способ пивоварения

Формула изобретения

1. Способ производства сусла, включающий стадии:

a) смешивания с водой зернового материала, содержащего по меньшей мере 50% солода,

b) добавления пуллуланазы, причем указанная пуллуланаза имеет более чем 60%-ную ферментную активность при 64°C в течение 10 минут при pH 5,0,

c) выдержки указанной смеси при 58-68°C в течение 10-40 минут,

d) выдержки указанной смеси при 75-80°C в течение 5-20 минут, и

e) отделения сусла от твердых компонентов, причем затирание выполняют в пределах 30-70 минут.

2. Способ по п.1, в котором температуру при переходе от стадии c) к стадии d) повышают за период до 20 минут.

3. Способ по п.1, в котором количество сбраживаемого сахара в сусле составляет более 75% растворимых углеводов.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором пуллуланаза происходит из Bacillus.

5. Способ по любому из пп.1-3, в котором пуллуланаза имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 1.

6. Способ по любому из пп.1-3, в котором солодом является ячменный солод.

7. Способ по п.1, в котором количество сбраживаемого сахара в сусле составляет более 80% растворимых углеводов.

8. Способ по любому из пп.1-3,7, в котором отношение мальтозы к глюкозе в сусле выше чем 2:1.

9. Способ производства пива, включающий производство сусла способом по любому из пп.1-8 и сбраживание сусла.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способам, включающим укороченные режимы затирания для производства пивного сусла и для производства пива.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Способы пивоварения широко известны в данной области техники и обычно включают стадии солодоращения, затирания и сбраживания. Затирание является процессом превращения крахмала из соложеных зерен и твердых добавок в сбраживаемые и несбраживаемые сахара для производства сусла желаемого состава. Процесс затирания проводят в течение периода времени при различных температурах для активации эндогенных ферментов, ответственных за деструкцию белков и углеводов. Вне всяких сомнений, самым важным изменением, вызываемым при затирании, является превращение молекул крахмала в сбраживаемые сахара, однако ферменты, вызывающие такое превращение, имеют различный температурный оптимум, и необходимо нагревать затор до различных температур, при которых ферменты работают оптимально.

При конкретной температуре для надлежащего воздействия ферментов им требуется определенный временной интервал, этот период времени часто называют ферментной выдержкой, например, (паузой для осахаривания). Эти ферментные выдержки требуют много времени и проявляют тенденцию к созданию узких мест в процессе пивоварения, поэтому для процесса затирания с наибольшей эффективностью и рентабельностью период ферментной выдержки должен быть по возможности коротким.

Однако эффективность распада крахмала во время затирания зависит, например, от времени и температуры ферментных выдержек, самого крахмала (типа, степени солода и т.д.) и уровней и активности деструктурирующих крахмал ферментов в заторе. После достижения крахмалом температуры клейстеризации, которая является температурой, при которой крахмал полнодоступен для амилаз, обычно составляющей приблизительно 58-62°C, гидролиз крахмала развивается очень быстро. При этой температуре альфа-амилаза является относительно стабильной, тогда как бета-амилаза и деветвящие ферменты, такие как пуллуланазы, являются более термолабильными и начинают инактивироваться. Поэтому обычно применяется контролируемое ступенчатое повышение температуры, при котором каждая ступень благоприятствует одному ферментативному действию по сравнению с другим, в процессе затирания, деструктурирующим, в конечном счете, белки, клеточные стенки и крахмал. Следовательно, затирание требует много времени при пивоварении. На большинство процессов затирания затрачивается по меньшей мере 90 минут, и эти процессы включают паузы при приблизительно 45-52°C, приблизительно 62°C и приблизительно 72°C.

Сочетание температуры и длительности ферментных выдержек оказывает влияние на отношение сбраживаемых сахаров к несбраживаемым сахарам в сусле, а следовательно, как на сбраживаемость сусла, так и на результирующий букет и аромат полученного при брожении напитка.

В WO2005121305 описывается процесс затирания, при котором добавляют комбинацию ферментов - альфа-амилазы, гликоамилазы и изоамилазы - для производства сусла, при брожении которого можно получить низкоуглеродный напиток.

В WO2007144393 описывается способ производства сусла, в котором в затор добавляют пуллуланазу.

Gregor и др. (Journal of Cereal Science, Vol. 29, page 161-169, 1999) описывают взаимодействие во время процесса затирания преобразующих крахмал ферментов: альфа-амилазы, бета-амилазы и предельной декстриназы.

Odibo и Obi (1989 Mircen Journal, 5(2) 187-192) описывают способ приготовления затора из приготовленного из сорго солода, включающий добавление термостабильной микробной пуллуланазы. Общее время затирания составило 126 минут.

Существует потребность в улучшенных способах, в соответствии с которыми время затирания является по возможности коротким для их эффективностей и рентабельностей.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения с удивлением обнаружили, что при добавлении термостабильного деветвящего фермента ферментные выдержки во время затирания можно сократить или исключить, тем самым делая процесс производства сусла заметно более быстрым. Соответственно, настоящим изобретением обеспечивается способ производства сусла, включающий стадии

a) смешивания зернового материала с водой,

b) добавления деветвящего фермента, причем указанный деветвящий фермент имеет более чем 60%-ную ферментную активность при 64 C в течение 10 минут при pH 5,0,

c) выдержки указанной смеси при 58-68°C в течение 10-40 минут,

d) выдержки указанной смеси при 72-80°C в течение 5-20 минут, и

e) отделения сусла от твердых компонентов.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к суслу или пиву, произведенному способом настоящего изобретения. Настоящее изобретение также относится к применению фермента по изобретению в любом из способов по изобретению.

Помимо укорочения процесса затирания ферменты по изобретению можно было бы также добавить в способ производства сусла с высоким содержанием сбраживаемых сахаров.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу производства сусла, включающему стадии

a) смешивания зернового материала с водой, причем зерновой материал содержит по меньшей мере 50% солода,

b) добавления деветвящего фермента, причем указанный деветвящий фермент имеет более чем 60%-ную ферментную активность при 64°C в течение 10 минут при pH 5,0, и выдержки указанной смеси при 58-68°C,

с) повышения температуры до 72-80°C и выдержки указанной смеси при 72-80°C, и

d) отделения сусла от твердых компонентов,

причем количество сбраживаемого сахара составляет более 75% растворимых углеводов.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к суслу, изготовленному из 50-100% солода и 0-50% крахмалсодержащей добавки, в котором количество сбраживаемого сахара составляет более 75% растворимых углеводов, или к суслу, произведенному способом по изобретению, причем количество сбраживаемых сахаров в сусле составляет по меньшей мере 75% растворимых углеводов.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

На всем протяжении этого описания используются различные термины, которые обычно понятны специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники. Некоторые термины описаны шире в разделе «Подробное описание». Короткое определение некоторых из часто используемых терминов приведено ниже.

В этом контексте термин «ферментные выдержки» или просто «выдержки (паузы)» или «выдерживание» является периодом времени или временным интервалом, в течение которого затор, являющийся смесью зернового материала и воды и необязательно добавок, держат при определенной температуре для воздействия ферментов (эндогенных и необязательно экзогенных) на крахмал.

Используемый здесь термин «зерновой материал» означает углеводосодержащий материал, который является основой для производства пива, например, ячменный солод и зерновую добавку.

Под термином «солод» подразумевается любое соложеное зерно, особенно ячмень.

Под термином «сусло» подразумевается не подвергшийся брожению жидкий оттек после экстракции зернового материала во время затирания.

Под термином «пиво» подразумевается сброженное сусло.

Термин «идентичность» является родством между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями. Для целей настоящего изобретения степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют, используя алгоритм Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), внедренный в программу Needle пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277), предпочтительно версии 3.0.0 или более современной. Необязательными используемыми параметрами являются штраф за включение пропуска - 10, штраф за удлинение пропуска - 0,5 и подстановочная матрица EBLOSUM62 (версия EMBOSS - BLOSUM62). Результат в виде обозначенной Needle наиболее продолжительной идентичности (полученной, используя не короткую команду) используют в качестве идентичности в процентах и рассчитывают следующим образом: (Идентичные остатки × 100)/(Длина совмещения - Общее число пропусков при совмещении).

Для целей настоящего изобретения степень идентичности между двумя дезоксирибонуклеотидными последовательностями определяют, используя алгоритм Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, выше), внедренный в программу Needle пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно версии 3.0.0 или более современной. Необязательными используемыми параметрами являются штраф за включение пропуска - 10, штраф за удлинение пропуска - 0,5 и подстановочная матрица EDNAFULL (версия EMBOSS - NCBI NUC4.4). Результат в виде обозначенной Needle "наиболее продолжительной идентичности (полученной, используя - не короткую команду) используют в качестве идентичности в процентах и рассчитывают следующим образом: (Идентичные дезоксирибонуклеотиды × 100)/(Длина совмещения - Общее число пропусков при совмещении).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В процессе пивоварения условия затирания, такие как температура, pH и количество ферментов, и период времени, в течение которого эти ферменты воздействуют на крахмал, (например, ферментная выдержка), имеют большое значение в выходе подвергшейся брожению продукции. При производстве пива тип произведенного пива сильно зависит от продолжительности и температуры ферментных выдержек.

Затирание

В данный момент авторы настоящего изобретения с удивлением обнаружили, что при использовании термостабильного деветвящего фермента ферментные выдержки при затирании можно сократить или исключить. Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к способу производства сусла, включающему стадии

a) смешивания зернового материала с водой,

b) добавления деветвящего фермента, причем указанный деветвящий фермент имеет более чем 60%-ную ферментную активность при 64°C в течение 10 минут при pH 5,0,

c) выдержки указанной смеси при 58-68°C в течение 10-40 минут,

d) выдержки указанной смеси при 72-80°C в течение 5-20 минут, и

e) отделения сусла от твердых компонентов.

В одном варианте осуществления температуру повышают при переходе от стадии c) к стадии d) за 20 минут.

В другом варианте осуществления стадии b)-d) выполняют за 30-70 минут.

Температурный профиль

Авторы настоящего изобретения установили, что добавление термостабильного деветвящего фермента уменьшает продолжительность ферментных выдержек во время затирания и/или исключает число необходимых ферментных выдержек, тем самым значительно сокращая общее время затирания.

В настоящем изобретении стадию c) способа в соответствии с первым аспектом предпочтительно выполняют при температуре, составляющей 58-68°C, например, 59-67°C, например, 60-66°C, например, 61-65°C, например, 62-64°C, например, 63-64°C, предпочтительно температура составляет 63-65°C, например, 64°C.

Смесь, которая представляет собой зерновой материал, смешанную с водой, выдерживают при температуре, выбираемой из вышеотмеченных температурных интервалов, в течение 10-40 минут, например, 11-39 минут, например, 12-38 минут, например, 13-37 минут, например, 14-36 минут, например, 15-35 минут, например, 16-34 минут, например, 17-33 минут, например, 18-32 минут, например, 19-31 минут, например, 20-30 минут, например, 21-29 минут, например, 22-28 минут, например, 23-27 минут, например, 24-26 минут, например, 25-26 минут. В предпочтительном варианте осуществления смесь выдерживают в течение 15-35 минут, в более предпочтительном варианте осуществления смесь выдерживают в течение 20-30 минут, в даже более предпочтительном варианте осуществления смесь выдерживают в течение 25-30 минут, в наиболее предпочтительном варианте осуществления смесь выдерживают в течение 15-30 минут.

Предпочтительно температуру при переходе от стадии c) к стадии d) в способе в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения повышают на 1°C/мин. Таким образом, в одном варианте осуществления температуру повышают при переходе от стадии c) к стадии d) за период до 20 минут, например, за 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, или 4 минуты.

На стадии d) смесь выдерживают при температуре, составляющей 72-80°C, например, 73-79°C, например, 74-78°C, например, 75-78°C, например, 76-78°C, предпочтительно, например, 77-78°C, за 5-20 минут, например, в течение 6-19 минут, например, в течение 7-18 минут, например, в течение 8-17 минут, например, в течение 9-16 минут, например, в течение 10-15 минут, например, в течение 11-14 минут, например, в течение 12-13 минут, например, в течение 10-20 минут, предпочтительно температуру не меняют в течение 10-15 минут.

Процесс затирания можно было бы разделить на три части: начало затирания, когда зерновой материал вносят в емкость и смешивают с водой, затирание, когда поставляемые ферменты, как эндогенные, так и экзогенные, деструктурируют крахмал, и окончание затирания, когда температуру повышают, и смесь можно перенести в фильтрационный чан.

Таким образом, в случае одной цели настоящего изобретения затирание способа в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, которое представляет собой стадии b)-d), выполняют в пределах 30-70 минут, например, в пределах 31-69 минут, например, в пределах 32-67 минут, например, в пределах 33-66 минут, например, в пределах 34-65 минут, например, в пределах 35-64 минут, например, в пределах 36-63 минут, например, в пределах 37-62 минут, например, в пределах 38-61 минут, например, в пределах 39-60 минут, например, в пределах 40-59 минут, например, в пределах 41-58 минут, например, в пределах 42-57 минут, например, в пределах 43-56 минут, например, в пределах 44-55 минут, например, в пределах 45-54 минут, например, в пределах 46-53 минут, например, в пределах 47-52 минут, например, в пределах 48-51 минут, например, в пределах 49-50 минут. В особенно предпочтительном варианте осуществления затирание выполняют в пределах 70 минут, более предпочтительно, в пределах 60 минут, более предпочтительно, в пределах 50 минут, даже предпочтительнее, в пределах 40 минут или более предпочтительно, в пределах 30 минут.

Таким образом, в этом контексте время затирания включает все ферментные выдержки и все стадии нагревания, например, все стадии b)-d) способов производства сусла по изобретению выполняют в пределах определенного выше периода времени.

В определенном аспекте способ в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения выполняют в пределах 30-70 минут. Т.е. все стадии a)-e) выполняют в пределах 30-70 минут, например, 40-60 минут, например, в пределах 60 минут, например, в пределах 50 минут, и, например, в пределах 45 минут.

Таким образом, в соответствии с особым аспектом настоящего изобретения выдержка при 45-52°C не требуется.

В этом контексте затраченное в процессе затирания время является таким же, как и общее время затирания, и время, необходимое для выполнения всех стадий затирания способов по изобретению, например, стадий b)-d). Термины «профили затирания», «затирание», «режим затирания», «время затирания» и «процесс затирания» используются взаимозаменяемо.

Термостабильный фермент

В этом контексте термостабильным ферментом является фермент, имеющий более чем 60%-ную ферментную активность при 64 C в течение 10 минут при pH 5.

В варианте выполнения, ферментная активность составляет более 60%, например, она выше 61%, например, выше 62%, например, выше 63%, например, выше 64%, например, выше 65%, например, выше 66%, например, выше 67%, например, выше 68%, например, выше 69%, например, выше 70%, например, выше 71%, например, выше 72%, например, выше 73%, например, выше 74%, например, выше 75%, например, выше 76%, например, выше 77%, например, выше 78%, например, выше 79%, например, выше 80%, например, выше 81%, например, выше 82%, например, выше 83%, например, выше 84%, например, выше 85%, например, выше 86%, например, выше 87%, например, выше 88%, например, выше 89%, например, выше 90%, например, выше 91%, например, выше 92%, например, выше 93%, например, выше 94%, например, выше 95%, например, выше 96%, например, выше 97%, например, выше 98%, например, выше 99% и даже составляет 100% при 64 C в течение 10 минут при pH 5,0.

В особом варианте осуществления настоящего изобретения фермент обладает, как минимум, 80% активности после 10 мин в заторе при 64 C при уровне pH, составляющем 5,6-6,2, например, его активность составляет выше 85%, например, выше 90%, например, выше 95% и даже составляет 100%. Следует заметить, что во время затирания pH затора колеблется между 5,6 и 6,2. Конкретнее, он колеблется между 5,6 и 5,8.

В другом варианте осуществления фермент обладает, как минимум, 80% активности после 10 мин при температуре клейстеризации ячменного солода, например, его активность составляет выше 85%, например, выше 90%, например, выше 95% или даже составляет 100%.

Зерновой материал

В соответствии с настоящим изобретением зерновой материал может содержать любой крахмал, получаемый из любого растения и части растения, включающей клубни, корни, стебли, листья и семена. Предпочтительно, когда зерновой материал включает зерно, такое как зерно ячменя, пшеницы, ржи, овса, кукурузы, риса, сорго, проса и сорго, и более предпочтительно, когда по меньшей мере 50%, например, по крайне мере 60%, например, по меньшей мере 70%, например, по меньшей мере 80%, например, по меньшей мере 90% или даже 100% (в весовом отношении) зернового материала сусла получают из зерна.

Зерновой материал в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения включает крахмалсодержащее соложеное зерно и/или зерновую добавку. Зерновой материал может включать предпочтительно от 0% до 100%, предпочтительно от 20% до 100%, предпочтительно от 30% до 100%, более предпочтительно, от 40% до 100%, даже предпочтительнее, от 50% до 100%, еще предпочтительнее, от 60% до 100%, например, от 70% до 100%, например, от 80% до 100%, или даже предпочтительнее, от 90% до 100% соложеного зерна. В конкретном варианте выполнения, зерновой материал включает по меньшей мере 50% соложеного зерна, например, соложеного ячменя, и приблизительно 50% зерновой добавки, например, несоложеного зерна, например, несоложеного ячменя. В другом варианте выполнения, зерновой материал включает по меньшей мере 60% соложеного зерна, в еще одном варианте осуществления зерновой материал включает по меньшей мере 70% соложеного зерна, в особом варианте осуществления зерновой материал включает по меньшей мере 80% соложеного зерна, или даже предпочтительнее, когда зерновой материал включает по меньшей мере 90% соложеного зерна, или даже предпочтительнее, когда зерновой материал включает по меньшей мере 95% соложеного зерна, а в определенном предпочтительном варианте выполнения зерновой материал включает 100% соложеного зерна. В контексте настоящего изобретения «100% соложеный» упоминают как «полностью солодовый». Следовательно, полностью солодовый затор представляет собой затор, включающий 100% соложеного зерна. Используемым по изобретению зерном может быть любое зерно, а предпочтительно соложеное зерно, выбираемое из соложеного ячменя, пшеницы, ржи, сорго, проса, кукурузы и риса, и наиболее предпочтительно соложеный ячмень. В одном варианте настоящего изобретения в качестве зерновой добавки может использоваться предварительно клейстеризованный крахмал, например, ячменя, пшеницы, ржи, сорго, проса, кукурузы и риса.

Используемые в способе по изобретению зерновые материалы могут «модифицироваться» до такой степени, в которой молекулы крахмала в зерне состоят из простых цепей молекул сахаров в сравнении с разветвленными цепями, полностью модифицированное зерно содержит только молекулы крахмала с простыми цепями. Для не полностью модифицированного зерна требуется многостадийное затирание для воздействия деветвящих ферментов на ветвления. Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения зерновой материал включает полностью модифицированный соложеный зерновой материал.

Солод

Солодоращение является процессом проращивания зерен хлебных злаков, который обычно начинается в результате отмачивания зерен в воде. Процесс можно приостановить посредством нагревания сухим горячим воздухом. Таким образом, под термином «солод» подразумевается любое соложеное зерно хлебных злаков. Используемое по изобретению соложеное зерно может быть любым соложеным зерном, а предпочтительно соложеным зерном, выбираемым из соложеного ячменя, пшеницы, ржи, сорго, проса, кукурузы и риса, и наиболее предпочтительно является соложеным ячменем.

Хорошее качество солода даст пивовару высокие уровни экстракта и позволит приготовить сусло, которые легко сбраживается дрожжами.

Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения исходным материалом является чисто солодовый затор, который в этом контексте является 100% соложеными зернами.

Добавка

Под добавкой подразумевается часть зернового материала, которая не является соложеными зернами. Добавка может включать любой, богатый крахмалом растительный материал, например, несоложеное зерно, такое как ячмень, рис, кукуруза, пшеница, рожь, сорго, и легко сбраживаемый сахар и/или сироп. Используемую в способе первого аспекта добавку можно получить из клубней, корней, стеблей, листьев, стручков, хлебных злаков и/или целого зерна. Добавка может включать нерафинированный и/или рафинированный крахмал и/или сахаросодержащий материал, происходящий из растений, вроде пшеницы, ржи, овса, кукурузы, риса, сорго, проса, сорго, картофеля, сладкого картофеля, маниока, тапиока, саго, банана, сахарной свеклы и/или сахарного тростника. Предпочтительно, когда добавка включает несоложеное зерно, например, несоложеное зерно, выбираемое из списка, состоящего из ячменя, пшеницы, ржи, сорго, проса, кукурузы и риса, а наиболее предпочтительно несоложеный ячмень.

RDF (истинная степень сбраживания)

В одном варианте осуществления настоящего изобретения термостабильный деветвящий фермент по изобретению добавляют в способ производства сусла, в котором исходным материалом является зерновой материал с по меньшей мере 50% солода, а сбраживаемые сахара в произведенном сусле составляют по меньшей мере 75% растворимых углеводов.

Таким образом, один аспект настоящего изобретения имеет отношение к способу, включающему стадии

a) смешивания зернового материала с водой, причем зерновой материал включает по меньшей мере 50% солода,

b) добавления деветвящего фермента, причем указанный деветвящий фермент имеет более чем 60%-ную ферментную активность, при 64°C в течение 10 минут при pH 5,0, и выдержки указанной смеси при 58-68°C,

c) повышения температуры до 72-80°C и выдержки указанной смеси при 72-80°C, и

d) отделения сусла от твердых компонентов,

причем количество сбраживаемого сахара составляет более 75% растворимых углеводов.

Сбраживаемые и несбраживаемые сахара

Во время цикла затирания крахмал сначала растворяют, а затем часть молекул крахмала гидролизуется на несбраживаемые декстрины и до низкомолекулярных сахаров, таких как глюкоза, мальтоза и мальтотриоза, которые пивные дрожжи могут сбраживать в этанол. Несбраживаемой фракцией или фракцией предельных декстринов являются сахара с более высокой степенью полимеризации (DP), чем у мальтотриозы, которая имеет DP4 и более высокую DP. Во время процесса затирания декстрин гидролизуется на сбраживаемые сахара с помощью бета-амилазы, которая последовательно удаляет единицы мальтозы с редуцирующего конца декстринов. Однако точки ветвления (1 6)- являются устойчивыми к атакам амилаз, и эти точки ветвления (предельный декстрин) необходимо гидролизовать с помощью деветвящих ферментов, таких как пуллуланаза, предельная декстриназа и изоамилаза.

DP является степенью полимеризации, используемой здесь для среднего числа единиц глюкозы в полимерах в полисахаридном гидролизате. Таким образом, сахар с DP1-3 является по изобретению сбраживаемым сахаром, который может быть глюкозой (DP1), мальтозой (DP2) или мальтотриозой (DP3), тогда как, например, декстрины (DP4) являются несбраживаемым сахаром.

RDF (истинную степень сбраживания) рассчитывают согласно формуле RDF%=100*(OE%P-ER%P)/OE%P, где OE%P означает %P в массовой доле сухих веществ в начальном сусле, а ER%P означает %P в действительном содержании экстрактивных веществ, определяемом с помощью денситометра (эталон - Analytica EBC).

В соответствии с настоящим изобретением количество сбраживаемого сахара в сусле составляет более 75% растворимых углеводов, например, по меньшей мере 76%, например, по меньшей мере 77%, например, по меньшей мере 78%, например, по меньшей мере 79%, например, по меньшей мере 80%, например, по меньшей мере 81%, например, по меньшей мере 82%, например, по меньшей мере 83%, например, по меньшей мере 84%, например, по меньшей мере 85%, например, по меньшей мере 86%, например, по меньшей мере 87%, например, по меньшей мере 88%, например, по меньшей мере 89%, например, по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 91%, например, по меньшей мере 92%, например, по меньшей мере 93%, например, по меньшей мере 94%, например, по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 96%, например, по меньшей мере 97%, например, по меньшей мере 98%, например, по меньшей мере 99%, например, 100%.

Некоторые пивовары добавляют в сусловарочный котел пивное сусло, например, с высоким содержанием мальтозы, которое может увеличить количество сбраживаемых сахаров. Однако, хотя пивное сусло можно добавлять в соответствии с настоящим изобретением, это не является необходимым для увеличения степени сбраживаемых сахаров или RDF.

Во время процесса затирания крахмал превращается в сусло, содержащее сбраживаемые и несбраживаемые сахара. В соответствии с настоящим изобретением процесс затирания можно значительно укоротить, и настоящее изобретения позволяет пивоварам использовать очень простые профили затирания без понижения сбраживаемости сусла. В качестве примера, стадия затирания, выполняемая при 45-52°C, больше не нужна для производства сусла, в котором количество сбраживаемого сахара в сусле составляет более 75% растворимых углеводов.

Авторы настоящего изобретения, кроме того, установили, что термостабильные деветвящие ферменты по изобретению могут использоваться в способе производства сусла, в котором количество сбраживаемого сахара составляет более 75% растворимых углеводов, причем способ включает стадии

a) смешивания зернового материала с водой, причем зерновой материал включает по меньшей мере 50% солода,

b) добавления термостабильного деветвящего фермента,

c) выдержки указанной смеси при 58-68°C в течение 10-40 минут,

d) повышения температуры до 72-80°C,

e) выдержки указанной смеси при 72-80°C в течение 5-20 минут, и

f) отделения сусла от твердых компонентов,

причем количество сбраживаемого сахара в сусле составляет более 75% растворимых углеводов.

Важно, что способы по изобретению имеют отношение к сокращению процесса затирания посредством сокращения или исключения времени, необходимого для ферментных выдержек, и, кроме того, к производству сусла, содержащему высокое количество сбраживаемых сахаров.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением укорочение времени затирания не понижает сбраживаемость сусла, т.е. количество сбраживаемых сахаров в сусле является высоким по сравнению с количеством несбраживаемых сахаров.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения с помощью способа производится сусло с высоким содержанием мальтозы по сравнению с глюкозой. Он является предпочтительным, поскольку он не допускает осмотическое давление на дрожжи и регулирует продукцию сложных эфиров, а, следовательно, вкусовую и букетную характеристику результирующего пива.

Таким образом, другой вариант осуществления настоящего изобретения имеет отношение к способу, в котором отношение мальтозы к глюкозе в сусле выше чем 2:1, например, выше 2,5:1, например, выше 3:1, предпочтительно выше 3,2:1, предпочтительно выше 3,3:1, предпочтительно выше 3,4:1, предпочтительно выше 3,5:1, в особенно предпочтительном варианте осуществления отношение мальтозы к глюкозе выше чем 3,3:1.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к суслу, изготовленному из 50-100% солода и 0-50% крахмалсодержащей добавки, в котором количество сбраживаемого сахара составляет более 75% растворимых углеводов, предпочтительно более 80%, и в котором отношение мальтозы к глюкозе выше чем 2,5:1, предпочтительно 3,3:1.

Еще один вариант осуществления относится к суслу, произведенному способом настоящего изобретения, в котором сбраживаемые сахара в сусле составляют по меньшей мере 75% растворимых углеводов.

Деветвящие ферменты

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения пуллуланазная (E.C.3.2.1.41) ферментная активность поставляется экзогенно и присутствует в заторе. Пуллуланазу можно добавить к ингредиентам затора, например, воде и/или зерновому материалу до, во время или после образования затора. К затору может быть добавлен дополнительный фермент, выбираемый из группы, состоящей из альфа-амилазы (E.C.3.2.1.1) и/или глюкоамилазы (E.C.3.2.1.3), изоамилазы, протеазы, целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, лакказы, липазы, фосфолиполазы, фитазы, фитина и эстеразы.

Однако авторы настоящего изобретения с удивлением обнаружили, что способы по изобретению, например, короткое затирание, можно выполнить с использованием лишь деветвящего фермента по изобретению. Таким образом, в одном аспекте изобретения к затору добавляют только деветвящий фермент.

В соответствии с настоящим изобретением деветвящие ферменты включают изоамилазы и пуллуланазы. Деветвящие ферменты, атакующие амилопектин, делятся на два класса: изоамилазы (E.C.3.2.1.68) и пуллуланазы (E.C.3.2.1.41), соответственно. Изоамилаза гидролизует альфа-1,6-D-гликозидные связи ветвей в амилопектине и бета-предельных декстринах, и ее можно отличить от пуллуланаз по ее неспособности атаковать пуллулан и по ограниченному воздействию на альфа-предельные декстрины.

Пуллуланаза (E.C. 3.2.1.41)

Наиболее предпочтительно, когда пуллуланаза происходит из Bacillus acidopullulyticus. Предпочтительный фермент пуллуланаза, используемый в способах и/или композициях настоящего изобретения, представляет собой пуллуланазу, имеющую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, например, на по меньшей мере 55%, например, на по меньшей мере 60%, например, на по меньшей мере 65%, например, на по меньшей мере 66%, например, на по меньшей мере 70%, например, на по меньшей мере 75%, например, на по меньшей мере 80%, например, на по меньшей мере 85%, например, на по меньшей мере 86%, например, на по меньшей мере 87%, например, на по меньшей мере 88%, например, на по меньшей мере 89%, например, на по меньшей мере 90%, например, на по меньшей мере 91%, например, на по меньшей мере 92%, например, на по меньшей мере 93%, например, на по меньшей мере 94%, например, на по меньшей мере 95%, например, на по меньшей мере 96%, например, на по меньшей мере 97%, например, на по меньшей мере 98%, например, на по меньшей мере 99% или даже на 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1; в частности, после совмещения, используя программу Needle с использованием матрицы: BLOSUM62; штрафа за включение пропуска: 10,0; штрафа за удлинение пропуска: 0,5; матрицы идентичности без пропусков.

Предпочтительно, когда пуллуланазы, используемые в способах по изобретению, представляют собой пуллуланазу, например, из Pyrococcus или Bacillus sp., например, Bacillus acidopullulyticus (например, пуллуланазу, описанную в FEMS Microbiol. Letters 1 15: 97-106) или Bacillus deramificans, или Bacillus naganoencis. Пуллуланазы могут также быть сконструированными пуллуланазами, например, из штамма Bacilllus.

Другие пуллуланазы, которые предпочтительно используются в способах по изобретению, включают пуллуланазу Bacillus deramificans (патент США № 5736375), или пуллуланаза может происходить из Pyrococcus woesei, описанного в PCT/DK91/00219, или пуллуланаза может происходить из Fervidobacterium sp. Ven 5, описанного в PCT/DK92/00079, или пуллуланаза может происходить из Thermococcus celer , описанного в PCT/DK95/00097, или пуллуланаза может происходить из Pyrodictium abyssei, описанного в PCT/DK95/00211, или пуллуланаза может происходить из Fervidobacterium pennavorans , описанного в PCT/DK95/00095, или пуллуланаза может происходить из Desulforococcus mucosus, описанного в PCT/DK95/00098.

Пуллуланазу добавляют в дозе, составляющей 0,1-3 PUN/г DM (сухого вещества), например, 0,2-2,9, например, 0,3-2,8, например, 0,3-2,7, например, 0,3-2,6, например, 0,3-2,5, например, 0,3-2,4, например, 0,3-2,3, например, 0,3-2,2, например, 0,3-2,1, например, 0,3-2,0, например, 0,3-1,9, например, 0,3-1,8, например, 0,3-1,7, например, 0,3-1,6, наиболее предпочтительно, пуллуланазу добавляют в такой дозе, как 0,3-1,5, предпочтительно 0,4-1,4, более предпочтительно, 0,5-1,3, более предпочтительно, 0,6-1,2, более предпочтительно, 0,7-1,1, более предпочтительно, 0,8-1,0, более предпочтительно, 0,9-1,0. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения фермент добавляют в дозе, составляющей 0,3 PUN/г DM, например, 0,4 PUN/г DM, например, 0,5 PUN/г DM. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения доза фермента не превышает 1 PUN/г DM.

Изоамилаза (E.C.3.2.1.68)

Другим ферментом, применяемым в способах и/или композициях настоящего изобретения, может быть альтернативный деветвящий фермент, такой как изоамилаза (E.C.3.2.1.68). Изоамилаза может быть микробной. Изоамилаза гидролизует альфа-1,6-D-гликозидные связи ветвей в амилопектине и бета-предельных декстринах, и ее можно отличить от пуллуланаз по ее неспособности атаковать пуллулан и по ограниченному воздействию на альфа-предельные декстрины. Изоамилазу можно добавлять в эффективных количествах, хорошо известных квалифицированному в данной области техники специалисту. Изоамилазу можно добавлять отдельно или вместе с пуллуланазой.

Необязательные ферменты

Альфа-амилаза (EC3.2.1.1)

Фермент альфа-амилаза может также быть экзогенным, микробным, и добавляться в способы и/или композиции настоящего изобретения. Альфа-амилаза может быть альфа-амилазой Bacillus. Широко известные альфа-амилазы Bacillus включают альфа-амилазу, происходящую из штамма B. licheniformis, B. amyloliquefaciens и B. stearothermophilus. В контексте настоящего изобретения предусматриваемой альфа-амилазой Bacillus является альфа-амилаза, описанная в WO 99/19467 на стр. 3, строка 18 - стр. 6, строка 27. Предпочтительная альфа-амилаза имеет аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 4 в WO 99/19467 на по меньшей мере 90%, например, на по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или особенно на по меньшей мере 99%. Наиболее предпочтительная мальтогенная альфа-амилаза представляет собой SEQ ID NO: 9 или включает ее варианты, описанные в WO 99/43794. Предусматриваемые варианты и гибриды описаны в WO 96/23874, WO 97/41213 и WO 99/19467. В частности, предусматривается альфа-амилаза (E.C.3.2.1.1) из B. stearothermophilus, имеющая аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 3 в WO 99/19467 с мутациями: I181*+G182*+N193F. Альфа-амилазы Bacillus можно добавлять в количествах, составляющих 1,0-1000 NU/кг DS, предпочтительно 2,0-500 NU/кг DS, предпочтительно 10-200 NU/кг DS. Другой конкретной альфа-амилазой, используемой в способах настоящего изобретения, может быть любая альфа-амилаза грибов, например, альфа-амилаза, происходящая из видов Aspergillus, а предпочтительно из штамма Aspergillus niger. В частности, предусматриваются альфа-амилазы грибов, которые демонстрируют значительную идентичность, т.е. идентичность на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или даже на по меньшей мере 90%, с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 1 в WO 2002/038787. Альфа-амилазы грибов можно добавлять в количестве, составляющем 1-1000 AFAU/кг DS, предпочтительно 2-500 AFAU/кг DS, предпочтительно 20-100 AFAU/кг DS.

Глюкоамилазы (E.C.3.2.1.3)

Глюкоамилаза, которую можно использовать в способах настоящего изобретения, может происходить из микроорганизма или растения. Предпочтительными являются глюкоамилазы грибного происхождения, например, Aspergillus glucoamylases, особенно глюкоамилаза A. niger G1 или G2 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102). Предпочтительными также являются их варианты, такие как те, которые описаны в WO92/00381 и WO00/04136; глюкоамилаза A. awamori (WO84/02921), глюкоамилаза A. oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949), или их варианты или фрагменты. Предпочтительные глюкоамилазы включают глюкоамилазы, происходящие из Aspergillus niger, такие как глюкоамилаза, гомологичная на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или даже 90% аминокислотной последовательности, представленной в WO00/04136, и SEQ ID NO: 13. Также предпочтительными являются глюкоамилазы, происходящие из Aspergillus oryzae, такие как глюкоамилаза, гомологичная на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или даже 90% аминокислотной последовательности, представленной в WO00/04136, SEQ ID NO: 2. Другие предпочтительные глюкоамилазы включают глюкоамилазы Talaromyces, в частности, происходящие из Talaromyces emersonii (WO99/28448), Talaromyces leycettanus (патент США № Re.32,153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (патент США № 4587215), Clostridium, в частности, C. thermoamylolyticum (EP135138) и C. thermohydrosulfuricum (WO86/01831). Имеющиеся в продаже композиции, включающие глюкоамилазу, включают AMG 200L; AMG 300 L; SAN^TM SUPER, SAN EXTRA L и AMG^TM E (от Novozymes A/S); OPTIDEX^TM 300 (от Genencor Int.); AMIGASE^TM и AMIGASE^TM PLUS (от DSM); G-ZYME^TM G900, G-ZYME^TM и G990 ZR (от Genencor Int.). Глюкоамилазную активность можно использовать в количествах, составляющих от 0,1 до 100000 AGU/кг DS, предпочтительно в количествах, составляющих от 1 до 10000 AGU/кг DS, более предпочтительно в количествах, составляющих от 10 до 1000 AGU/кг DS, например, от 100 до 500 AGU/кг DS. Глюкоамилазу можно добавлять в количестве, составляющем от 0,001 мг до 100000 мг EP/кг DS, предпочтительно в количестве, составляющем от 0,01 мг до 10000 мг EP/кг DS, более предпочтительно, в количестве, составляющем от 0,1 мг до 1000 мг EP/кг DS, наиболее предпочтительно, в количестве, составляющем от 1 мг до 100 мг EP/кг DS.

Протеаза

Подходящие протеазы включают микробные протеазы, такие как протеазы грибов и бактерий. Предпочтительными протеазами являются кислые протеазы, т.е. протеазы, характеризующиеся способностью гидролизовать белки в кислотных условиях при рН, который ниже 7.

Протеазы ответственны за уменьшение общей длины высокомолекулярных белков до низкомолекулярных белков в заторе. Низкомолекулярные белки необходимы для питания дрожжей, а высокомолекулярные белки обеспечивают стабильность пены. Поэтому квалифицированному специалисту хорошо известно, что протеазу следует добавлять в пропорциональном количестве, которое в одно и то же время делает возможным поступление свободных аминокислот для дрожжей и оставляет достаточно высокомолекулярных белков для стабилизации пены. Протеазы можно добавлять в количествах, составляющих 0,1-1000 AU/кг DS, предпочтительно 1-100 AU/кг DS и наиболее предпочтительно 5-25 AU/кг DS.

Целлюлаза (E.C.3.2.1.4)

Целлюлаза может быть микробного происхождения, например, она может происходить из штамма нитчатого гриба (например, Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Fusarium). Конкретные примеры целлюлаз включают эндоглюканазу (эндоглюканазу I), получаемую из H. insolens и, кроме того, определяемую по аминокислотной последовательности фиг. 14 в WO 91/17244, и эндоглюканазу с М.м. 43 кДа H. insolens , описанную в WO 91/17243.

Конкретной целлюлазой, используемой в способах настоящего изобретения, может быть эндоглюканаза, такая как эндо-1,4-бета-глюканаза. В частности, предусматривается бета-глюканаза, представленная в SEQ ID NO: 2 в WO 2003/062409 и гомологичных последовательностях. Имеющиеся в продаже целлюлазные препараты, которые можно использовать, включают CELLUCLAST®, CELLUZYME®, CEREFLO® и ULTRAFLO® (доступные от Novozymes A/S), LAMINEX^TM и SPEZYME® CP (доступные от Genencor Int.) и ROHAMENT® 7069 W (доступный от Rohm, Германия). Бета-глюканазы могут быть добавлены в количествах, составляющих 1,0-10000 BGU/кг DS, предпочтительно 10-5000 BGU/кг DS, предпочтительно 50-1000 BGU/кг DS и наиболее предпочтительно 100-500 BGU/кг DS.

Отделение сусла

Получение сусла из затора обычно включает отделение сусла от твердых компонентов, таких как барда, т.е. нерастворимого зернового и пленочного материала, образующего часть зернового материала. Барду можно промыть горячей водой для выполаскивания, или промывки, любого остающегося экстракта из зернового материала.

После отделения сусла от барды зернового материала любого из вышеотмеченных вариантов осуществления первого аспекта сусло можно использовать в неизменном виде, или из него можно удалить воду для обеспечения концентрированного и/или сухого сусла. Концентрированное и/или сухое сусло можно использовать в качестве экстракта для пивоварения, в качестве ароматизатора мальц-экстракта, для безалкогольных солодовых напитков, солодового уксуса, готового завтрака, для кондитерских изделий и т.д.

Производство пива

В предпочтительном варианте осуществления сусло сбраживают для производства алкогольного напитка, предпочтительно пива, например, эля, крепкого эля, горького пива, стаута, портера, легкого пива, экспортного пива, солодового напитка, крепкого пива, пива низкого солода, высокоалкогольного пива, слабоалкогольного пива, низкокалорийного пива или легкого пива. Сбраживание сусла может включать засевание сусла дрожжевой суспензией, включающей свежие дрожжи, т.е. дрожжи, ранее не используемые для настоящего изобретения, или дрожжи могут быть повторно используемыми дрожжами. Применяемыми дрожжами могут быть любые дрожжи, подходящие для производства пива, особенно дрожжи, выбираемые из Saccharomyces spp., например, S. cerevisiae и S. uvarum, в том числе встречающиеся в природе или искусственно полученные варианты этих организмов. Способы сбраживания сусла для производства пива хорошо известны квалифицированному в данной области техники специалисту.

Способ настоящего изобретения может включать добавление силикатного гидрогеля в сброженное сусло для увеличения стабильности коллоида пива. Способы могут, кроме того, включать добавление кизельгура в сброженное сусло и фильтрацию для придания пиву прозрачности.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения обеспечивается пиво, производимое из сусла второго или третьего аспекта, такое как пиво, производимое посредством сбраживания сусла для производства пива. Пивом может быть пиво любого типа, например, эли, крепкие эли, стауты, портеры, легкое пиво, горькое пиво, экспортное пиво, солодовые напитки, пиво низкого солода, высокоалкогольное пиво, слабоалкогольное пиво, низкокалорийное пиво или легкое пиво.

ПРИМЕРЫ

Пуллуланазная активность (PUN):

Одну пуллуланазную единицу (PUN) определяют как количество фермента, которое способно образовать 1 микромоль глюкозы из субстрата - пуллулана в минуту при 50 C в цитратном буфере с pH 5.

Образцы пуллуланазы инкубируют с субстратом (красным пуллуланом). Эндопуллуланазы гидролизуют альфа-1,6-гликозидные связи в пуллулане, отсоединяя продукты деструкции субстрата. Недеструктурированный субстрат осаждают, используя этанол. Количество отсоединенной краски определяют спектрофотометрически при 510 нм и является пропорциональным эндопуллуланазной активности в образце. Образование краски в образцах сравнивают с образованием краски, вызываемым образцами с известной пуллуланазной активностью.

Пуллуланазой является пуллулан-6-глюканогидролаза с номером в соответствии с классификацией ферментов - E.C.3.2.1.41.

Условия реакции
Температура	50°C±2°C
pH	5,0
Концентрация субстрата	0,67% красного пуллулана
Концентрация фермента	0,04-0,13 PUN/мл
Время реакции	30 мин
Длина волны	510 нм

Реагенты/субстраты

0,5 М раствор калия хлорида

2% субстрат - пуллулан. Поставщик: Megazyme, Австралия

0,05 М цитратный буфер pH 5,0

0,05 М цитратный буфер pH 5,0 с 25 мМ цистеином

99,8% этанол

Стандартный препарат пуллуланазы 904 PUN/г, разведенный в 0,05 М цитратном буфере до серий разведения стандарта от 0,05 до 0,20 PUN/мл.

«Пустышка» - 0,05 М цитратный буфер

Образцы ферментов разводят в 0,05 М цитратном буфере до активности, составляющей 0,06-0,20 PUN/мл, и сравнивают с сериями разведения стандарта.

ПРИМЕР 1

В этом эксперименте состав сахаров укороченного режима затирания исследовали через 15 мин и 30 мин при 64°C и через 15 мин при 78°C. Нагревание с 64°C до 78°C осуществляли со скоростью 1°C/мин, следовательно, в этом случае затор нагревали в пределах 14 минут. Общее время затирания в этом случае складывалось из выдержки при 64°C в течение 30 мин + нагревание до 78°C в течение 14 минут + выдержка при 78°C в течение 15 минут, что в сумме равняется 59 минутам.

Был использован полностью (на 100%) модифицированный солод, а используемым ферментом является пуллуланаза с SEQ ID NO: 1.

Используемой в этом примере пуллуланазой является пуллуланаза с SEQ ID NO: 1, которую добавляли в момент времени t=0 минут (начала затирания) в указанной ниже концентрации.

Таблица 1
Профиль затирания и отбор образцов
Температура (°C)	64°C	78°C
Время (мин)	0-30 мин	30-45 мин
Отбор образцов	Образец 1, 4, 7, 10 через 15 мин Образец 2, 5, 8, 11 через 30 мин	Образец 3, 6, 9, 12 через 45 мин

Доза фермента
Чашка	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
PU	-	-	-	1,0	1,0	1,0	0,5	0,5	0,5	0,1	0,1	0,1
N/г
DM

Таблица 2
Общий сахарный состав образцов сусла
Общий сахар (г/л)	Фермент (PUN/г DM)
130,10	«Пустышка»
130,47	1 PUN
131,18	0,5 PUN
130,71	0,1 PUN

Общее количество сбраживаемых сахаров было одинаковым во всех образцах (78°C/45 мин) (таблица 2).

Таблица 3 демонстрирует, что состав сахаров профиля очень короткого затирания можно улучшить посредством использования пуллуланазы в дозе 0,5 и 1 PUN/г DM. Установлена явная зависимость от дозы пуллуланазы, которую можно использовать в качестве средства для подталкивания конечного сбраживания.

Фракция сбраживаемых сахаров в образце сусла, отобранном после завершения режима затирания, была увеличена на 8,6% (1 PUN/г DM) и 4,9% (0,5 PUN/г DM), крайний столбец таблицы 3.

Таблица 3
Сбраживаемые и несбраживаемые сахара в коротком процессе затирания
64°C/15 минут					64°C/30 минут				78°C/15 минут
DP4	23,0	15,6	17,9	20,1	21,8	13,3	16,0	19,7	22,8	14,2	17,9	21,1
DP3	11,7	14,5	13,7	11,5	12,1	14,9	14,1	12,6	12,4	14,6	14,4	12,7
DP2	55,7	60,6	58,4	54,0	56,3	61,9	60,1	57,3	55,2	59,5	58,4	54,8
DP1	9,6	10,1	10,5	9,9	9,8	10,1	10,6	10,8	9,6	9,4	10,0	9,7
	без фермента k	1 PUN	0,5 PUN	0,1 PUN	без фермента k	1 PUN	0,5 PUN	0,1 PUN	без фермента k	1 PUN	0,5 PUN	0,1 PUN
Сокращения в таблице: DP: степень полимеризации, DP1: глюкоза, DP2: мальтоза, DP3: мальтотриоза, DP4: несбраживаемые сахара, такие как декстрины. PUN: единиц пуллуланазной активности

Значения представлены в процентах DP от общей DP растворимых углеводов.

В таблице 3 представлен состав сахаров очень короткого процесса затирания. Фермент пуллуланазу добавляют к смеси зернового материала и воды, причем смесь имеет температуру, составляющую 64°C, смесь выдерживают в течение 30 мин, и отбирают образцы как через 15, так и через 30 минут. Нагревают раствор на 1°C/мин до 78°C, смесь выдерживают в течение 15 минут при 78°C, и отбирают образец через 15 минут.

Таблица 3 демонстрирует, что при добавлении пуллуланазы в дозе 1 и 0,5 PUN количество сбраживаемых сахаров при 64°C через 15 мин и при 64°C через 30 мин, и при 78°C через 15 минут составляет по меньшей мере 80%. Таким образом, с удивлением было обнаружено, что добавление фермента по изобретению сокращает время затирания и дает сусло с большим количеством сбраживаемых сахаров, например, DP1-3.