фрагмент днк, кодирующей аналог фермента хоризматмутазы / префенатдегидратазы escherichia coli

Формула изобретения

Фрагмент ДНК, кодирующей аналог фермента хоризматмутазы/ префенатдегидратазы Escherichia coli, полученный в результате селекции на резистентность к бета-2-тиенилаланину или 3-фтортирозину клонов, трансформированных плазмидой pSN 302, с последовательностью XYZKMNC, кодирующей аминокислоты 304 310 полипептида, где X ACC, Y GGG, Z CAG, а K, M, N и C отсутствуют, либо X ACC, Y GGG, Z CTA, K CAA, M GCC, N GGT, C GCG, либо X отсутствует, Y AAA, Z отсутствует, K CAA, M GCC, N GGT, C GCG, либо X ACC, Y GGG, Z CTA, K CAA, M GCC, N TGT, C GCG.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится, в основном, к микробиологическому синтезу фенилаланина и, более точно, к новым последовательностям ДНК, кодирующим полипептидные аналоги фермента Е.coli хоризматмутазы/префенатдегидратазы. По сравнению с ферментом дикого типа энзиматические активности аналогов более устойчивы к ингибированию фенилаланином по принципу обратной связи. Последовательности ДНК, кодирующие аналоги, следовательно, полезны в дополнение к энзиматическим микроорганизмам, используемым в продукции фенилаланина.

В микробиологическую продукцию -фенилаланина в Е.coli вовлечены многочисленные метаболические ферменты. Среди наиболее важных из них - бифункциональный фермент хоризматмутаза/префенатдегидратаза /СMPD/, которая вовлечена как в превращение хоризмата в префенат, так и префената в фенилпируват. Определено, что СМРD является продуктом экспрессии гена Е.coli phe A, нуклеотидная последовательность которого сообщена Hudson et al. //J. Mol. Biol. 1984, 180, 1023-1051.

Предполагают, что СМРD энзиматически функционирует в димерной форме, включая в себя два идентичных полипептидных продукта экспрессии гена phe A. Этот фермент предмет ингибирования по типу обратной связи его активностей посредством конечного метаболита, a-фенилаланина. Когда уровень фенилаланина достигает 1,0 мМ, например, имеется драматическое уменьшение дегидратазной активности, возможно, обусловленное участием фенилаланина в обратном образовании энзиматически неактивных полипептидных тетрамеров (См. например: Arch. Biochem. Biophys. 1981, 211, 66-75. При концентрациях фенилаланина около 1,0 мМ префенатдегидратазная активность уменьшается по крайней мене на 90 процентов.

С появлением рекомбинантных технологий для клонирования и экспрессии генов были сделаны попытки увеличить производительность эндогенных СМРD Е.coli клеток хозяина, используемых в продукции фенилаланина (Forberg et al. //J. Biotech. 1988, 7, 319 332; Choi et al. //Biotechnol. Lett. 1982, 8, 223-228; Hwang et al. //App. Microbiol. Biotechnol. 1985, 22, 108-113; Gil et al. //Enzyme Microb. Technol. 1985, 7, 370-372; Park et al. //Chem. Eng. Commyn, 1986, 45, 185-196).

Мутантные штаммы Е.coli, как сообщалось, продуцируют фермент СМРD, существенно независимый от ингибирования фенилаланином. См. например, Fribe, публикуемое австралийское изобретение N 72727/81, Backmann et al. U.S. патент N 4753883. Сообщают, что при трансформации клеток хозяина мутантной последовательностью ДНК, кодирующей аналоги-полипептиды СМРD, которые менее чувствительны к фенилаланиновому ингибированию на той основе, что каталитически критический сегмент CMPD E.coli лежит внутри его N-терминальных 337 аминокислот, чувствительность к фенилаланиновому ингибированию зависит от отдельной аминокислоты триптофан 338 и что делеция 49 С-терминальных аминокислот полностью не нарушает каталитическую активность, но все же существенно нарушает чувствительность к ингибированию конечным продуктом. Backman и др. предлагают усовершенствование плазмидных векторов, включающих последовательности ДНК, кодирующие СМРD с делецией Trp ³³⁸, а также в качестве замены аналоги, включающие Trp³³⁸, и использование таких плазмидных векторов, чтобы трансформировать микробиологические клетки для фенилаланиновой продукции.

Настоящее изобретение обеспечивает новые последовательности ДНК для полипептидов-аналогов СМРD E. coli, чьи префенатдегидратазная и/или хоризматмутазная активности /ферментативные/ менее чувствительны к ингибированию присутствием фенилаланина, чем фермент СМРD E.coli дикого типа. Настоящее изобретение также обеспечивает полипептиды, кодируемые этими последовательностями. В соответствии с настоящим изобретением последовательности ДНК включают последовательности с делецией, заменой и/или добавлением в аналогах аминокислотных остатков с 304 по 310, с СМРD E.coli. Предпочтительные последовательности, кодирующие аналоги, сейчас обозначают следующие полипептиды, причем здесь и в дальнейшем "des" обозначает делецию или отсутствие аминокислотного остатка, с которым она связана: [des - Gln³⁰⁷, des Ala³⁰⁸, des Gly³⁰⁹, des Ala³¹⁰] CMPD; [Leu³⁰⁰] CMPD; [des Thr³⁰⁴, Lys³⁰⁵, des - Gln³⁰⁶] CMPD; и [Cys³⁰⁹] CMPD.

Экспрессионные продукты каждой из этих последовательностей ДНК, кодирующих аналоги, показывают как префенат дегидратазную, так и хоризматмутазную активности, но одна или обе эти энзиматические активности для этих продуктов менее чувствительны к ингибированию в присутствии фенилаланина. Предпочтительный за его устойчивость к ингибированию префенатдегидратазной активности 100 мМ концентрацией фенилаланина экспрессионный продукт [des - Thr³⁰⁴, Lys³⁰⁵, des Gln³⁰⁶] CMPD кодирующей последовательности ДНК. Предпочтительный за его устойчивость к ингибированию хоризматмутазной активности [Cys²⁰⁹] CMPD.

Также представлены настоящим изобретением автономно реплицирующиеся экспрессионные векторы ДНК, включающие последовательности ДНК данного изобретения, функционально ассоциированные с экспрессионными контролирующими последовательностями ДНК (промоторами, операторами и подобными), усиливающими экспрессию (транскрипцию и трансляцию) желаемых CMPD аналогов полипептидов в селектируемой клетке хозяина, например Е. coli, трансформированную этим. Предпочтительные экспрессионные векторы включают ген селектируемого маркера для использования в подтверждение трансформации клетки хозяина и включают промотор, имеющий экспрессионные контролирующие последовательности ДНК, модицифированные между ЕcoRI и НаlII сайтами, как указано в примере 1, и происходящие от последовательностей, функционально ассоциированных с эндогенной экспрессией СМРD фермента Е.coli дикого типа /например, экспрессионные контролирующие последовательности гена Е.coli phe A/.

В то время как предпочтительные Е.coli СМРD последовательности, кодирующие аналоги, в настоящем изобретении были получены химическим мутагенезом, выполненным на векторе, включающем ген Е.coli phe A дикого типа, можно получать последовательности ДНК в соответствии с настоящим изобретением путем сайт-направленного мутагенеза /выполненного, например, на гене phe A дикого типа/ так же, как и путем химического синтеза части или всей СМРD полипептид-кодирующей последовательности.

У последовательностей ДНК данного изобретения, кодирующих делеционные аналоги СМРD, отсутствуют кодоны, соответствующие аминокислотным остаткам внутри района, охватывающего аминокислотные остатки в положениях с 304 по 310 аминокислотной последовательности фермента дикого типа. Делеции могут быть непрерывными или прерывистыми. Согласно данному изобретению замена в последовательностях ДНК, кодирующих аналоги, включает последовательности, в которых от одного до трех нуклеотидов внутри кодонов, обозначающих один или более остатков в положениях с 304 по 310 в аминокислотной последовательности СМРD, заменены таким образом, который позволяет экспрессировать данную последовательность в положениях, где осуществлена замена одной аминокислоты на другую, отличную от той, которая присутствует в ферменте дикого типа. Дополнительные последовательности ДНК, кодирующие аналоги, соответственно включают дополнительные кодоны для дополнительных остатков в вышеуказанных районах данного фермента. Предпочтительны последовательности ДНК, кодирующие делеционные аналоги полипептидов, аналоги полипептидов с заменой и аналоги полипептидов, включающие как делеции, так и замены в аминокислотной последовательности дикого типа СМРD. Такие в сфере рассмотрения именно данного изобретения вышеперечисленные модификации могут быть "комбинированы" с другими известными и позднее созданными модификациями последовательностей ДНК, которые позволяют экспрессировать СМРD полипептидные аналоги, показывающие увеличенную хоризматмутазную и/или префенатдегидратазную активность, или дальнейшее увеличение устойчивости к ингибированию фенилаланином по типу обратной связи.

Последовательности ДНК настоящего изобретения проявляли свою полезность, когда ими трансформировали подходящий Е.coli-хозяин /посредством какого-либо вектора или использованием техники хромосомной инсерции) с целью повышения способности клеток к синтезу фенилаланина.

Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны при рассмотрении детального описания предпочтительных способов применения.

На рисунке представлена рестрикционная карта плазмиды pVN302, включающей ДНК phe A.

Нижеследующие иллюстративные примеры относятся к созданию предпочтительных последовательностей ДНК этого изобретения. Пример 1 относится к созданию аналог-кодирующих последовательностей ДНК с помощью химического мутагенеза, пример 2 иллюстрирует результаты скрининга на фенилаланиновое ингибирование, пример 3 относится к анализу последовательности, выполненному на последовательности ДНК, созданной в примере 1.

Пример 1. Химический мутагенез был проведен на плазмиде pJN302. Плазмида pJN302 состоит из вектора pLG338, несущего EcoRI-BamHI инсерцию, включающую ген phe A E.coli K12. phe A ген был модифицирован, чтобы удалить регулярные последовательности, ассоциированные с промотором, и вставить сайт BamH1 ниже кодирующей последовательности. Ген phe A кодирует СМРD дикого типа.

phe A ген может быть изолирован из хpомосомы E.coli K12 как 6,3 тпн УcoRI-BamHI фрагмент, как описано Edwards и др. РСТ публикация N 87/00202 /внесенный в ссылки здесь/, так и Hudson и др. //J. Mol. Biol. 1984, 180, 1023-1051. После определения нуклеотидной последовательности гена phe A и его фланкирующих районов рестрикционный сайт BamHI может быть введен непосредственно ниже гена заменой последовательности ГГТГЦЦ на ГГАТЦЦ сайт-направленным мутагенезом, как иллюстрировано Edwards и др. РСТ публикация N 87/00202. Эта последовательность начинается с 7-го нуклеотида после ТГА-стоп-кодона гена phe A cледующим образом:



Промоторный район гена phe A может быть сделан нерегулируемым перемещением промотора и аттенюатора /последовательностей/ с синтетического промотора, основанным на естественном промоторе, не имеющем двусторонне симметричной последовательности Прибнова /-10/. Это перемещение может быть сделано между сайтом EcoRI ниже гена и сайтом HaeII внутри N-конца природного гена phe A. Нуклеотидная последовательность этого синтетического замененного района может быть:



Терминальные рестрикционные сайты подчеркнуты, так же как и -35 и -10 районы промотора и сайта связывания рибосом /C.P. за которым следует стартовый кодон АТГ/. Ген phe A может быть изолирован из конструкций, описанных Edwards и др. BamHI и EcoRI расщеплением в сайте BamHI, расположенном ниже, и сайте EcoRI, расположенном выше гена, и EcoRI/BamHI может быть клонирован в расщепленной EcoRI и BamHI pLG338[ /Stoker и др. //Gene, 1982, 18, 335-341/, чтобы получить pJN302, рестрикционная карта которой иллюстрируется на чертеже. pLG338 имеется в наличии у многих лабораторий, включая лабораторию Stoker и др.

Приблизительно 2 мкг ДНК pJN302 объединили в 200 мкл рестрикционной смеси с 50 мМ ацетата натрия, pH 4,6, 88 мМ нитрата натрия и 0,25 мМ спермина. Рестрикционную смесь инкубировали при 30^oС и отбирали 60 мкл образца через 30 минут. Образец добавляли в 30 мкл 1 М Трис, pH 8. К нему добавляли 4,5 мкл 4 М NaCl и 300 мкл этанола. ДНК затем преципитировали при -20^oС в течение 4 часов и осаждали центрифугированием в микроцентрифуге Эррендорф. Следующий образец объемом 700 мкл отбирали через 60 минут и добавляли к нему 35 мкл 1 М Трис, pH 8. Дополнительно затем было добавлено 5,25 мкл 4 М NaCl и 350 мкл этанола. ДНК преципитировали и осаждали, как ранее. Оставшиеся 70 мкл рестрикционной смеси удаляли после полных 90 минут инкубации и обрабатывали точно, как 60 минутный образец.

Осадки ДНК ресуспендировали в 10 мкл воды, и 3 мкл каждого использовали, чтобы трансформировать компетентные клетки бактериального штамма HW1012 /phe A/. Трансформантов отбирали на LB чашках, содержащих 40 мкг/мл канамицина. Округленно 200-400 трансформантов наблюдали на чашке. Все трансформанты-колонии объединяли в 1,5 мл -бульона. Клетки отмывали и растворяли в солевом растворе. Клетки затем селектировали на способность к росту на чашках, содержащих токсичные аминокислотные аналоги b-2-тиенилаланин или -флюоро-тирозин. Более подробно, 100 мкл аликвоты отмытых клеток рассеивали на каждую из следующих питательных сред:

1/M9 минимальная среда, 0,5% глюкозы, 40 мкг/мл канамицина и 10 мМ b-2-тиенилаланин /токсичный аналог a-фенилаланина/;

2/М9 минимальная среда, 0,5% глюкозы, 40 мкг/мл канамицина и 20 мМ b-2-тиениланина;

3/M9 минимальная среда, 0,5% глюкозы, 40 мкг/мл канамицина и 1 мМ 3-флюоротирозина.

Получено несколько тысяч колоний на среде, содержащей 10 мМ b-2-тиенилаланина. Несколько было проанализировано и показало низкие уровни устойчивости к ингибированию по типу обратной связи. Двадцать колоний получили на чашке, содержащей 3-флюоротирозин. Четыре из них было исследовано и также показало низкие уровни устойчивости к ингибированию. Они не исследовались в дальнейшем. Четыре колонии было получено на чашке, содержащей 20 мМ b-2-тиенилаланин. Каждая из них продуцировала СМРD с очень высокими уровнями устойчивости к ингибированию a-фенилаланином. Плазмидную ДНК выделяли из каждой такой колонии и использовали для трансформации свежих компетентных клеток.

Клетки, ретрансформированные плазмидами каждой из четырех колоний, имели способность расти, когда высевались штрихом на чашки М9 минимальной среды, 0,5% глюкозы, 40 мкг/мл канамицина и 20 мМ b-2-тиенилаланина. Ретрансформанты также продуцировали СМРD c уровнями устойчивости к ингибированию a-фенилаланином, соответствующим устойчивости первоначальных изолятов. Плазмидную ДНК тогда выделяли из каждого ретрансформанта и охарактеризовывали, чтобы определять природу мутаций внутри гена phe A. Эти четыре мутантные плазмиды были обозначены pJN305, pJN306, pJN307 и pJN308.

Пример 2. Устойчивость к ингибированию фенилаланином для предположительных СМРD аналогов, кодируемых четырьмя мутагенизированными, происходящими из плазмид СМРD-последовательностями ДНК, была проанализирована и сравнена с устойчивостью продукта дикого типа экспрессии гена phe A следующим образом.

Приготовление клеточных экстрактов

Для выделения фермента для СМРD анализа 25 мл объема клеток HW1012, содержащих либо pJN305, pJN306, pJN307, либо pJN308, выращивали до оптической плотности /ОП/ приблизительно 1,0 в a-бульоне, содержащем 40 мкг/мл канамицина. Клетки осаждали центрифугированием, отмывали в 10 мл 200 мМ Трис при pH 8,0 и ресуспендировали в 1 мл 200 мМ Трис, pH 8. Затем клетки лизировали по способу French pressure all. Лизат центрифугировали 15 минут при 14 тыс. об./мин, и супернатант сохраняли для анализа. Для PD анализа использовали 50 мкл супернатанта, а для СМ анализа использовали 20 мкл.

Процедура PD анализа

PD активность мерили в 1,25 мл реакционных смесей, содержащих 27 мМ Трис, pH 8,1 мМ префената калия, 50 мкл клеточного экстракта, который анализируется, и варьирующие концентрации a-фенилаланина, как показано в таблице 1. Реакция начиналась добавлением префената. Реакционную смесь инкубировали при 37^oС в течение 1 минуты, после которой отбирали образец объемом 0,25 мл и смешивали с 0,75 мл 1 М NaOH. Поглощение было измерено затем при 320 нм против воды в качестве контроля. Последующие образцы отбирали на 5-й и 9-й минутах и обрабатывали точно так же.

Подсчитывали скорость увеличения поглощения при 320 нм и корректировали для любой контрольной скорости в отсутствие экстракта. Единицу PD активности определяли как количество фермента, которое катализирует превращение 1,0 мкмоля префената в фенилпируват за одну минуту при условиях определения, используя 17 500 м^-1 см^-1 как коэффициент экстинкции для фенилпирувата.

PD активность показана в таблице 1 в единицах/мл экстракта и как процент активности, определенной в отсутствие a-фенилаланина.

Процедура СМ анализа

СМ активность мерили в 0,8 мл реакционных смесей, содержащих 1 мМ хоризмата, 100 мМ Трис, pH 7,5 0,5 мМ ЭДТА, 0,01% БСА, 20 мкл клеточного экстракта, который анализируется, и варьирующие концентрации a-фенилаланина, как показано в таблице 2.

Реакции начинались с добавлением клеточного экстракта. Реакционные смеси инкубировались 5 минут при 37^oС, после чего они терминировались добавлением 0,1 мМ 4,5 М HCl. Реакционные смеси инкубировали дальнейшие 10 минут при 37^oC, чтобы превратить весь префенат в фенилпируват, после 0,1 мл 12 М NaCl добавляли, и мерили поглощение при 320 нм. В контроле отсутствовал только клеточный экстракт, для того чтобы внести поправку на поглощение субстрата. Величины были также скорректированы на СМ активность, обусловленную хозяйской СМ префенатдегидрогеназой. Все анализы выполнялись с повторностями, и показаны средние значения. Единицу определяли как количество фермента, который катализирует превращение 1,0 мкмоля хоризмата в префенат за 1 минуту при условиях определения. Коэффициент экстинкции как для PD анализа.

СМ активность показана в таблице 2 в единицах/мл экстракта и как процент активности, определенной в отсутствие a-фенилаланина.

Таблицы 1 и 2 ясно указывают на то, что как префенатдегидратазная /PD/, так и хоризматмутазная /CM/ активности фермента дикого типа ингибируются a-фенилаланином, PD активность почти полностью ингибирована низкими уровнями (10 мМ) и СМ не ингибируется более чем на около 30% даже при высоких (100 мМ) уровнях. Это согласуется с результатам изучения микробиологической ферментативной продукции фенилаланина, которая показывает заметную аккумуляцию PD-субстрата, префената, когда уровни 1-фенилаланина достигают 50-100 мМ без заметной аккумуляции СМ-субстрата, хоризмата. Соответственно, пока устойчивость к ингибированию PD активности для экспрессионных продуктов СМРD аналога резко выражена, устойчивость к ингибированию СМ активности не была столь драматичной. Интересно заметить, однако, что низкие фенилаланиновые концентрации (10 мМ) постоянно обеспечивают достаточный уровень активации СМ активности для аналогов результат, не наблюдавшийся ранее для фермента дикого типа.

Пример 3. Анализ субклонов плазмид pJN305, pJN306, pJN307 и pJN308 обнаружил, что 221 пн AlwNI/NcoI рестрикционный фрагмент (охватывающий кодоны для аминокислотных остатков с 226 по 337 в ферменте дикого типа), полученный из каждой такой плазмиды, можно заменить AlwNI-NcoI фрагментом pJN302 и что результирующие плазмиды позволят выразить соответствующую устойчивость СМРD активности к ингибированию фенилаланином. Полный сиквенс pJN305 не обнаружил мутаций вне района специфичных остатков СМРD с 30 по 310.

Анализ последовательности ДНК каждого из четырех AlwHI/NcoI фрагментов, происходящих из этих фрагментов, не выявил альтернативных замен в последовательности ДНК вне района, содержащего кодоны специфичных СМРD остатков 304 по 310. Таблица 3 расставляет нуклеотидную и производную аминокислотную последовательность pJN302 /дикий тип/ и pJN305, pJN306, pJN307, pJN308 в этих же районах.

Штамм-хозяин, который в данном случае предпочтителен как обеспечивающий лучшие титры мутантного гена pha A, в настоящем изобретении является штаммом, обозначенным AGO77, штамм E.coli, трансформированный pJN307.

Именно из информации, приведенной в таблице 3, очевидно, что каждый из первоначально полученных СМРD аналогов специфично отличается от дикого типа только маленьким районом, охватывающим остатки 304-310. ДНК плазмид pJN306 и pJN308 соответственно обозначает замены в аналогах [Len³⁰⁶] СМРD и [Cys³⁰⁹] СМРD; плазмида pSN305 обозначает делеционный аналог [des-Gln³⁰⁷, des-Ala³⁰⁸, des-Gly³⁰⁹; des-Ala₃₁₀] CMPD; плазмиду pJN307 обозначает аналог с комбинированием делеции и замены [des-Ths³⁰⁴, Lys³⁰⁵, des-Gln³⁰⁶] CMPD.

Как уже указано, в то время как химическая мутация в гене phe A, происходящем из плазмиды, составляет начальное /исходное/ средство для получения определенных предпочтительных последовательностей ДНК данного изобретения, информация, полученная через секвенирование специфических мутантных клонов вышеизложенных примеров, легко позволяет как проводить дупликацию мутантных последовательностей /cайт-направленным мутагенезом копий гена phe A или химическим синтезом всего или части гена phe A/, так и получать другие аналог-кодирующие ДНК. Достойно внимания, например, что район ДНК специфичных остатков СМРD с 301 по 315 содержится внутри 221 пн рестрикционного фрагмента, образованного при расщеплении гена phe A Alw NI и IIcoI эндонуклеазами. Этот фрагмент, таким образом образованный, может легко быть синтезирован, чтобы включить уникальные сайты рестрикционных эндонуклеаз более близко соседствующих с кодонами специфичных СМРD остатков 301-315, и синтетический фрагмент может быть использован, чтобы заменить природную последовательность Alw NI/NcoI фрагмента в гене phe A. Согласно этому может легко быть применен "кассетный" мутагенез, использующий короткие синтетические ДНК-дуплексы. В принципе, может быть использована вынуждено полимеразная цепная реакция /PCR/, чтобы получить фенилаланин и аналог-кодирующие последовательности данного изобретения, устойчивые к ингибированию производными фенилаланина по типу обратной связи.

Многочисленные модификации и вариации в данном изобретении, как описано выше в отношении предпочтительных примеров, как полагают, приходят на ум тем, кто квалифицирован в этой области. Следовательно, только такие ограничения, как приведенные в прилагаемой формуле исследования, следует поместить после этого описания.