продукт полипептидной природы, способ его получения и фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой и анальгезирующей активностью

Формула изобретения

1. Продукт полипептидной природы, полученный экстракцией HClO₄ и ЗМ KCl из тканей печени или тонкого кишечника животных, имеющий мол.м. 12,000-50,000 Дальтон, обладающий противоопухолевой и анальгезирующей активностью.

2. Продукт по п.1, отличающийся тем, что его получают из тканей козы или овцы.

3. Продукт по п.1, отличающийся тем, что его получают из тканей козы, овцы или барана.

4. Продукт по п.1, отличающийся тем, что его получают из тканей акулы.

5. Продукт по п. 1 или 2, отличающийся тем, что его получают из печени или кишечника козы, имеющий электрофоретические полосы в полиакриламидном геле около 50,000, 20,000, 14,800 и 12,000 Дальтон.

6. Способ получения продуктов полипептидной природы, обладающего противоопухолевой и анальгезирующей активностью, заключающийся в том, что ткань печени или тонкого кишечника гомогенизируют, гомогенат обрабатывают раствором сильной неорганической кислоты при температуре ниже 10^oC, цинтрифугируют, диализуют против воды, обрабатывают гипертоническим раствором, цинтрифугируют или проводят мембранную фильтрацию, осуществляют диализ против воды, затем последовательно против забуференного физиологического раствора с последующей ультрафильтрацией целевого продукта на мембранах с раствором 17 до концентрации белка 1 мг/мл и очисткой гель-хроматографией.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что в качестве сильной неорганической кислоты используют HClO₄ и обработку ведут при 4^oC.

8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что в качестве гипертонического раствора используют ЗМ KCl и обработку ведут в течение 24 ч при 4^oC.

9. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой и анальгезирующей активностью, содержащая в качестве ингредиента продукт полипептидной природы, полученный экстракцией HClO₄ и ЗМ KCl из ткани печени или тонкого кишечника животных, имеющий мол. м. 12,000-50,000 Дальтон, в эффективном количестве.

10. Продукт по любому из пп. 1-5, полезный в качестве агента для использования в противоопухолевой терапии и в управлении болью, обусловленной опухолевой патологией.

11. Продукт по любому из пп. 1-5, полезный для получения моно- или поликлональных антител против антигенов, присутствующих в опухолевых клетках, для терапевтического и диагностического использования in vivo и для диагностического использования in vitro (RIA, EiA, иммуноцитохимия).

12. Продукт по любому из пп. 1-5, способный конъюгировать с иммуномодулирующими соединениями и/или адъювантами, полезный для образования активного иммунитета (вакцинация) у здоровых людей.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается соединений, получаемых при экстрации животных тканей, особенно из тканей козы или овцы; эти соединения используются в лечение и в диагностике. Более часто изобретение касается соединений, обладающих удивительными биологическими свойствами, которые делают их пригодными для использования в лечении опухолей (или по крайней мере для поддерживающего лечения онкологических заболеваний) и для диагностического применения иммуногистологического и иммуносерологического типа.

Помимо продолжающихся исследований "экзогенных" противоопухолевых препаратов синтетического, полусинтетического, ферментативного происхождения и получаемых путем экстракции, все больше и больше внимания сейчас уделяется новым подходам, основанным на исследовании физиологических соединений, естественно встречающихся в организме, которые способны подавлять рост опухолевых клеток путем прямого цитотоксического эффекта или путем комплексных взаимодействий с гуморальными или клеточными компонентами иммунной системы.

Среди этих попыток особо заметны достижения исследований, например, интерферонов, фактора некроза опухолей (ФНО), цитокинов и лимфокинов, таких как интерлейкины, иммунотоксины, получаемые из конъюгатов миноклональных антител с цитотоксическими веществами различной природы и т.д.

Мало внимания до сих пор уделялось исследованиям, которые могут быть экстрагированы из экзогенных тканей. Фактор, называемый AF2, получаемый путем экстракции из эмбрионов овцы и козы, изучался с начала 1940 г., но явно без применения результатов исследования (Schweiz-Rundsch-Med. Prak. 1990 79 (16): 498-502).

Начиная с предыдущих исследований изобретателя наличия их соединений, имеющих необычные иммунологические свойства (Biomed. Pharmacother, 1987, 41 2 - 5) в сыворотке пациентов, пораженных опухолями, было далее обнаружено, что вещества полипептидной природы могут быть экстрагированы из животных тканей, особенно из тканей козы и овцы, и что эти вещества имеют следующие удивительные свойства: они могут вызывать образование антител, способных узнавать опухолевые антигены человека; они могут уменьшать или подавлять боль, вызванную злокачественными опухолями, вызывать лизис клеток и подавлять или замедлять рост опухолей при введении людям, пораженным злокачественными опухолями разного типа.

Значение термина "соединения полипептидной природы", который используется в изобретении, может быть распространено на любого типа полипептидные соединения (белки, гликопротеины, мукопротеины и им подобные).

Соединения в изобретении могут быть получены путем экстракции, предпочтительно в кислых условиях, гомогенатов животных тканей, особенно козы и овцы. Использование органов козы особенно предпочтительно; предварительные испытания не исключают использование других видов животных, например акулы.

Опыты по экстракции печени и тонкого кишечника подтвердили наличие в этих органах соединений, имеющих вышеописанные характеристики; поэтому можно предположить, что они распространены везде и их наличие не ограничивается только одним органом или группой органов. Из практических соображений ссылки везде далее делаются специфически на печень козы, которая более удобна для обработки и более доступна, чем другие органы.

Экстракция соединений в изобретении заключает в себе следующие стадии:

а) гомогенизация тканей и органов по обычной методике;

б) обработка гомогенатов сильными неорганическими кислотами при температуре ниже 10^oC или использование эквивалентных экстрактивных методов (детергенты, мочевина и т.д.;

в) центрифугирование и диализ против воды;

г) обработка гипертоническим раствором, центрифугирование или мембранная фильтрация и диализ против воды и затем против забуференного физиологического раствора (PBS);

д) ультрафильтрация на мембранах, имеющих cuf-off 10,000Д до концентрации около 1 мг/мл белка;

е) дальнейшая очистка при помощи гель-хроматографии.

В стадии "б" предпочтительно используется 2N перхлорная кислота при температуре 4^oC. В стадии "г" предпочтительно используется раствор 3М KCl и обработка производится в течение 24 ч при 4^oC. Диализ, фильтрация или процедура центрифугирования производится в соответствии с обычными методами.

Полученное соединение может непосредственно быть использовано соответственно изобретению.

Вещество должно быть обработано обычными методами, чтобы сделать его стерильным и апирогенным для возможности введения пациентам или животным в форме пригодной фармакологической композиции, как это полагается по Ремингтоновскому фармакологическому Научному Руководству, Mack. Pub. Co. Ny. USA.

Образцы вышеупомянутых композиций заключены в сосуды и представляют собой лиофилизированную активную форму, они могут быть растворены перед употреблением в стерильном физиологическом растворе, растворах или суспензиях водных или масляных стерильных растворителях и подобных композициях, пригодных для введения ин виво.

Предварительные клинические испытания, в дальнейшем суммированные, позволяют полагать, что соединения, предлагаемые в данном изобретении, могут вводится в широком диапазоне доз, например, от 0,1 до 100 мг/день, многие дни последовательно или с разными интервалами (один раз в неделю, один раз в месяц или даже с более длинными интервалами). В частности, было замечено, что используемые соединения, экстрагированные из печени козы, далее называемые LgE, вводимые однократно в количестве 1 - 3 мг сухого вещества (1 - 3 мл раствора) могут вызывать удивительные и очень существенные результаты у пациентов, пораженных опухолевыми патологиями.

Второе введение через 30 дней может иногда вызывать благоприятные эффекты. Нельзя, однако, считать правилом, что проведенные испытания могут отвечать на вопрос об изменениях в схеме лечения, определяемых соответственно патологии и состоянию пациента.

Пример. 100 г печени козы-самца гомогенизировали в лопастном гомогенизаторе, гомогенат ресуспендировали в дистиллированной воде до конечного объема 400 мл.

400 мл 2 N HClO₄ раскапывали в вышеупомянутую суспензию в течение приблизительно 20 мин при 4^oC, взбалтывали в течение приблизительно 20 мин при 4^oC и взбалтывали в течение дальнейших 30 мин. После центрифугирования при 10,000 g в течение 20 мин осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость диализовали против проточной воды и затем против дистиллированной воды.

После диализа добавляли порошкообразный KCl к полученной жидкости до получения 3-молярного раствора, и смесь взбалтывали в течение 24 ч при 4^oC. После центрифугирования при 100,009 g в течение 1 ч надосадочную жидкость диализовали против дистиллированной воды и фосфатного буфера (PBS).

Полученный раствор (800 мл) имел в среднем концентрацию белка 200 мгк/мл в соответствии с методом Lowry.

Раствор концентрировали путем ультрацентрифугирования до концентрации 1 мг/мл, и его называли LgE и непосредственно использовали для клинических испытаний, как ниже было суммировано, везде применяя сокращение LgE.

Этот продукт был апробирован на PAgE 4/30, где очевидны 4 основные полосы (фиг. 1): от калибровочной кривой, полученной из параметров стандарта, был высчитан молекулярный вес четырех основных полос: 1-я полоса = около 50,000d; 2-я полоса = 20,000d; 3-я полоса = около 14,80d; 4-я полоса = около 12,000d.

Для очистки стадий последующих LgE экстракции использовали ион-обменную хроматографию соответственно следующему методу. Около 20 мл LgE диализовали против фосфатного буфера (Na₂HPO₄ - NaH₂PO₄ 0,01 M, pH 6,5). После диализа образцы фильтровали через 0,45 м фильтр и затем меняли на TSK DEAE SPW 7,5 75 мм колонку, калиброванную на тот же диализный буфер, со скоростью протекания 30 мл/ч.

Элюция на колонке продолжалась в течение 100 мин с той же скоростью и буфером.

Линейный градиент фосфатного буфера при pH 6,6 начинался с начальной молярности 0,01 M до конечной молярности 0,1 M; вышеупомянутый градиент имел продолжительность в 100 мин, и оперативную скорость протекания поддерживали при 30 мл/ч.

Из элюата собирали фракцию по 0,5 мл и объединяли разные зоны соответственно разным пикам.

Как можно установить из хроматограмм (фиг. 2), были получены разные белковые фракции, которые были единично исследованы в PAGE PAA4/30 для оценки отдельных компонентов. Начальный буфер, обозначенный как зона A, и градиент фракций, имеющих повышающиеся концентрации белка, обозначенные как зона Б, вначале предполагались как наиболее интересные, поскольку белки с низкой молекулярной массой присутствовали главным образом в зоне А, в то время как белки, имеющие молекулярную массу 50,000 дальтон, присутствовали в более высоких концентрациях в зоне Б.

Итак, два образца, зона A и воза B, последовательно метили I¹²⁵ (фиг. 3 и 4) и использовали в RIA. Для того, чтобы сделать пригодным для клинических экспериментов, в практически используемых количествах, и возможности отдельного введения зон A и Б, требовалась очистка больших количеств LgE.

Колонки с препаративным для зон гелем DEAE-Sephadex, эквилиброванных и элюированных в тех же условиях, что и DEAE-SPW колонка, использовали в FPLC.

800 мг LgE очищали при помощи этой колонки и получали 42 мг зоны A и 15 мг зоны Б.

Впоследствии порции LgE партия 2/90 анализировали в обратной фазе на Aquapore Btyl (30 x 4,6 мм 7) Applied Biosistem, используя в качестве элюэнта воду и ацетонитрил, содержащий 0,05 TFA в линейном градиенте ацетонитрила от 25 до 55% в течение 15 мин. Хроматограммы, зарегистрированные при 220 мм, представлены на фиг. 5. Порции образцов зоны A и зоны Б, полученные из DEAE Sephacell, хроматографировали в обратной фазе и тех же условиях, что были уже сообщены для неочищенного LgE (фиг. 6 и 7).

Изучение хроматограмм неочищенного LgE и тех же из зон A и Б дает возможность наблюдать, что наиболее значительные белковые компоненты, находящиеся в необработанном продукте, являются теми же самыми, что и в двух образцах, полученных из зон A и Б, хотя и в разных концентрациях.

Изоэлектрическая точка.

PAGE платы L KB использовали соответственно приложенным инструкциям.

Нефракционированный LgE дает одну слабую полосу при pH 8,3, одну заметную полосу при pH 6,7-7 и несколько близких полос между pH 6 и 4,5, имея типичные типы изоантигенов.

LgE зоны A дает одну значительную полосу при pH 8,2, одну значительную полосу при pH 6,7 и некоторые полосы в кислой зоне с определенным превалированием 3 специфичных полос при pH 5,6, 5 и 4,9.

LgE зоны Б обнаруживают значительную интенсивность окраски зоны в кислой зоне при pH < 6 с типичным типом изоантигенов.

Биохимические, иммунохимические и радиоиммунологические результаты.

Дозы в 5 мл (соответственно 1 мг сухого экстракта) готовили из раствора, полученного перед стадией концентрации и эмульгировали с полным адъювантом Фреинда. Двух кроликов иммунизировали дозой каждые 15 дней.

Из двух индивидуальных кроликов один был потерян после первой иммунизации. Из второго животного была получена порция сыворотки (названная RF₄), которую затем использовали для биохимических, иммунохимических, радиоиммунологических и иммуноцитохимических исследований. Антитела испытывали при помощи западного Блот метода против LgE. Антиген был представлен на PAgE SDS PAA 4/30 платах (Pharmacia) и последовательно подвержен трансблоттингу в нитроцеллюлозе. Этот последний затем инкубировали с RF₄ сывороткой и затем проводили реакцию с антикроличьей пероксидазой (FIEP CE). Как показано на фиг. 8, антитела узнают белки с молекулярной массой около 50,000d.

Вторую группу кроликов иммунизировали с LgE, как описано выше (5 мл, что соответствует 5 мл сухого экстракта, эмульгировали с 2,5 мл полного адъюванта Фреинда).

Эти кролики, дающие 14 антисывороток, названных анти- 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, испытывали тем же путем, что и RF₄.

Данные, полученные биохимическими методами (в частности, методом Западного Блок метода), дают возможность предполагать, что эти антисыворотки в отличие от антисыворотки RF₄, узнают все белковые компоненты LgE (фиг. 9).

Кроме того, мышей самок BAl B/c в возрасте 10 недель иммунизировали для продукции моноклональных антител. В частности, две мыши были иммунизированы LgE(1 мг/мл), и двух иммунизировали LgE зоны A из DEAE 5P W (мг/мл) путем подкожного введения 100 л антигена + 100 л Адъюванта Фреинда.

Схема иммунизации была приведена ниже:

1-е введение: 100 л Ag + 100 л полного Адъюванта Фреинда,

2-е введение: 100 л Ag + 100 л полного Адъюванта Фреинда через 7 дней после 1-го введения

3-е введение: такое же, как второе через 7 дней после 2-го введения

4-е введение: такое же как и 3-е через 7 дней после 3-го введения.

В конце иммунизации брали пробы крови из каждой мыши и полученную сыворотку подвергали тесту связывания против LgE (фиг. 10) и иммунохимическим тестам.

Основываясь на полученных результатах, было решено забить мышь N 2, иммунизированную LgE из зоны A, для того, чтобы получить моноклональные антитела.

Слияние, осуществленное соответственно Мильштейн (Milstein), дало 250 клонов.

Первый скрининг показал, что многие клоны были направлены на детерминанты, экспрессированные на компонентах LgE с низкой молекулярной массой, в то время как меньшее количество клонов узнавало белки с молекулярной массой в 50,000d. Второй скрининг, проведенный после экспансии клонов, дал отрицательные результаты для всех клонов, поэтому было решено произвести слияние селезенки другой иммунизированной мыши. Слияние дало 400 клонов (100%). В первом тесте после приблизительно 10 дней 64 клона оказались положительными на LgE.

Супернатант этих 64 клонов был последовательно испытан на LgE, LgE из зоны A и из зоны Б. Скрининг показал, что 4 клона обладают сильным связыванием с 3 антигенами, более очевидно LgE из зоны A. Эти 4 клона клонировали и затем снова испытывали тем же способом на три антигена. Параллельно клоны также испытывали на LgE при помощи Западного Блота.

Результаты этих двух опытов привели к расширению и образованию асцита из 9 клонов. Полученные асциты титровали при помощи теста связывания против LgE, LgE зоны A и LgE зоны Б. Все асциты обладали хорошей степенью связывания с тремя антигенами, с особенным предпочтением для LgE из зоны A.

В противоположность этому Западный Блот тест показал, что одно из моноклональных антител было способно связывать полосу 50,00d, в то время как все другие узнавали полосу с молекулярной массой, немного превосходящей 50,000d. В отклонение от теста связывания ни одно их этих моноклональных антител не обнаружило связывания с компонентами с низкой молекулярной массой. Было также проведено изучение "голых" мышей, которым трансплантировали опухоль (аденокарцинома тонкого кишечника человека клеточная линия под названием HT29).

10000000 клеток в 0,5 мл среды инокулировали каждому животному. Через 17 дней после прививки животных обрабатывали антисывороткой PF₄, предварительно очищенной путем ионного обмена, чтобы изолировать фракцию иммуноглобулина, а затем метили радиоактивным иодом ¹²⁵I. Каждое животное 10000000 срм в 0,5 мл PBS + 1% BSA внутрибрюшинно.

Животных забивали через 24, 48 и 72 ч и проводили вскрытие для расчета индекса локализации антител.

Способность антигенного узнавания сывороткой LgE иммунизированных кроликов исследовали на тканях человека.

Антисыворотку изучали на срезах тканей человека при помощи ABC иммунопероксидазного и иммуногалактозидазного методов и с RIA на экстрактканей человека.

Срезы фиксированных в формалине - залитых в парафин карцином желудка, толстого кишечника, груди, легких, простаты и яичников, а также эксплантатов опухолей (полученные на "голых" мышах) клеток HT 29 (из карциномы кишечника), рака груди MCF7 и GTL 16 клетки были использованы в этих опытах.

Из полученных результатов можно доказать следующее.

а) Кроличья анти LgE - сыворотка, окрашенная в коричневое, узнавала поверхностные и цитоплазматические антигенные структуры в злокачественных клетках со степенью варибельности в зависимости от титра и специфичности в случае карцином желудка, толстого кишечника и молочной железы и клеток HT29, GTL 16.

б) Не наблюдалось реакции между кроличьей анти LgE сывороткой и клетками нормальной печени человека в тестах иммуноцитохимии и иммуноцитохимии с CEA и RIA.

в) Ни одна из испытанных опухолей не была положительной.

Системы LgE, ¹²⁵I LgE, кроличья анти- и кроличья ¹²⁵I анти-LgE были испытаны ин виво, на "голых" мышах и на "голых" мышах с ксенографтами клеток HT29.

Были получены следующие результаты.

1) В обеих группах ¹²⁵I LgE обнаруживал ин виво очень быстрое обращение; через 24 - 48 ч после подкожной инъекции вся радиоактивность была локализована в мочевой системе.

2) Иммуноглобулины LgE и анти-LgE не вызывали уменьшения размера опухоли у "голых" мышей, даже если в некоторых случаях наблюдалась значительная гиперемия опухоли.

3) Меченые ¹²⁵I анти-LgE иммуноглобулины обнаруживали значительную локализацию LgE в опухолевой массе через 3-5 дней после инъекции "голым" мышам с ксенографтами клеток HT29. Вышеприведенные результаты воспроизводили ин виво иммуноцитохимические данные.

Экстракт (LgE) и сыворотка анти-LgE были исследованы ин виво на

1) первичных культурах плевральных экссудатов злокачественных опухолей,

2) линиях злокачественных клеток: человека (Линии HMF 7 м HT29) и крысы (3230Ac),

4) тесте безофильной дегрануляции.

Были получены следующие результаты:

1) сыворотки LgE и анти-LgE не обнаружили прямого токсического эффекта на опухолевые клетки,

2) сыворотки LgE и анти-LgE не обнаружили ин виво активности TNF (фактор некроза опухоли) по отношению к клеткам-мишеням,

3) цитотоксическая активность, возможно опосредованная через лимфоциты и/или макрофаги, была очевидна на первичных культурах экссудатов опухолевых клеток рака груди,

4) если в качестве клеток-мишеней использовали К562 и HLv60, LgE действует как сильный LAK (лимфокин активированные клетки-киллеры) индуктор на лимфоцитах человека.

Эти результаты варьировали по сравнению с реакцией 11 2. Действительно, лимфоциты от различных доноров обнаруживали разный цитотоксический эффект при обработке LgE.

В противоположность этому LgE и IL - 2 вместе значительно увеличивали эту активность (+ 27,2%).

Эксперименты, проведенные с CTLL клетками (чувствительными к IL - 2), исключают любой тип подобия между LgE и IL - 2.

Не может быть проведено сравнения между LgE и любым BRM (модификаторы биологических реакций), особенно тех, которые относится к группе 2. Действительно, LgE был неактивен ин витро по отношению к опухолевым клеткам и ин виво по отношению к опухолевым клеткам на модели "голых" мышей. Реакция ин виво, полученная с LgE на плевральных выпотах метастазов с опухолей человека, показывает, что необходимо присутствие иммунного медиатора клеток.

С другой стороны, экстракция LgE в сильно кислой среде исключает сложность с BRM и интерферонами.

5) LgE ингибировал ин витро пролиферацию PBL. Это может быть связано с прямым ингибирующим эффектом на лимфоциты или это может осуществляться посредством индукции различных ингибиторных факторов. Ингибирующий эффект, как оказалось, зависит от дозы и времени.

LgE был испытан на тесте дегрануляции базофилов. Этот тест используется для того, чтобы узнавать специфические антигены против базофилов и/или прикрепленные антитела, которые необходимы для иммунной памяти. Тест считается положительным для значений выше 30%. На образцах крови пациентов с раком легких LgE вызывает при очень низкой концентрации (1 - 0,1 г г/мл) значительную, зависимую от дозы, дегрануляцию базофилов (более 80%). Тесты, проведенные на дальнейших 5 случаях, обнаружили, что 50% пациентов, страдающих злокачественными опухолями, положительны по отношению к этому тесту. Не происходит дегрануляции в контролях, проведенных с неотмытыми (т.е. в присутствии циркулирующих антител и антигенов и не только с факторами, прикрепленными к базофилам) образцами и без кальция (табл. 1). Дегрануляция базофилов не происходит при использовании крови здоровых доноров.

Токсикология.

На кроликах и мышах излучали острую и хроническую токсичность.

Для острой токсичности мышам и кроликам ежедневно подкожно вводили (в течение 10 дней) раствор LgE, эквивалентный дозе 7,1 мг/кг.

Опыты по хронической токсичности начинали на кроликах и проводили в течение шести месяцев с ежедневными дозами 1,2 мг/кг. Не отмечается токсического эффекта и не наблюдается видимых изменений. Предварительные исследования LgE меченым ¹²⁵I показали полное выведение в течение 24/48 ч через мочевыделительную систему. Нельзя выявить токсических эффектов при инъекции LgE в разных концентрациях животным. Невозможно определить летальную дозу.

Клинические испытания

Первая фаза. 29 пациентов в терминальной стадии лечили на сострадательной основе и с соглашения пациентов. Все они ранее получали множественное противораковое лечение (хирургия, лучевая терапия, химиотерапия), а также затем поддерживающее лечение, такое как курсы противовоспалительных препаратов (FANS и стероиды) и опиумные препараты или другие основные аналгетики.

Большинство пациентов были кахексичными и даже прекмотозными с ожидаемой средней длительностью жизни 7 дней.

Тем не менее положительная реакция наблюдалась у 70% пациентов, основной общий эффект заключался в исчезновении болей и индукции у пациентов субъективного ощущения здоровых людей; у 48% пациентов отмечалось значительное увеличение времени жизни (> 2 месяца) и не было возобновления болей.

Наблюдалось уменьшение массы опухоли у 5 из 14 пациентов, и они жили более двух месяцев (табл. 2).

В первой группе пациентов лечение оказывало весьма благоприятный субъективный эффект, но нельзя было произвести дальнейший анализ из-за гетерогенности патологических и клинических условий, соответственно пациенты не были подвергнуты оценке при помощи приборов или лабораторных методов.

Кроме того, лечение LgE было в пределах от ежедневных до еженедельных введений (0,025 мг/кг). В этих экспериментах не появлялась анафилактическая реакция.

Из первой части исследований вытекали следующие наблюдения:

1) LgE не вызывает токсических явлений у человека даже после повторяющихся ежедневных введений,

2) разные партии оказывали одинаковые клинические эффекты,

3) LgE вызывает интенсивное уменьшение боли с улучшением ценестезиса, аппетита и функции кишечника.

По мнению клиницистов он вызывает необъяснимую эйфорию у очень больных пациентов.

Вторая фаза. В течение этого периода лечили 141 пациента в терминальной стадии с раковыми опухолями. Но позиция клиницистов была различной, основываясь на уверенности в необходимости гарантий в безвредности LgE и необходимости документирования положительных эффектов, которые наблюдались. Препарат, однако, вводили только пациентам в терминальной стадии, для которых любое другое лечение было бесполезным, и на сострадательной основе.

Все пациенты получали одну подкожную инъекцию 1,5 мг LgE (около 0,025 мг/кг). В некоторых случаях (в последние три месяца) вторую дозу вводили на месяц позже.

На следующих чертежах пациенты разделены на 2 группы, обозначенные как N и U.

В группе N пациентов было представлено 108 случаев.

Эксперименты на группе U проводили на 33 пациентах. Определение отвечающих основывалось только на субъективном и объективном общем состоянии, т. е. на характеристическом статусе, т.к. все пациенты были с ожидаемой очень короткой длительностью жизни.

U группа (табл. 3)

Через 4 месяца 33 пациента в терминальной стадии с раковыми опухолями, лечение LgE, все были живы, среди них 11 посчитали невозможным оценить, из оставшихся 22 пациентов у 13 наблюдался ответ (у трех на период менее одного месяца).

Среди оставшихся 10, отвечающих на лечение (более 30 дней), 5 были еще живы с ожидаемой длительностью жизни в течение 6 месяцев.

Уменьшение (> 25%) и/или исчезновение опухолевой массы наблюдалось в этой группе у 2 пациентов из 5, 9, не реагирующих на лечение, умерли.

У пациентов группы U исследования проводили у 21 пациента через разное время после введения LgE.

У 12 пациентов наблюдалось статистически достоверное возрастание гранулоцитов без какого-либо увеличения популяции лимфоцитов.

При оценке этих данных необходимо напомнить, что это были пациенты в терминальной стадии с раковыми опухолями, с сильно подавленным иммунитетом, поэтому изменение химии крови, наблюдаемое после LgE, могло быть скрытым или нарушенным из-за ранее проводимого иммуносупрессивного лечения (химио, лучевая терапия и др.).

N группа (табл. 4, 5 и 6).

108 раковых пациентов в терминальной стадии были взяты для лечения. Каждому из этих пациентов проводили специфическую противоопухолевую терапию (химио, лучевую, гормонотерапию) и ее прекратили, т.к. это лечение оказалось неэффективным. Пациенты получали только лечение от боли, часто опиумные препараты и FANS, которое было прервано с началом настоящего лечения.

Все пациенты получали одну подкожную дозу LgE (1,5 мг). В некоторых случаях дозу повторяли через 30 дней после первого введения.

Из 108 леченых пациентов только 82 были оценены и среди них, через 5 дней после лечения LgE у 27 (32,9%) не наблюдалось ответа на лечение, а у 52 (63,4%) отмечалась реакция на лечение; 11 не реагирующих (13,4%) т 37 (45,1%) реагирующих прожили в течение первых 30 дней после единственной инъекции LgE (табл. 4).

После первого месяца и в течение следующих 4 месяцев 4 (4,8%) среди не отвечающих и 30 (36,5%) среди реагирующих выжили. У 24 (80%) из 30 реагирующих пациентов с временем жизни более одного месяца наблюдалось также уменьшение (более 25%) или исчезновение злокачественных опухолей (фиг. 11, табл. 5).

У этих пациентов независимо изучали симптом "неопластических болей" независимо от всех других регистрируемых симптомов, чтобы определить пациентов как отвечающих на лечение.

В табл. 6 представлены результаты изучения 82 пациентов, которые подтвердили прежние наблюдения: в значительном проценте случаев 37/82 (45,1%) исчезали боли в течение 12/24 ч, часто в случаях болей, резистентных к большинству наиболее важных опиумных препаратов и к последней обезболивающей терапии; во всех случаях боли исчезали в течение первых дней.

В другой небольшой группе пациентов (24/82) неопластические боли всегда исчезали полностью, но это исчезновение наблюдалось позже (в течение 30 дней).

Третья фаза. Хотя пациентов проверяли, следуя одним и тем же критериям, проведенным выше, была введена также анатомо-физиологическая оценка лечения. Шесть пациентов, страдающих от различных раковых опухолей, получавшие одну инъекцию LgE, подвергали хирургической операции для изучения массы опухоли через интервал времени от 4 до 51 дней.

Всего было изучено 8 образцов от 6 пациентов. Два образца ткани (оба от пациентов с карциномой толстого кишечника) были получены до лечения.

От тех же пациентов так же, как от других 4 пациентов с раком желудка (2 случая), раком анального тракта и раком поджелудочной железы, исследовали ткани после лечения LgE (инъекции делали за 4 и 51 день до этого).

Ткани заливали парафином и проводили гистологическое исследование. В дополнение к этому производили иммуноокрашивание моноклональными антителами против лимфоцитов (общий лейкоцитарный антиген CLA), PANP маркеру (1 26 моноклональный), PAH T маркеру (UCHLI).

Результаты показывают, что ткани злокачественных опухолей, полученные до лечения LgE, обнаруживали только среднюю воспалительную инфильтрацию. Тех же пациентов лечили LgE. В тканях, исследованных через 15 дней после лечения LgE, обнаруживали интенсивную зону некроза и весьма выраженную инфильтрацию гранулоцитов. Те же результаты были получены в тканях от различных пациентов через 51 день после лечения LgE.

Во всех случаях независимо от времени исследования после лечения LgE была очевидна гранулоцитарная инфильтрация возинофильными гранулоцитами. Окраска лимфоцитов разного типа обнаружила наличие CLA позитивных клеток, главным образом лимфоцитов типа B, в то время как UCHL I клетки (T лимфоциты) были редки.

Это низкое количество T лимфоцитов совместно с наличием гранулоцитов и эозинофилов оказалось чрезвычайно интенсивным при сравнении с гематохимической оценкой пациентов при лечении (гранулоциты увеличиваются в числе в течение первых дней после введения LgE) и с результатами на культуре PB I в присутствии LgE, где наблюдалось подавление пролиферации PBI, и с результатами теста базофильной дегрануляциии.

Клиническое заключение.

Результаты, полученные в 3 мультицентрических тестах, были совершенно гомогенными.

Число респондентов после одного месяца наблюдения было соответственно, 48,2, 45,4 и 45,1%, хотя имелись различия во времени, процедуре и культуре врачей.

В общем ответ после каждого периода наблюдения, включая группу 7 дней, составлял соответственно 68,9, 59 и 63,4%.

Была получена также общая скорость реакции (фиг. 12) у 46% (период наблюдения 1 месяц) и 63,4% от всех с ответом. Интересно напомнить, что в группе N (табл. 4 и 5) наблюдалось уменьшение (> 25%) или исчезновение массы опухоли при более одного месяца выживания у 80% респондентов. В течение того же периода наблюдения только 4,8% выживали среди не отвечающих.

Весьма необычным и удивительным наблюдением является исчезновение болей (табл. 7) у больных со злокачественными опухолями, которое наблюдалось также и у пациентов, не реагирующих на препараты опиума.

Этот эффект начинается до уменьшения массы опухоли и наблюдается также у тех пациентов, у которых нет объективного эффекта.

Имеет смысл изучить это клиническое наблюдение более глубоко.

Результаты третьей фазы испытаний показывают, что происходит интенсивный гранулоцитоз и периваскулярный некроз в тканях злокачественных опухолей после введения одной дозы LgE, и подтверждают с гистопатологической точки зрения активность препарата в индукции лизиса опухолевых клеток человека при помощи механизма, специфичного для опухоли, и индукции иммуногенных свойств организма-хозяина.