способ по п.9, где отношение измельченных частиц к смеси растворителей составляет от 1 грамма к 1 миллилитру до 1 грамма к 10 миллилитрам, предпочтительно, от 1 грамма к 3 миллилитрам до 1 грамма к 8 миллилитрам.

12. Способ по п.9, где измельченные частицы находятся в контакте со смесью растворителей в течение от 2 часов до 24 часов.

13. Способ по п.9, где смесь растворителей содержит этанол.

14. Способ по п.9, где смесь растворителей содержит метанол.

Описание изобретения к патенту

Предпосылки создания изобретения

Сахарный диабет 2 типа (DM-2) является распространенным по всему миру заболеванием, характеризующимся дефицитом инсулина и нечувствительностью к инсулину. DM-2 считается тяжелым, создающим проблему для здоровья заболеванием, связанным с высокой заболеваемостью и смертностью, и является шестой из основных причин смертности в США [Minino et al, 2007, National Vital Statistical Report, 55]. Ожидается, что к 2025 году число пациентов с диабетом может возрасти до 300 миллионов [King et al, 1998, Diabetes Care, 21, 1414-31]. В США 7 процентов населения - 20,8 миллионов детей и взрослых - страдают диабетом [French, 2007, Inside, 12, 46-7], и затраты в связи с медицинскими издержками и снижением производительности в США оцениваются как $132 миллиарда в 2002 [Hogan et al, 2003, Diabetes Care, 26, 917-32]. Способы лечения DM-2 включают применение инсулина, аналогов инсулина или модифицированного инсулина, усиление высвобождения инсулина и действия инсулина, ингибирование продукции глюкозы в печени и ингибирование захвата глюкозы [Moller, 2001, Nature, 414, 821-27]. В дополнение к такому терапевтическому воздействию, также по всему миру для лечения DM-2 используют традиционную медицину. Для лечения симптомов DM-2 этнофармакологически или экспериментально использовали более 1200 видов организмов [Maries and Farnsworth, 1996, Protocol J. Botanical Med., 1, 85-137].

Является общепризнанным, что быстро возрастающая распространенность ожирения является серьезной проблемой общественного здоровья в США. В соответствии с данными 1999-2000 National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES), приблизительно две трети (64,5%) взрослого населения США имеют избыточную массу тела по сравнению с 55,9%, как сообщалось в исследовании NHANES III, проведенном между 1988 и 1994 годами. Распространенность ожирения также резко возросла от 22,9% до 30,5% на протяжении того же периода. Возрастающее число людей с ожирением, вероятно, имеют высокий риск развития различных связанных с ожирением заболеваний, включая диабет [Flegal et al, 2002, JAMA. 288, 1723-1727 и Kuczmarski et al 1994, JAMA. 272, 205-221].

Fraxinus excelsior L., растение семейства Oleaceae, широко известно как "ясень обыкновенный" или "ясень высокий" в странах средней Азии и Европы [Gilman and Watson, 1993, Fact Sheet ST-264, November]. Это растение также широко распространено в Тафилалете, юго-восточной области Марокко, и известно там в качестве "l'ssane l'ousfour". Область Тафилалет среди областей Марокко считают областью, где наиболее развито искусство фитотерапии [Eddouks et al, 2002, J. Ethnopharmacol. 82, 97-103]. В недавних исследованиях было показано, что F. excelsior (FE) обладает антибактериальной и антиоксидантной активностью. Экстракт FE в метаноле показал высокую антиоксидантную активность с RC₅₀, составляющей 1,35×10^-2 , в количественном анализе с , -дифенил- -пикрилгидразилом (DPPH). Экстракт FE в н-гексане и дихлорметане также является активным против восьми протестированных видов грамположительных и грамотрицательных патогенных бактерий, включая устойчивые к метициллину Staphylococcus aureus, со значениями минимальной ингибирующей концентрации (MIC) в пределах 1,25×10 ^-1 мг/мл [Middleton et al, 2005, Indian J. Pharma. Res., 2, 81-6]. Описан гипотензивный эффект FE как на нормотензивных, так и спонтанно гипертензивных крысах. Пероральное введение раз в сутки водного экстракта семян FE приводило к существенному повышению систолического кровяного давления и существенному усилению мочеиспускания у крыс обоих типов [Eddouks et al, 2005, J. Ethnopharmacol., 99, 49-54]. Водные экстракты семян FE проявляли сильную гипогликемическую и антигипергликемическую активность у нормальных и индуцированных стрептозотоцином (STZ) крыс без влияния на базовые концентрации инсулина в плазме [Maghrani et. al, 2004, J. Ethnopharmacol., 91, 309-16]. Одним из механизмов гипогликемического эффекта FE может быть флоризин-подобный эффект ингибирования реабсорбции глюкозы в почках [Eddouks et al, 2004, J. Ethnopharmacol., 94, 149-54].

Было описано, что FE, главным образом, содержит кумарины, секоиридоиды и фенилэтаноиды. [Kostova and Iossifova, 2007, Fitoterapia 78, 85-106]. Секоиридоиды, обнаруженные в FE, образуются из олеозида. Такие типы секоиридоидов существуют только в растениях семейства Oleaceae [Egan et al, 2004, Biochem. Sys. Ecol., 32, 1069-71].

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к новым секоиридоидам, которые были выделены из экстракта семян Fraxinus excelsior (общее название ясень). Было идентифицировано два соединения как (1) 3-этилиден-2-[(6-O- -D-глюкопиранозил- -D-глюкопиранозил)окси]-3,4-дигидро-5-(метоксикарбонил)метиловый эфир (2S,3E,4S)-2H-пиран-4-уксусной кислоты, под названием эксельсид A, имеющий химическую формулу C₂₂H₃₂O ₁₆ (фиг.1-1); и (2) 3-этилиден-2-[(6-O- -D-глюкопиранозил- -D-глюкопиранозил)окси]-3,4-дигидро-5-(метоксикарбонил)2-(4-гидроксифенил)этиловый эфир (2S,3E,4S)-2H-пиран-4-уксусной кислоты, под названием эксельсид B, имеющий формулу C₃₀H₄₀O₁₇ (фиг.1-2). Оба соединения представляют собой секоиридоиды типа олеозида, характеризующиеся экзоциклической 8,9-олефиновой функциональной группой.

Также настоящее изобретение относится к способу получения выделенной композиции, образованной из FE. Композицию можно получать уникальным способом экстракции и выделения. Семена измельчают в гранулы с размером частиц в диапазоне от 0,1 мм до 30 мм для увеличения площади поверхности для контакта с растворителем и для повышения эффективности экстракции. В одном варианте осуществления способа температура экстракции находится в диапазоне от 20°С до 100°С. В предпочтительном варианте осуществления температура экстракции находится в диапазоне от 50°С до 70°С. Отношение растительного материала к смеси растворителей, используемых в процессе экстракции, варьирует от 1:1 до 1:10 в расчете на грамм на миллилитр. В одном варианте осуществления способа соотношение составляет от 1:3 до 1:8. Период инкубации, в процессе которого растительный материал контактирует со смесью растворителей, составляет приблизительно от 2 ч до приблизительно 24 ч. Растворителями для экстракции могут быть вода, смесь вода-спирт (от 1% до 99% спирта в воде) и спирт. Предпочтительными спиртами являются этанол (EtOH) и метанол (MeOH). После инкубации растительного материала и растворителя, растворитель отделяют от остальной части растительного материала и экстракционную композицию концентрируют до тех пор, пока твердые компоненты композиции не будут содержать, в общем приблизительно 1%-35% секоиридоидов F. excelsior. Секоиридоиды включают два новых гликозида типа олеозидов, эксельсид A и эксельсид B, димерные секоиридоиды, нуженид (nuzhenide) (3) (фиг.1-3), GI3 (4) (фиг.1-4) и GI5 (5) (фиг.1-5), а также лигстрозид, сложный диметиловый эфир олеозида (6) (фиг.1-6) и сложный олеозид-11-метиловый эфир. Другие компоненты включают фенольные соединения, салидрозид, кумарины и флавоноиды. После завершения образования экстракта секоиридоиды выделяют. Секоиридоиды можно выделять из экстракта FE хроматографией.

Секоиридоиды выделяют из сухого порошкового экстракта FE. Порошок растворяют в спирте и из порошка секоиридоиды экстрагируют спиртом. Затем спирт выпаривают и оставшийся остаток, включающий секоиридоиды, помещают в хроматографическую колонку, заполненную смолой C-18 с обращенной фазой. Несколько фракций, содержащих различные соединения, элюируют серией из систем воды и 10% MeOH/90% воды и MeOH. Фракции сравнивают в анализе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и элюенты, имеющие сходные типы ВЭЖХ, объединяют. Объединенные фракции разделяют колоночной хроматографией с нормальной фазой на силикагеле и элюируют хлороформом (CHCl₃), смесью CHCl₃ -метанол, начиная от 90%, 80% CHCl₃ до 100% MeOH, с получением нескольких субфракций. Субфракции сравнивают ВЭЖХ и фракции, которые содержат эксельсид A и эксельсид B, объединяют, соответственно. Объединенные фракции затем очищают комбинированием колоночной хроматографии через смолы C-18, MCI GEL CHP-20P и/или Sephadex LH-20, с получением чистого эксельсида A и эксельсида B.

С использованием спектроскопических методов, включая ядерный магнитный резонанс (ЯМР), ультрафиолетовую (УФ), инфракрасную (ИК) и масс-спектроскопию (МС), были выявлены новые химические структуры эксельсида A и эксельсида B, а также определены их физические свойства. Известные химические структуры секоиридоидов идентифицированы путем прямого сравнения спектров ЯМР со спектрами, приведенными в литературе. ИК-спектры были зарегистрированы на спектрофотометре Perkin-Elmer 1600 FTIR с использованием пластин KBr. Спектры ЯМР были получены на Varian INOVA 400 с дейтерированным метанолом (CD₃OD) в качестве растворителя. Все 2D-корреляционные спектры были получены с использованием стандартных градиентных импульсных последовательностей программного обеспечения Varian NMR. Корреляционные спектры включают COSY (корреляционная спектроскопия), TCOSY (тотальная корреляционная спектроскопия), HMQC (гетероядерная множественная квантовая когеренция), HMBC (гетероядерная корреляция с многократными связями) и ROESY (усиленная спектроскопия Оверхаузера с вращающейся рамкой). Анализ ВЭЖХ проводили с использованием системы ВЭЖХ Agilent модели 1100, оборудованной четырехкомпонентным насосом, автоматическим пробозаборником, четырехканальным интерактивным дегазатором, детектором с фотодиодной матрицей и программным обеспечением Agilent Chemstation. Молекулярные массы определяли с использованием режима ЖХ/МС ESI/APCI на масс-спектрометрической ионной ловушке Finnigan LCQ. УФ-спектры получали на спектрофотометре Schimadzu, UV-1700 UV-Visible.

Также настоящее изобретение относится к ингибирующему эффекту димерных секоиридоидов, GI5 (5) и нуженида (3), на недифференцированные клетки 3T3-L1. Основным компонентом увеличения массы тела является отложение жировой ткани в организме в результате процесса адипогенеза. Адипогенез характеризуется увеличением числа и размера жировых клеток. Ингибирование адипогенеза путем ингибирования синтеза жира в клетках для уменьшения числа и размера жировых клеток обеспечивает контроль за массой тела.

Настоящее изобретение относится к активации PPAR-альфа с помощью Fraxinus excelsior (FE) и выделенных секоиридоидов из FE, сложного диметилового эфира олеозида (6), эксельсида A (1) и GI3 (4). Активируемые пролифератором пероксисом рецепторы (PPAR) представляют собой ядерные рецепторы, которые контролируют множество клеточных и метаболических процессов. PPAR-альфа экспрессируется, главным образом, в печени, где он играет важную роль в контроле окисления жирных кислот [Reddy and Hashimoto, 2001, Annu Rev Nutr., 21, 193-230]. Индукция окисления жирных кислот путем активации PPAR-альфа улучшает профили липидов в плазме. На различных моделях мышей агонисты PPAR-альфа снижают уровень триглицеридов в плазме, уменьшают ожирение и снижают стеатоз печени и мышц, в результате чего повышая чувствительность к инсулину и снижая уровень глюкозы в крови [Guerre-Millo et al, 2000, J. Biol. Chem., 275, 16638-42 и Kim et al, 2003, Диабет, 52, 1770-8].

Также настоящее изобретение относится к указанной выше композиции, которая пригодна для лечения метаболических синдромов для уменьшения уровня глюкозы в крови у субъекта с DM-2, для способствования снижению массы тела и для уравновешивания уровня инсулина в целях предотвращения гиперинсулинемии, симптома устойчивости к инсулину у пациента с DM-2. Когда самцов мышей C57BL/6J кормят рационом с высоким содержанием жиров, у них развивается ожирение, гипергликемия и гиперинсулинемия. Введение эффективного количества FE может существенно снизить уровень глюкозы у мышей, уменьшить их массу тела и уровень жира в организме, и снизить уровни инсулина в плазме.

В клинических испытаниях у человека, 16 здоровым добровольцам давали натощак 50 грамм глюкозы для индукции возникающей после приема пищи гликемии и вводили FE или плацебо (пшеничные отруби). В группе экстракта FE снижалась нарастающая, возникающая после приема пищи концентрация глюкозы в плазме по сравнению с плацебо. В ней была статистически значимо (P=0,02) снижена площадь под кривой уровня глюкозы в крови (AUC), характеризующая гликемию. Экстракт семян FE также на значимом уровне индуцировал (P=0,002) секрецию инсулина через 90 мин после введения глюкозы.

Краткое описание фигур

Дополнительные признаки, преимущества и характеристики настоящего изобретения будут очевидны специалисту в данной области с учетом представленного ниже подробного обсуждения предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, приведенного со ссылкой на прилагаемые рисунки, в которых:

На фиг.(1-1)-(1-6) проиллюстрирована молекулярная структура эксельсида A, эксельсида B, нуженида, GI3, GI5 и сложного диметилового эфира олеозида, соответственно.

На фиг.2 проиллюстрирована активность захвата глюкозы (имп.мин.) для соединений GI5 (5) и нуженида (3) для 1, без обработки, 2, инсулина, 3, инсулина и MeOH, 4 нуженида в концентрациях 0,004%, 0,02%, 0,05% и 0,1%; 5, GI5 в концентрациях 0,004%, 0,02%, 0,05% и 0,1%.

На фиг.3 проиллюстрирована относительная активация слитого рецептора GAL4/PPAR экстрактом семян Fraxinus excelsior L. и 100 мкМ фенофибратом (положительный контроль) по сравнению с эффектом ДМСО (контрольные условия) (значения являются средними значениями±SD (n=4). *P<0,05, **P<0,01; ***P<0,001. t-критерий Стьюдента).

На фиг.4 проиллюстрированы результаты уровня глюкозы натощак (мг/дл) для мышей при рационе с низким содержанием жиров (LF), высоким содержанием жиров (HF) и Fraxinus (HF+экстракт FE) после кормления в течение 16 недель.

На фиг.5 проиллюстрированы результаты для средней массы тела (г) у мышей при рационе с низким содержанием жиров (LF), высоким содержанием жиров (HF) и Fraxinus (HF+экстракт FE) после кормления в течение различного количества недель.

На фиг.6 проиллюстрирован потенциал относительной активации PPAR (%) в репортерных клеточных линиях с использованием концентраций в диапазоне 10^-5M-10^-9M для селективного синтетического активатора PPAR WY14.643, а также выделенных соединений в концентрации 10^-4M и водного раствора 1:10 экстракта семян FE, с обозначением соединений, отмеченных как: FE19028 (нуженид, 3), FE20015 (GI3, 4), FE20031 (сложный диметиловый эфир олеозида, 6), FE21008 (эксельсид A, 1) и FE21023 (GI5, 5).

На фиг.7 проиллюстрирована масса (г) сальникового жира отдельных мышей из групп LF (n=10), HF (n=10) и экстракта семян FE, соответственно.

На фиг.8 проиллюстрирована масса (г) забрюшинной жировой клетчатки отдельных мышей из групп LF (n=10), HF (n=10) и экстракта семян FE, соответственно.

На фиг.9 проиллюстрированы уровни инсулина в плазме натощак (нг/мл) у отдельных мышей из групп LF (n=10), HF (n=10) и экстракта семян FE, соответственно.

На фиг.10A и 10B, соответственно, проиллюстрировано сравнение (ммоль/л от времени) между экстрактом семян Fraxinus excelsior L (FE) (1,0 г) и соответствующего плацебо в виде отрубей пшеницы (1,0 г) на гликемию у здоровых добровольцев, которым вводили 50 г глюкозы, для (A) нарастающей гликемии в отдельные моменты времени, и (B) площади под кривой уровня глюкозы в крови (AUC), где значения являются средним значением±SEM. *P=0,02, парный t-критерий (n=16).

На фиг.11A и 11B, соответственно, проиллюстрировано сравнение (мЕ/л против времени) между экстрактом семян Fraxinus excelsior L (1,0 г) и соответствующим плацебо в виде отрубей пшеницы (1,0 г) на уровни инсулина у здоровых добровольцев, которым вводили 50 г глюкозы, для (A) нарастающей инсулинемии в отдельные моменты времени, и (B) площади под кривой (AUC), характеризующей инсулинемию, где значения являются средними значениями±SEM. **P=0,002, t-критерий Стьюдента (n=16).

Подробное описание изобретения

Относительно рисунков и следующих примеров, ниже описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения для экстракта семян Franxinus excelsior .

Пример 1

Экстракция секоиридоидов из Fraxinus excelsior водой

В общем 2,5 кг семян F. excelsior сушили на воздухе и затем измельчали в крупный порошок с размером частиц приблизительно 1-2 мм. Грубый порошок погружали в воду в перколяторе при 80-90°С на 5 часов и водный экстракт сливали из перколятора. Процесс экстракции повторяли три раза. Все водные экстракты объединяли и концентрировали на вакуумном роторном испарителе. После выпаривания воды получили в общем 550 грамм сухого порошкового экстракта. Анализ ВЭЖХ указывает на то, что полученный порошковый экстракт содержал два основных секоиридоида, 11,4% (масс./масс.) нуженида и 6,2% GI3. Также композиция содержала 0,19% сложного олеозид-11-метилового эфира, 0,41% эксельсида B, 0,63% GI5, 0,2% салидрозидв, вместе с некоторыми несущественными секоиридоидами, включая лигстрозид, сложный диметиловый эфир олеозида и эксельсид A.

Пример 2

Экстракция секоиридоидов из Fraxinus excelsior водой, смесью вода-EtOH и EtOH

Приготавливали 5 образцов, и каждый образец содержал 5 г семян F. excelsior. Каждый образец измельчали в порошок и подвергали экстракции растворителем из 200 мл воды, смеси 25% EtOH/75% воды, смеси 50% EtOH/50% воды, смеси 75% EtOH/25% воды и EtOH, соответственно. После экстракции в течение 24 часов при комнатной температуре (22-24°С), растворители выпаривали и остаточные твердые вещества анализировали ВЭЖХ. Содержание секоиридоидов и салидрозида приведено в таблице 1.

Таблица 1 Содержание основных секоиридоидов и салидрозида при использовании различных растворителей (результаты выражены как процент по массе)
Соединения	EтOH	75% EтOH	50% EтOH	25% EтOH	вода
Нуженид	9,05	15,04	15,43	14,10	1,50
GI3	9,20	14,77	17,06	9,18	1,14
Сложный диметиловый эфир олеозида	0,57	0,91	0,78	0,74	0,96
Эксельсид B	0,06	0,09	0,10	0,12	0,03
GI5	0,91	1,45	1,70	0,83	0,10
Салидрозид	0,08	0,17	0,16	0,18	0,74

Пример 3

Выделение секоиридоидов из F. excelsior

3,5 литра метанола добавляли к 500 грамм порошкового экстракта, полученного по методике, описанной в примере 1, и перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. Раствор метанола отделяли от порошка фильтрованием. Тот же процесс повторяли один раз, два экстракта в метаноле объединяли и концентрировали при пониженном давлении, с получением в общем 54 грамм сухого экстракта в метаноле. Экстракт в метаноле повторно растворяли в воде и фильтровали для удаления нерастворимых в воде веществ. Затем фильтрат подвергали разделению хроматографией с обращенной фазой на смоле C-18, промывали водой и градиентной системой растворителей MeOH-вода от 10% MeOH в воде до 100% MeOH. Собрали в общем 7 фракций. Каждую фракцию, элюированную с колонки, выпаривали в вакууме и комбинировали в анализе ВЭЖХ. Фракции 2, 3 и 7 помещали на хроматографическую колонку, заполненную силикагелевой смолой, и элюировали из системы хлороформ-метанол, начиная от CHCl ₃, 10% MeOH/CHCl₃, 20% MeOH/CHCl₃ до 100% MeOH. Фракции, собранные из колонки с силикагелем, сравнивали анализом ВЭЖХ, и каждый отделенный элюент повторно подвергали колоночной хроматографии на смолах MCI GEL CHP-20P и/или Sephadex LH-20 и элюировали системой вода-метанол до получения одного чистого соединения. Было обнаружено два новых соединения, эксельсид A и эксельсид B, помимо нескольких известных соединений: нуженида, GI3, GI5, лигстрозида, сложного диметилового эфира олеозида, сложного олеозид-11-метилового эфира и салидрозида. Все химические структуры были установлены спектроскопическими способами.

Пример 4

Установление структуры эксельсида A и эксельсида B

Эксельсид A (1) получали в виде аморфного порошка. Его молекулярная формула C₂₂H ₃₂O₁₆ была определена, исходя из его MC, и подтверждена данными ¹H и ¹³C ЯМР (таблица 2). УФ-спектр показал конкретное поглощение при 232 (sh) нм, образованное системой простого иридоидного енольного эфира, конъюгированной с карбонильной группой. ИК-спектр демонстрировал функциональные группы гидроксила при v_max 3401, сложного эфира при 1734, 1717 и , -ненасыщенного сложного эфира при 1626 см^-1. Подробный анализ ¹H, ¹³C-ЯМР и 2D-корреляционных спектров указал на эксельсид A, несущий группу секоиридоидного глюкозида типа олеозида, которая была подтверждена протонными сигналами при _H 7,51 (с, H-3), 5,93 (с, H-1), 6,08 (квд, J=7,2, 0,8 Гц, H-8), 1,72 (д, J=7,6 Гц, H₃-10) и 4,80 (д, J=8,0 Гц, H-1'), с соответствующими сигналами углерода-13 при _c 155,2 (C-3), 94,8 (C-1), 124,7 (C-8), 13,6 (C-10) и 100,5 (C-1'F). Два сигнала метоксила при _H 3,62 (OCH₃, _c 51,9) и 3,70 (OCH₃, _c 52,3) показали корреляцию с C-7 ( _c 173,7) и C-11 ( _c 168,6) в спектре gHMBC, соответственно, указывая на эксельсид A, имеющий элемент сложного диметилового эфира 7,11-олеозида [Boros and Stermitz, 1991, J. Nat. Prod., 54, 1173-246]. Кроме того, возникновение дополнительных сигналов ЯМР вследствие -глюкопиранозильной группы ( _c 100,6, 77,6, 77,8, 71,6, 75,3 и 70,1), подтвердило эксельсид A в качестве сложного диметилового эфира 7,11-олеозида, несущего другой глюкозил. Положение глюкозила было определено, как присоединенное к C-6' группы олеозида, поскольку существовал сдвиг в сторону слабого поля, составляющий 7,5 м.д. сигнала у C-6', и сдвиг в сторону сильного поля, составляющий 0,5 и 2,6 м.д. у C-3' и C-5', соответственно, при сравнении с эксельсидом A с тем же положением сигнала 7,11-диметилолеозида. Этот вывод был далее подтвержден корреляционным спектром gHMBC, в котором наблюдались перекрестные пики между H-1''' при _H 4,35 и C-6' при _c 70,1 м.д., а также между H-6' ( _H 4,15 и 3,84 м.д.) и C-1''' ( _c 105,3 м.д.). Метильная группа была расположена в E-конфигурации у 8,9-олефиновой связи и была подтверждена спектром ROESY, где наблюдали сильную корреляцию между H-10 ( _H 1,72) и H-5 ( _H 3,96). В том же спектре корреляция между H-1 ( _H 5,93) и H-6 ( _c 2,51) подтвердила гликозил в C-1, принимающий -конфигурацию. Таким образом, было определено, что структура эксельсида A представляет собой 3-этилиден-2-[(6-O- -D-глюкопиранозил- -D-глюкопиранозил)окси]-3,4-дигидро-5-(метоксикарбонил)метиловый эфир (2S,3E,4S)-2H-пиран-4-уксусной кислоты, под названием эксельсид A. Полное предоставление данных ¹H и ¹³ C ЯМР приведено в таблице 2.

Эксельсид B (2) был выделен в виде бесцветного аморфного порошка. Его молекулярная формула была определена как C₃₀H₄₀O ₁₇ при MC и подтверждена данными ЯМР. В УФ-спектре, помимо типичного поглощения при 230 нм простого иридоидного енольного эфира, конъюгированного с карбонильной группой, дополнительное поглощение при 275 и 283 нм указало на существование фенола. ИК показал гидроксил при v_max 3400, , -ненасыщенный сложный эфир при 1701, 1636, и ароматическое кольцо при 1518 см^-1. Спектры ¹H и ¹³C ЯМР эксельсида B продемонстрировали типичные сигналы вследствие олеозидной группы: олефиновый сигнал при _H 7,50 (с, H-3), _С 155,2 (C-3), ацетальаллильный при _H 5,94 (s, H-1), _С 94,7 (C-1), аномерный сигнал от глюкозила при _H 4,82 (d, H-1'), _С 100,3 (C-1'), олефиновый протон из группы этилидена при _H 6,05 (д, H-8), _С 124,8 (C-8) и метил из этилидена при _H 1,61 (д, H₃-10), _С 13,6 (C-10). Наблюдаемые сигналы фенилэтаноида, а также спиновая система AA'BB' в ароматическом кольце при _H 6,71 (2H, дд, J=6,8, 2,8 Hz) и _H 7,02 (2H, дд, J=6,8, 2,8 Гц), подтвердили конфигурацию пара-замещенного фенилэтаноида. Дальняя корреляция ¹H-¹³C, выявленная в gHMBC между H-1" при _H 4,26 и C-7 при _С 67,0 м.д., подтвердила, что в положении C-7 был присоединен фенилэтанол, который объединял структуру эксельсида B с лигстрозидом, сложным пара-гидроксифенилэтаноловым эфиром метилолеозида [Takenaka et al, 2000, Phytochemistry, 55, 275-84]. Аналогично эксельсиду A, было предположено, что наблюдаемый дополнительный -глюкопиранозильный элемент в эксельсиде B присоединен к C-6'. Это было подтверждено сдвигом в сторону слабого поля, составляющим 7,3 м.д., сигнала C-13 у C-6' эксельсида B, и сдвигом в сторону сильного поля, составляющим 0,7 и 2,9 м.д., у C-3' и C-5', соответственно, при сравнении с лигстрозидом. Дальнейшее подтверждение такой связи наблюдали в спектре gHMBC, где наблюдалась сильная корреляция между аномерным сигналом от глюкозила при _H 4,31 (H-1''' и при _С 70,1 (C-6'). Положение метильной группы было отнесено к C-11 вследствие наблюдаемого дальнего перекрестного пика сигналов при _H 3,69 (OCH₃) и _С 168,7 (C-11) в спектре gHMBC. Таким образом, соединение эксельсид B было определено как 3-этилиден-2-[(6-O- -D-глюкопиранозил- -D-глюкопиранозил)окси]-3,4-дигидро-5-(метоксикарбонил)2-(4-гидроксифенил)этиловый эфир (2S,3E,4S)-2H-пиран-4-уксусной кислоты, под названием эксельсид B. Предоставление данных ¹H и ¹³C ЯМР приведено в таблице 2.

Таблица 2 Данные 1H, 13C ЯМР и HMBC для соединений эксельсида A (1) и эксельсида B (2) (CD 3OD)
1			2
No	H	c	HMBC (H-C)	H	c	HMBC (H-C)
1	5,93 с	94,8 д	8,1'	5,94 с	94,7 д	8, 1'
3	7,51 с	155,2 д	1, 4, 5, 11	7,50 с	155,2 д	1, 4, 5, 11
4		109,3 с			109,3 д
5	3,96 дд (9,0, 4,3)	31,9 д	1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 11	3,95 дд (9,6, 4,0)	32,0 д	7, 11
6	2,76 дд (14,4, 4,4)	41,1 т	4, 5, 7, 9	2,72 дд (14,0, 4,0)	41,3 т	7
	2,51 дд (14,0, 10,0)		4, 5, 7, 9	2,50 дд (14,0, 9,6)		7
7		173,7 с			173,4с
8	6,08 дкв (7,2, 0,8)	124,7 д	1, 5, 10	6,05 д (6,8)	124,8д	1, 5, 9, 10
9		130,4 с			130,1 с
10	1,72 д (7,6)	13,7 кв	8,9	1,61 д (7,2)	13,6 кв	8,9
11		168,7 с			168,7с
OCH3	3,70 с	52,3 кв	11	3,69 с	51,9 кв	11
OCH3	3,62 с	51,9 кв	7
1'	4,80 д (8,0)	100,6 д	1	4,82 д (7,6)	100,4 д	1, 2'
2'	3,24-3,68 м	77,6 д		3,12-3,55 м	77,5 д
3'	3,24-3,68 м	77,8 д		3,12-3,55 м	77,8 д
4'	3,24-3,68 м	71,6 д		3,12-3,55 м	71,5 д
5'	3,24-3,68 м	75,3 д		3,12-3,55 м	75,1 д
6'	4,15 дд (12,0, 1,6)	70,1 т	1'"	4,15 д (10,4)	70,1т	5', 1'"
	3,84 ушир. д (12,0)			3,81 дд (11,6, 2,4)
1"				4,26 м	67,0 т	7, 2", 3"
				4,06 м		7, 2", 3"
2"				2,80 т (6,8)	35,2 т
3"					130,3 с
4"				7,02 дд (6,8, 2,8)	131,1 д	2", 3", 6"
5"				6,71 дд (6,8, 2,8)	116,4 д	3", 4", 6"
6"					157,0 с
7"				6,71 дд(6,8, 2,8)	116,4 д

8"				7,02 дд (6,8, 2,8)	131,1 д
1'"	4,35 д (8,0)	105,2 д	6'	4,31 д (8,0)	105,2 д	6'
2'"	3,24-3,68 м	74,7 д		3,12-3,55 м	74,7 д
3'"	3,24-3,68 м	77,7 д		3,12-3,55 м	77,6 д
4'"	3,24-3,68 м	71,5 д		3,12-3,55 м	71,4 д
5"'	3,24-3,68 м	77,8 д		3,12-3,55 м	77,6 д
6'"	3,98 дд (9,6, 4,4)	62,7 т		3,74 дд (12,0, 6,8)	62,6 т
	3,75 дд (12,0, 6,8)			3,62 дд (12,0, 6,8)

Химические сдвиги выражены в миллионных долях (м.д.) против тетраметилсилана (TMS) в качестве стандарта для сравнения; множественность сигнала представлена как синглет (с), дублет (д), триплет (т), квартет (кв), дублет дублета (дд), дублет квартета (дкв), и множественная (м); константа связи в скобках выражена в Гц; используемым растворителем для получения спектров ЯМР является CD₃OD.

Пример 5

Ингибирующий эффект GI5 (5) и нуженида (3) на недифференцированные клетки 3T3-L1

Основным компонентом увеличения массы тела является отложение жировой ткани в организме посредством процесса адипогенеза. Адипогенез характеризуется увеличением размера и числа жировых клеток. Секоиридоиды, GI5 и нуженид, выделенные из F. excelsior, показали значительную и мягкую ингибирующую активность в отношении адипогенеза, соответственно, путем блокирования каскада недиффиринцированных клеток 3T3-L1 в дифференцированный адипоцит для достижения эффекта контроля массы тела и уменьшения ожирения в организме. Дифференцировку преадипоцитов 3T3-L1 индуцировали гормональным коктейлем из метилизобутилксантина, дексаметазона и инсулина (MDI) в присутствии или отсутствии соединений. Через десять суток после индукции дифференцировки, обработанные клетки анализировали в отношении их соответствующей активности захвата глюкозы, что является непрямым показателем дифференцировки (адипогенеза), поскольку преадипоциты неспособны к индуцируемому инсулином захвату глюкозы, опосредуемому переносчиком глюкозы-4 (GLUT4), в то время как полностью дифференцированные адипоциты способны к такому захвату. Соединения, GI5 и нуженид, использовали в четырех различных концентрациях: 0,004%, 0,02%, 0,05% и 0,1%. В качестве отрицательного контроля использовали необработанные (недифференцированные) клетки, и в качестве положительного контроля использовали инсулин. Также в качестве контроля использовали метанол (MeOH), растворитель для соединений. Результаты показали, что GI5 и нуженид, выделенные из F. Excelsior, обладают значимой и мягкой ингибирующей активностью в отношении адипогенеза, соответственно, блокируя каскад от недифференцированных клеток 3T3-L1 в дифференцированные адипоциты для достижения эффекта контроля массы тела и уменьшения ожирения в организме (см. фиг.2).

Пример 6

Активация PPAR-альфа посредством Fraxinus excelsior

Активируемые пролифератором пероксисом рецепторы (PPAR) представляют собой ядерные рецепторы, которые контролируют множество клеточных и метаболических процессов. PPAR-альфа экспрессируется, главным образом, в печени, где он играет важную роль в контроле окисления жирных кислот (Reddy and Hashimoto, 2001, Annu Rev Nutr., 21, 193-230). Индукция окисления жирных кислот путем активации PPAR-альфа улучшает профили липидов в плазме. На различных моделях мышей агонисты PPAR-альфа снижают уровень триглицеридов в плазме, уменьшают ожирение и снижают стеатоз в печени и мышцах, повышая, таким образом, чувствительность к инсулину и снижая уровень глюкозы в крови [Guerre-Millo et al, 2000, J. Biol. Chem., 275, 16638-42 и Kim et al, 2003, Diabetes, 52, 1770-8].

Было показано, что экстракт семян Fraxinus excelsior, полученный с использованием в качестве растворителя воды, как описано в примере 2 (экстракт FE), активирует PPAR-альфа. Относительную активацию PPAR-альфа экстрактом FE и фенофибратом (положительный контроль) по сравнению с ДМСО (контрольные условия) вычисляли как люминесцентный сигнал люциферазы (репортерного гена), полученного от активных соединений после инкубации с трансфицированными GAL4/рецептором PPAR-альфа клетками. Во-первых, клетки COS-7 (культивированные в DMEM+10% FCS) временно трансфицировали слитым белком GAL4/PPAR-альфа и конструкцией ДНК, несущей люциферазу. Для трансфекции, сначала получали плазмиду pGAL5-TK-pGL3 путем встраивания пяти копий участка связывания ДНК GAL4 (транскрипционный фактор дрожжей) перед промотором тимидинкиназы плазмиды pTK-pGL3. Затем конструировали плазмиду pGAL4-hPPAR-альфа путем амплификации с помощью ПЦР DEF доменов hPPAR-альфа (ак 180-464). Полученные продукты ПЦР клонировали в pBD-GAL4 (Stratagene, La Jolla, USA), и затем химеру субклонировали в вектор pKDNA3. После трансфекции клетки COS-7 инкубировали в течение 24 ч с 0 мкг/мл (контрольные условия), 1 мкг/мл, 3 мкг/мл, 10 мкг/мл, 30 мкг/мл, 100 мкг/мл, 300 мкг/мл и 1000 мкг/мл экстракта FE или 100 мкМ фенофибрата (положительный контроль). В качестве растворителя использовали ДМСО. После инкубации клетки собирали и проводили анализ люциферазы. Активация PPAR-альфа экстрактом FE и фенофибратом привела к экспрессии люциферазы и последующему увеличению люминесцентных сигналов, которые измеряли с помощью спектрофотометра Tecan Ultra (Tecan, Austria). Результаты выражали как относительную активацию GAL4/PPAR-альфа, пропорциональную люминесцентному сигналу, испускаемому благодаря экстракту FE и фенофибрату по сравнению с люминесцентной активностью контроля (ДМСО). Результаты представлены в виде средних значений±SD для четырех экспериментов для каждого теста (фиг.3). Различия между группами вычисляли с использованием t-критерия Стьюдента (XLSTAT 2008, Addinsoft^TM, USA). Результаты активации PPAR-альфа экстрактом FE представлены на фиг.3. Активация PPAR-альфа экстрактом FE достигала 18% при 1000 мкг/мл. Результаты выражены как процентное содержание фенофибрата, активатора PPAR-альфа, используемого в качестве соединения для сравнения.

Способность экстракта FE активировать PPAR-альфа может быть объяснена, частично, эффектом уменьшения гликемии, наблюдаемым в исследованиях на животных.

Пример 7

Гипогликемическая активность экстракта FE у самцов мышей C57BL/6J

Самцов мышей C57BL/6J разделяли на три группы: 1) группа отрицательного контроля, где 20 самцов мышей содержали на рационе с низким содержанием жиров (LF) с потреблением приблизительно 10 ккал в сутки; 2) группа положительного контроля, где 20 мышей кормили рационом с высоким содержанием жиров (HF) и потреблением приблизительно 60 ккал в сутки, и вследствие кормления с высоким содержанием жиров, у этой группы мышей развивалось ожирение, гипергликемия и гиперинсулинемия; 3) группа 0,5% экстракта FE, где 10 самцов мышей кормили рационом с высоким содержанием жиров, подобно самцам в группе 2, но рацион также смешивали с 0,5% экстрактом FE. Потребление корма и жидкости и массу тела измеряли раз в неделю. Проводили мониторинг признаков нарушений и возможной токсичности. Из хвостовой вены отбирали образцы крови и проводили мониторинг уровня глюкозы натощак с использованием устройства для измерения уровня глюкозы в крови. Перед экспериментом определяли исходные данные. Не было статистических отличий среди этих трех групп.

После введения в течение 16 недель, группа мышей, которым давали экстракт FE, показала значимо более низкие уровни глюкозы в крови по сравнению с контрольной группой с высоким содержанием жиров (p<0,001), что указывает на сильный гипогликемический эффект экстракта FE (фиг.4).

Пример 8

Активность экстракта FE в отношении уменьшения массы тела у самцов мышей C57BL/6J

Измеряли массу тела каждой мыши из тех же групп, что и в примере 7. Между тремя группами не было значимых отличий исходной массы тела. После кормления в течение 16 недель, у всех мышей в группах на рационе с высоким содержанием жиров (группа 2 и 3) происходило значительно более высокое увеличение массы тела, чем в группе, которую кормили рационом с низким содержанием жиров. Однако степень увеличения массы тела в группе FE была значительно более низкой по сравнению с группой положительного контроля, что указывает на активность экстракта FE в контроле массы тела (фиг.5).

Пример 9

Активность в отношении PPAR-альфа эксельсида A (1), GI3 (4) и сложного диметилового эфира олеозида (6)

Пять отдельных соединений, выделенных из водного экстракта семян Fraxinus excelsior (FE), тестировали в отношении активности PPAR-альфа. В данном анализе синтетический и селективный активатор PPAR-альфа WY 14.643 служил в качестве положительного контроля, и ДМСО, который использовали для растворения данных соединений, служил в качестве отрицательного контроля. Пять чистых секоиридоидов были частично активными в концентации 10M. Соединения эксельсида A, сложного диметилового эфира олеозида и GI3 показали хорошую активность (фиг.6).

Пример 10

Снижение ожирения с помощью экстракта семян Fraxinus excelsior (FE) у самцов мышей C57BL/6J

В конце эксперимента (из примера 7), после кормления в течение 16 недель, мышей из всех четырех групп подвергали анестезии и умерщвляли. Сальниковый и заборюшинный жир от отдельных мышей собирали и взвешивали. Результаты показали, что экстракт семян FE снижал увеличение сальникого жира на 18,3% и увеличение забрюшинного жира на 17,8%, соответственно, (фиг.7 и 8).

Пример 11

Снижение уровней инсулина в плазме натощак с помощью экстракта семян Fraxinus excelsior (FE) у самцов мышей C57BL/6J

В конце эксперимента (из примера 7), определяли уровни инсулина в плазме натощак с использованием набора Elisa для мышей. Мыши, которым давали экстракт семян Fraxinus, имели значимо более низкие уровни инсулина в плазме по сравнению с уровнями в контрольной группе при рационе с высоким содержанием жиров (P<0,05) (фиг.9).

Пример 12

Активность экстракта семян Fraxinus excelsior (FE) в отношении снижения уровня сахара в крови

Для оценки эффекта композиций по настоящему изобретению у человека, проводили рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое и перекрестное исследование у человека. В общем, было привлечено шестнадцать здоровых индивидов (11 мужчин и 5 женщин) из Индии. Требовалось, чтобы возраст субъектов составлял от 25 до 55 лет, индекс массы тела составлял 26±2,2 кг/м ², и уровень глюкозы натощак составлял 4,4±0,09 ммоль/л. Для группы введения использовали экстракт семян FE, и для группы плацебо использовали порошок пшеничных отрубей. Суточная дозировка на человека в данном исследовании составляла 1 г экстракта семян FE. Субъектов инструктировали принимать либо две капсулы экстракта семян FE (по 500 мг в каждой) или две капсулы плацебо (по 500 мг отрубей пшеницы в каждой) перорально в качестве однократной дозы перед нагрузкой глюкозой (50 г в 100 мл воды) для оценки гликемического ответа. После периода выведения в течение одной недели, две группы меняли друг с другом. В ходе исследования, получали образцы крови из указательного пальца через 0, 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минут. Тестируемый экстракт/плацебо давали со 100 мл воды сразу после взятия образца крови натощак в момент времени 0 мин. Затем субъект проглатывал напиток с глюкозой в течение 5-8 минут (50 г в 100 мл воды, D-глюкоза, Qualigens Co., Glaxo India). В этот момент времени включали таймер. Дополнительные образцы крови из указательного пальца отбирали через 15, 30, 45, 60, 90 и 120 мин после начального приема напитка с глюкозой. Концентрации глюкозы определяли в цельной крови в капиллярах с использованием глюкометра Bayer и Essentia glucotrip. Вычисляли положительную возрастающую площадь под кривой (AUC) концентраций глюкозы в крови как для группы плацебо, так и для группы введения FE, через различные промежутки времени. Значимые отличия между группами вычисляли с использованием двухстороннего парного t-критерия Стьюдента. Анализы проводили с использованием программного обеспечения XLSTAT 2008 (Addinsoft^TM, USA). Статистическая значимость была установлена на уровне P<0,05. Все данные представлены как среднее значение±SEM.

На графике нарастания гликемии после попарного сравнения представлено снижение уровней глюкозы с помощью экстракта семян FE после приема пищи, в ходе эксперимента через 15 (2,0±0,26 ммоль/л против 1,7±0,21 ммоль/л), 30 (4,0±0,41 ммоль/л против 3,7±0,33 ммоль/л), 45 (4,2±0,41 ммоль/л против 3,7±0,47 ммоль/л), 60 (3,4±0,46 ммоль/л против 3,4±0,41), 90 (1,8±0,38 ммоль/л против 1,6±0,31 ммоль/л) и 120 (0,58±0,29 ммоль/л против 0,21±0,27 ммоль/л) минут по сравнению с соответствующим плацебо из пшеничных отрубей (фиг.10A). Парный t-критерий Стьюдента показал, что отличия (299,8±28,8 мин ммоль/л против 273,2±25,2 мин ммоль/л) в эффекте введения (FE против плацебо) на среднее значение AUC были статистически значимыми (P=0,02). Результаты представлены на фиг.10B.

Пример 13

Острый инсулинотропный эффект экстракта семян Fraxinus excelsior (FE) у человека

Инсулинотропный эффект композиции оценивали в качестве дополнительной цели клинического испытания, описанного в примере 12. Образцы венозной крови (7-8 мл) отбирали через 0, 30, 60, 90 и 120 мин у субъектов, которые принимали тестируемой FE/плацебо, в сепараторные пробирки для сыворотки. Крови давали возможность свернуться в течение 15 минут, и затем ее центрифугировали при 1500×g в течение 10 минут. Затем полученную сыворотку анализировали в отношении инсулина с использованием иммунологического анализа электрохемолюминесценции (ECLIA). Как для группы для плацебо, так и для группы введения FE вычисляли положительную площадь под кривой (AUC), характеризующую нарастающую инсулинемию, для уровней инсулина в различные моменты времени. Значимые отличия между группами вычисляли с использованием двухстороннего парного t-критерия Стьюдента. Анализы проводили с использованием программного обеспечения XLSTAT 2008 (Addinsoft^TM, USA). Статистические отличия были установлены на уровне P<0,05. Все данные представлены как среднее значение±SEM. FE (55,5±4,6 мЕ/л) индуцировал значимо отличающуюся (P=0,002) секрецию инсулина через 90 минут по сравнению с плацебо (43,5±5,0 мЕ/л) (фиг.11A). Не было выявлено значимых отличий в средних значениях AUC для инсулинемии (0-120 минут) в группе введения FE (6041,6±340,5 мин мЕ/л) по сравнению с плацебо (5996,3±594,58 мин мЕ/л) (фиг.11B).

Стимуляция секреции инсулина через 90 мин, по-видимому, является прямым воздействием FE на клетки островков поджелудочной железы, которое возвращалось к норме в конце исследования (через 120 минут). Это может снизить устойчивость к инсулину и повысить чувствительность к инсулину в таких случаях. Кроме того, поскольку отсутствуют значимые отличия в средних значениях AUC для инсулинемии между группами лечения и плацебо, применение экстракта является безопасным, не вызывая в итоге гиперинсулинемию в последующие часы после введения.

Следует понимать, что эффективное количество экстракта FE может варьировать в зависимости от массы животного или человека, которому проводят введение, как известно специалистам в данной области. Кроме того, экстракт FE может быть доставлен любой общепринятой средой, сформированной в форме жидкости, порошка или гранул, в форму капсулы, таблетки или капсулы, или другой общепринятой лекарственной формы, вместе с такими наполнителями, добавками, связующими веществами, эксципиентами, вкусовыми добавками и т.п., как обычно используют в продаваемых без рецепта фармацевтических средствах и диетических добавках для продуктов.

Специалисту в данной области будет понятно, что настоящее изобретение может быть защищено вариантами осуществления, иными, чем описанные варианты осуществления и приведенные числовые значения и диапазоны, которые предоставлены для целей иллюстрации, но не ограничения.