средство, стимулирующее рост волос, и способ его получения

Формула изобретения

1. Средство, стимулирующее рост волос, отличающееся тем, что включает низкомолекулярную РНК ядер клеток волосяных луковиц физиологически молодых животных, содержащую не менее 95% низкомолекулярной РНК с длиной 100 - 250 нуклеотидов с константой седиментации 4 - 8 S, не более 5% белка и следы ДНК.

2. Способ получения средства, стимулирующего рост волос, включающий использование участка кожи, содержащего волосяные луковицы, с последующей гомогенизацией и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что используют участки кожи молодых животных, выделяют слои, содержащие волосяные луковицы, после гомогенизации отделяют белки, осаждают целевой продукт, представляющий собой низкомолекулярную РНК ядер клеток волосяных луковиц, и очищают его.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что отделение белков осуществляют их осаждением смесью фенол-хлороформ в соотношении 1 : 1 (по объему).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и касается средства, стимулирующего рост волос.

Нарушения нормального роста волос, вплоть до полного их выпадения, могут иметь разные причины, но независимо от этого такие патологические проявления имеют достаточно значимый социальный характер.

Изыскание средств, стимулирующих рост волос, началось давно и не прекращается до настоящего времени, поскольку идеального и универсального средства, одинаково эффективного во всех случаях, видимо, не существует.

Широкое использование в препаратах для ухода за волосами разного рода растительных экстрактов основано либо на действии экстрагируемых веществ как местных раздражителей (экстракты из лука, чеснока, перца), либо на действии некоторых экстрагируемых продуктов как активных предшественников для биосинтеза соединений, важных для метаболизма клеток волосяных луковиц или ствола волоса (пантотеновой кислоты в экстракте из крапивы, кремневой кислоты в экстрактах из овса, хвоща) [Махлюк В.П. Лекарственные растения в народной медицине. Саратов, 1991 г.].

Большинство растительных экстрактов, предназначенных для стимулирования роста волос, содержат вещества, прямо не связанные с метаболическими процессами в ткани волоса и с регуляцией этих процессов, а механизмы их действия в большинстве случаев не известны.

Биологический эффект растительных экстрактов при применении их в составе средств для ухода за волосами слабо выражен.

Применение в средствах для ухода за волосами препаратов, обладающих общеукрепляющим действием на макроорганизм (витаминов, факторов роста и подобных) [Diana Lee du Cros. Fibroblast Growth Factor and Epidermal Growth Factor in Hair Development. "J. Invest. Dermatol.", 1993, V. 101, P.106S-113S] также не позволяет во всех случаях добиться желаемого результата, особенно при далеко зашедших расстройствах нормального роста волос.

Известно, что миксидин и некоторые другие антигипертензивные препараты из группы синтетических сосудорасширяющих средств способны стимулировать рост волос и временно замедлять облысение при местном применении растворов этих веществ в виде аппликаций в течение длительного времени [Takeshita К. The Hair Growing Effect of Minoxidil. "Ann. N.Y. Acad. Sci.", 1991, V.642, P.470-472].

Было затем установлено, что механизм действия этих средств связан с их влиянием на уровень содержания в клетке ионов калия в результате открытия внутриклеточных каналов для транспорта ионов [Buhl А.Е., Conrad S.J., Woldon D. J. , Brunden M.N. Potassium channel conductance as a control mechanism in hair follicules."J.Invest.Dermatol.",1993, V.101 (suppl.l), P.148S-152S].

Известно, что некоторые ингибиторы андрогенных гормонов предотвращают у взрослых пациентов андрогенное облысение и андрогенные алопеции [Rondall V. A., Thornton M.L., Messenger A.G. et al. Hormones and Hair Growth: Variation in Androgen Receptor Content of Dermal Papilla Cell Cultured from Human and Red Deer (Cervus Elaphing) Hair Follicules. "J. Invest.Dermatol., 1993, V. 101 (suppl 1), P.114S-120S].

В частности, для этих целей могут быть использованы аппликации 0,005-0,015%-ного спиртового раствора эстрадиолбензоата, который снижает активность фермента 5- альфа-редуктазы, участвующей в регулировании роста волос [Фержтек. Косметика и дерматология, М., 1990 г.].

Временного замедления процесса облысения иногда можно достичь в результате применения аппликаций мази или 1%-ного раствора метоксипсоралена с последующим УФ-облучением участка облысения, что вызывает образование эритемы, улучшая кровоснабжение обрабатываемого участка [Фержтек. Косметика и дерматология, М., 1990 г.].

Действие упомянутых лекарственных препаратов было обнаружено как проявление побочных эффектов при длительном лечении нарушений аппарата регулирования кровяного давления, гормональных и других нарушений.

Однако применение таких лекарственных средств для лечения нарушений роста волос, в том числе, алопеций, связано с резкими сдвигами состояния сосудов и гормонального статуса, что является существенным препятствием для их использования в таком качестве.

Разрешен к применению способ лечения алопеций арикта, предусматривающий использование аппликаций пиластина, представляющего собою холераген-анатоксин [Временная фармакопейная статья ВФС 42-56 ВФ-87] -

Недостаток этого метода состоит в необходимости использования продукта, получаемого с помощью патогенного микроорганизма.

В качестве наиболее близкого аналога можно рассматривать патент N 0236014 B1, в котором описан способ стимулирования роста волос с помощью выделенных из кожи млекопитающих, дезагрегированных и затем культивированных клеток нижней части кожных фолликулов, которые вносят во внешний слой эпидермиса человека. Недостатком этого способа является то, что используются целые клетки, введение которых в ткань кожи человека может вызвать образование антител и реакцию отторжения. В отличие от этого, в предлагаемом нами способе используются препараты низкомолекулярных РНК, которые не воспринимаются организмом как антигены и совершенно безвредны.

Цель изобретения - изыскать биологически активные вещества, способные специфически стимулировать рост волос, т.е. ускорять и/или индуцировать этот процесс.

В результате длительных теоретических и экспериментальных исследований заявителем было обнаружено, что искомыми свойства ми обладает низкомолекулярная рибонуклеиновая кислота (РНК) клеточных ядер волосяных луковиц физиологически молодых животных и человека, а также был разработан способ получения такой РНК, специфически стимулирующей рост волос.

Существо предложения заявителя состоит в следующем.

Для получения специфического средства, стимулирующего рост волос, шкуру молодых (3-6 месяцев после рождения) особей крупного рогатого скота освобождают от волосяного покрова и от подкожно-жировой клетчатки, а затем механически удаляют внутреннюю часть дермы, не нарушая слоев дермы и эпидермиса, содержащих волосяные луковицы.

В качестве исходного материала могла быть использована шкура других животных молодого возраста (мышей, крыс, кроликов, мелкого рогатого скота и пр.), что, однако, менее рационально.

Полученную ткань гомогенизириют и методом центрифугирования отделяют фракцию, содержащую ядра клеток волосяных луковиц.

Гомогенизацию осуществляют при пониженной температуре например, в 0,25 М растворе сахарозы в Трис-буфере с pH 8,5, содержащем хлористый кальций, ЭДТА, Тритон-Х-100.

Требуемую фракцию проще всего выделить осаждением, например, после центрифугирования в течение 10 минут при 800 g.

Осадок ресуспендируют и разрушают клеточные ядра волосяных луковиц, например, при контакте с такими поверхностно - активными веществами, как додецилсульфат натрия.

Из суспензии известными приемами осаждают неактивные белки и ДНК, которые отделяют. В частности, для этих целей можно использовать смесь фенол-хлороформ в соотношении 1:1.

Депротеинизацию целесообразно проводить несколько раз и осуществлять ее при температуре 40-80 градусов.

Температура обработки, при которой выделяется РНК, проявляющая максимальный биологический эффект, зависит от качества используемого исходного материала и определяется опытным путем, что, в частности, показано в Таблице 1.

При обработке материала в том или ином температурном режиме из ядер клеток в раствор выходят разные фракции РНК.

В том случае, когда для депротеинизации используют смесь фенол-хлороформ, в осадок выпадают нерастворимые белки и ДНК, в феноле растворяются экстрагированные из ядер белки и ДНК, а РНК остается в водной фазе.

Дальнейшей очистке подвергалась верхняя (водная) фаза, из которой очищаемое активное начало (низкомолекулярные РНК) осаждали охлажденным этанолом.

Возможны и другие схемы очистки целевого продукта, но важно, чтобы осаждение белков было наиболее полным, а режимы депротеинизации не приводили бы к инактивации низкомолекулярных РНК.

Полученный продукт дополнительно очищают переосаждением из этанола или аналогичными методами, стерилизуют пропусканием через миллипоровые фильтры, растворяют в дистиллированной воде и лиофилизируют. Его запаивают в ампулы и хранят при пониженной температуре.

Лиофильно высушенный препарат представляет собою гигроскопичный белый порошок без запаха и вкуса. В случае его хранения при температуре не выше 5 градусов активность сохраняется в течение 1 года. Хорошо растворим в воде, но полностью выпадает в осадок при добавлении к водному раствору двух объемов этанола.

Из 1 г ткани получают обычно до 0,9 мг препарата с данными характеристиками.

Готовый препарат содержит не менее 95% а низкомолекулярных РНК и не более 5% белка. Основная масса РНК состоит из молекул длиной 100-250 нуклеотидов с константой седиментации 4-8 S.

На основе полученной описанным образом низкомолекулярной РНК могут быть приготовлены любые пригодные препаративные формы (мази, кремы, лосьоны и т. п. ). В равной мере эта РНК может быть введена в состав мыл, шампуней, ополаскивателей и прочих известных косметических средств.

Для подтверждения специфической биологической активности препарата его действие испытывали на таких лабораторных животных, как кролики, крысы, мыши. Для этих целей выбривали волосы на ограниченной поверхности кожи соответствующего животного и проводили аппликации испытуемого вещества.

Предварительные опыты показали, что низкомолекулярные РНК клеточных ядер волосяных луковиц не обладают выраженной видовой специфичностью, т.е. они проявляют похожий эффект на каждом виде лабораторного животного вне зависимости от источника получения РНК, что следует из Таблицы 2.

В то же время, действие низкомолекулярных РНК клеточных ядер волосяных луковиц обладают выраженной стадиеспецифичностью.т.е. различаются по биологической активности в зависимости от стадии развития животного (молодость, зрелый возраст, старость), от которого получена соответствующая РНК, о чем свидетельствуют данные Таблицы 3. Эффективность роста волос оценивали, как указано в Примечании к Таблице 2.

Полученные результаты указывают на то, что более эффективное стимулирование роста волос обеспечивается препаратами РНК, полученными от физиологически более молодых особей, у которых наиболее активны процессы ассимиляции.

Экспериментальным путем было показано, что низкомолекулярные РНК строго органоспецифичны, т. е. способностью стимулировать рост волос обладают лишь РНК, выделенные из клеток ядер волосяных луковиц, но не обладают низкомолекулярные РНК, выделенные аналогичным образом из других органов, в частности из клеток печени и мышечной ткани.

Зависимость скорости роста волос от концентрации изучаемого препарата РНК показана в Таблице 4.

Для этих целей в качестве экспериментальной модели использовали старых крыс (возраст от 10 месяцев до 16 месяцев) линии "Вистар" весом 370-410 г. Всем животным в верхней части спины, в области, не доступной для лап и языка, обрабатывали депилаторием участок шкуры размером 3 кв. см. Одну половину голого участка шкуры ежедневно смазывали водным раствором РНК, выделенной из кожи молодых крыс. В группе контрольных животных голую поверхность кожи смазывали водой. Интенсивность роста волос оценивали, как описано ранее.

Из полученных результатов видно, что при увеличении концентрации РНК интенсивность роста волос возрастает. Дальнейшее увеличение концентрации РНК приводило к образованию густого геля, что затрудняет проникновение РНК через верхний слой эпидермиса.

Очень интересные результаты были получены при аппликации раствора низкомолекулярных РНК ядер клеток волосяных луковиц на поверхность кожи мышей линии Hairless, генетически лишенных волосяного покрова (Таблица 5).

Удивительно, но после аппликации препарата РНК имело место начало роста волос у генетически безволосых животных.

Впоследствии рост этих волос прекращался и они выпадали, но сам по себе факт хотя и временного роста волос у генетически безволосых животных свидетельствует о том, что, видимо, такие животные во-первых имеют в структуре кожи достаточно физиологически полноценные волосяные луковицы во-вторых существует некий механизм репрессии функционирования волосяных луковиц (устраняемый препаратами гетерологичной низкомолекулярной РНК ядер клеток волосяных луковиц.

Таким образом, низкомолекулярные РНК ядер клеток волосяных луковиц не только ускоряют рост волос на искусственно обезволошенных участках кожи, но и инициируют рост волос на участках, на которых ранее рост волос не наблюдался

Это свидетельствует о том, что низкомолекулярные РНК ядер клеток волосяных луковиц способны оказывать мощное влияние на физически сохранившиеся в коже волосяные луковицы; инициируя и/или стимулируя их физиологическую функциональную активность.

Изучаемые РНК относительно стабильны при введении их в организм, способны переноситься током крови и, как было установлено заявителем, связываются преимущественно с клетками органа, из которого они выделены. В ядре клетки-реципиента они, вероятно, взаимодействуют с белками, ответственными за структуру ДНК, и таким образом регулируют работу генома, вызывая активацию генов, функционирующих в данных клетках на данной стадии онтогенетического развития,

Более подробно сущность настоявшего предложения поясняется следующими Примерами.

Пример 1. Шкуру телят освобождают от волосяного покрова, отделяют подкожно-жировую клетчатки и удаляют внутреннюю часть дермы, не нарушая по возможности часть дермы и эпидермис содержащие волосяные луковицы.

100 г обработанной таким образом ткани измельчают в гомогенизаторе при температуре 4 градуса в течение 5 минут в 500 мл раствора содержащего 0,01 М Трис- HCl pH 8,5 0,001 М хлористого кальция; 0,001 М ЭДТА, 0,5% Тритон-Х-100.

Гомогенат центрифугируют при 800 g в течение 10 минут, затем отделяют осадок, промывают его в том же растворе но без Тритона-Х-100 и суспензируют в 250 мл раствора 0,1 М ацетата натрия, содержащего 0,02 М Трис-HCl pH 5,0, 0,001 М ЭДТА и 0,5% додецилсульфата натрия.

К суспензии приливают равный объем (350 мл) смеси фенолхлороформ (1:1) и прогревают в течение 10 минут на водяной бане при температуре 60 градусов.

После охлаждения систему подвергают цеyтрифугированию при 5000 об/мин в течение 20 минут и верхнюю фазу, содержащую РНК, отбирают.

Полученную верхнюю фазу центрифугата, содержащую РНК, вновь депротеинизируют при помощи той же смеси фенолхлороформ (1:1).

В результате осуществления повторной депротенизации удаляется большая часть белков, ДНК и высокомолекулярных РНК.

К верхней фазе центрифугата приливают 2,5 объема охлажденного этанола, осадок отделяют, очищают переосаждением из этанола, а затем растворяют в дистиллированной воде, стерилизуют пропусканием через миллипоровые фильтры и лиофильно высушивают. Ампулы запаивают под вакуумом и помешают в холодильник.

Выход препарата составил 950 мкг из 1 г ткани.

Полученный продукт содержал 1,7% белка и 96,2% низкомолекулярных РНК, Основную часть примесей составили РНК высокого молекулярного веса. Идентифицировались следы ДНК. Константы седиментации отдельных фракций равнялись 4 S-8 S.

Пример 2. Обработку шкур крыс и выделение фракции клеточных ядер проводили по схеме, описанной в Примере 1.

К 50 г ядерного материала добавляют 150 мл кипящего 0,01 М Трис-HCl буфера рН 6,8, содержащего 2% додецилсульфата натрия и 2% изоамилового спирта. Смесь гомогенизируют при 8000 об/мин в течение 1 минуты, доводят температуру до 93 градусов и сразу охлаждают до температуры 3 градуса, сливая ее в сосуд, погруженный в баню со смесью сухого льда с ацетоном.

Охлажденную смесь центрифугируют в течение 10 минут при 1000 g при температуре 3 градуса, надосадочную жидкость собирают и добавляют к ней 2 объема охлажденного этанола.

Осадок ресуспендируют в 50 мл 67%-ного этанола, добавляют к суспензии 1 мл 2 М раствора хлористого натрия и снова центрифугируют. Последнюю процедуру повторяют дважды.

Осадок растворяют в 50 мл дистиллированной воды, доводят рН до значения 7,0 и осветляют раствор центрифугированием в течение 1 часа при 25000 g при нулевой температуре. К надосадочной жидкости прибавляют хлористый натрий до получения 1 М раствора, оставляют на 30 минут при нулевой температуре, осаждают высокомолекулярные РНК центрифугированием.

Из супернатанта осаждают низкомолекулярные РНК, добавляя к раствору ацетат натрия до получения 0,2 М раствора, а затем 2,5 объема этанола.

Выход препарата составил 2,02 мг из 1 г ткани.

Полученный продукт содержал 1,3% а белка и 97,1% низкомолекулярных РНК. Основную часть примесей составили РНК высокого молекулярного веса. Идентифицировались следы ДНК. Среднее значение константы седиментации равнялось 6S.

Пример 3. Обработку шкур мышей и выделение фракции клеточных ядер проводили, как описано в Примере 1.

К аликвоте ядерного материала добавляют 5 объемов раствора, содержащего 6 М гуанидинизотиоцианата, 5 мМ цитрата натрия с рН 7,0, 0,1 М бета- меркаптоэтанола и 0,5% саркозила.

В этой среде ядра гомогенизируют при 4000 об/мин в течение 2 минут и добавляют по 1 г хлористого цезия на каждые 2,5 мл гомогената.

Гомогенат наслаивают на 1,2 мл 5,7 М раствора хлористого цезия в 0,1 М ЭДТА рН 7,5 в центрифужных пробирках. Систему центрифугируют в течение 20 часов при температуре 20 градусов при 30000 об/мин.

Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок РНК растворяют в 1 М растворе хлористого натрия, доводят рН до значения 7,0, охлаждают раствор до нулевой температуры и высаживают высокомолекулярные РНК центрифугированием.

Низкомолекулярные фракции РНК осаждают из супернатанта 2,5 объемами охлажденного этанола и очищают переосаждением из этанола.

Выход препарата составил 212 мкг из 1 г ткани.

Полученный продукт содержал 2,1 и белка и 95,9% низкомолекулярных РНК. Основную часть примесей составили РНК высокого молекулярного веса. Идентифицировались следы ДНК. Среднее значение константы седиментации равнялась 6,5 S.

В общетеоретическом плане известно, что при введении в организм реципиента экзогенной (активаторной) чужеродной РНК могут воспроизводиться некоторые иммунологические феномены доноров (индуцирование дифференцировки тканей, процессов развития, регенерации структур), а также эффекты некоторых биологически активных веществ [Смирнов А.В. Специфические эффекты и возможные механизмы действия экзогенных РНК. "Успехи современной биологии", 1988, Т. 106, Вып.1(4), С.20-36].

В частности, при введении лабораторным мышам и крысам с повреждениями нейронов, вызванными гипоксией, операциями трансплантации, гипертоническими растворами солей и пр., экзогенной РНК из мозга здоровых животных-доноров наблюдается восстановление структур и функций нейронов [Полежаев Л. В., Черкасова Л. В. , Витвицкий В.Н., Тимонин А.В. Нормализация синтеза белка и структуры головного мозга после действия гипоксии, 10% NaCl и органоспецифической РНК. "Доклады АН СССР", 1991, Т. 317, N 5, С. 1233-1237].

Однако в этих случаях изучалось, как правило, действие препаратов суммарной РНК (а не какой-либо ее фракции), выделенной из того или иного источника.

По данным заявителя, низкомолекулярная РНК из ядер клеток волосяных луковиц животных физиологически молодого возраста ранее для стимулирования роста волос не применялась и ее стимулирующая рост волос активность не была описана и не вытекала из известного уровня знаний. Более того, феномен временного роста волос у генетически безволосых животных под действием такой РНК, впервые установленный заявителем, вообще является уникальным. В равной мере, способов получения низкомолекулярной РНК ядер клеток волосяных луковиц с указанными свойствами не описано.

В этой связи заявитель полагает, что его предложение соответствует требованиям, предъявляемым к изобретению.