модифицированная термолизинподобная нейтральная металлопротеаза, способ синтеза бензилоксикарбонил--l- аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, способ гидролиза бензилоксикарбонил--l-аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира

Формула изобретения

1. Модифицированная термолизинподобная нейтральная металлопротеаза с аминокислотной последовательностью термолизинподобной металлопротеазы дикого типа, в которой произведена замена, по крайней мере, одного из аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из остатка лейцина в положении 144, аспарагиновой кислоты в положении 150, глутаминовой кислоты в положении 187 и аспарагина в положении 227 и эта замена произведена а) остатком серина в случае остатка лейцина в положении 144, или b) остатком аспарагина, гистидина или лизина в случае остатка аспарагиновой кислоты в положении 150, или с) остатком глутамина в случае остатка глутаминовой кислоты в положении 187, или d) остатком гистидина, лизина или аргинина в случае остатка аспарагина в положении 227.

2. Модифицированная термолизинподобная нейтральная металлопротеаза по п. 1 с аминокислотной последовательностью, в которой в положении 144 находится серин, в положении 150 - аспарагиновая кислота, в положении 187 - глутаминовая кислота и в положении 227 - аспарагин.

3. Модифицированная термолизинподобная нейтральная металлопротеаза по п. 1 с аминокислотной последовательностью, в которой в положении 144 находится лейцин, в положении 150 - аспарагин, гистидин или лизин, в положении 187 - глутаминовая кислота и в положении 227 - аспарагин.

4. Модифицированная термолизинподобная нейтральная металлопротеаза по п. 1 с аминокислотной последовательностью, в которой в положении 144 находится лейцин, в положении 150 - аспарагиновая кислота, в положении 187 - глутамин и в положении 227 - аспарагин.

5. Модифицированная термолизинподобная нейтральная металлопротеаза по п. 1 с аминокислотной последовательностью, в которой в положении 144 находится лейцин, в положении 150 - аспарагиновая кислота, в положении 187 - глутаминовая кислота и в положении 227 - гистидин, лизин или аргинин.

6. Модифицированная термолизинподобная нейтральная металлопротеаза по п. 1 с аминокислотной последовательностью, в которой в положении 144 находится серин, в положении 150 - гистидин, в положении 187 - глутаминовая кислота и в положении 227 - гистидин.

7. Модифицированная термолизинподобная нейтральная металлопротеаза по п. 1 с аминокислотной последовательностью, в которой в положении 144 находится серин, в положении 150 - аспарагин, в положении 187 - глутаминовая кислота и в положении 227 - гистидин.

8. Способ синтеза бензилоксикарбонил--l- аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, способ гидролиза бензилоксикарбонил--l-аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, патент № 2151186" SRC="/images/patents/320/2151014/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-L-аспартил-L-фенилаланин метилового сложного эфира, включающий контактирование раствора субстрата, содержащего бензилоксикарбонил--l- аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, способ гидролиза бензилоксикарбонил--l-аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, патент № 2151186" SRC="/images/patents/320/2151014/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-L-аспарагиновую кислоту и L- или D, L-фенилаланин метиловый сложный эфир, с термолизинподобной нейтральной металлопротеазой, отличающийся тем, что термолизинподобная нейтральная металлопротеаза представляет собой модифицированную термолизинподобную нейтральную металлопротеазу по пп.1 - 7.

9. Способ гидролиза бензилоксикарбонил--l- аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, способ гидролиза бензилоксикарбонил--l-аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, патент № 2151186" SRC="/images/patents/320/2151014/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-L-аспартил-L-фенилаланин метилового сложного эфира, включающий контактирование раствора, содержащего бензилоксикарбонил--l- аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, способ гидролиза бензилоксикарбонил--l-аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, патент № 2151186" SRC="/images/patents/320/2151014/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-L-аспартил-L-фенилаланин метилового эфира, с термолизинподобной нейтральной металлопротеазой, отличающийся тем, что термолизинподобная нейтральная металлопротеаза представляет собой модифицированную термолизинподобную нейтральную металлопротеазу по пп.1 - 7.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новым термолизин-подобным нейтральным металлопротеазам и к их использованию, в частности в синтезе бензилоксикарбонил --l- аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, способ гидролиза бензилоксикарбонил--l-аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, патент № 2151186" SRC="/images/patents/320/2151014/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-L- аспартил-L-фенилаланинметилового сложного эфира.

Термолизин представляет собой ценный фермент, который выпускается промышленностью и имеет широкую область применения, например, в детергентных композициях, в технологии производства пищевых продуктов, и в косметических препаратах. Кроме того, этот фермент используется в синтезе бензилоксикарбонил --l- аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, способ гидролиза бензилоксикарбонил--l-аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, патент № 2151186" SRC="/images/patents/320/2151014/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-L- аспартил-L-фенилаланинметилового сложного эфира (обозначаемого далее для краткости "Z-APM"), который является предшественником аспартама, искусственного сахаристого вещества.

Предшествующий уровень техники

Впервые термолизин был обнаружен в культуральной жидкости Bacillus thermoproteolyties (Endo S. (1962) J. Fermentation Tech, 40, 346-353), и в связи с этим был проведен ряд исследований. Так, например, были установлены аминокислотная последовательность (Titani, K., и др. (1972) Nature New Biol. 238, 35-37), и трехмерная структура этого фермента (Holmes M.A. и Matthews B.W. (1982) J. Mol. Biol. 160, 623-639). Кроме того, из Bacillus Thermoproteolyties был клонирован ген протеазы (EP-A-0418625), в результате чего оказалось, что аминокислотная последовательность зрелого фермента, выведенная из нуклеотидной последовательности указанного гена, отличается от первоначально установленной Titani первичной структуры в двух положениях. В частности, было установлено, что 37 (из амино-конца) аминокислотный остаток зрелого фермента является не аспарагиновой кислотой, а аспарагином, а 119 аминокислотный остаток является не глутаминовой кислотой, а глутамином. Эта аминокислотная последовательность идентична аминокислотной последовательности, кодированной геном npr M., одним из протеазных генов, клонированных из Bicillus steаrothermoptilus (Kubo M. и др., (1988) Journal of General Microbiology, 134, 1883 - 1892).

Поэтому в описании настоящей заявки протеазу, кодированную указанным npr M - геном или геном из Bicillus thermoproteolyties, назвали "термолизин-подобний нейтральной металлопротеазой дикого типа".

Совсем недавно сообщалось об изменении специфической активности и стабильности термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы (Kubo M., и др., (1992) Applied and Enviromental Microbiology, 58, 3779- 3783). В этой работе были описаны различные мутанты, которые отличаются в одном или нескольких аминокислотных остатках первичной структуры, в частности в положениях 93, 110, 114, 115, 136, 137, 143, 151, 157, 193, 211, 217 и 221. Но в этой работе активность измеряли лишь методом казеинового переваривания. Однако ни один из этих мутантов не обнаруживал какого-либо значительного улучшения активности в отношении Z-APM-синтеза или переваривания. В данной работе (как описано в приведенных ниже примерах) было также установлено, что активность в отношении ферментативного гидролиза казеина не коррелирует с активностью в отношении Z-APM-синтеза; то есть оказалось, что если даже специфическая активность в отношении гидролиза казеина возрастает, то при этом не всегда возрастает специфическая активность в отношении Z-APM-синтеза.

На основании этих наблюдений и исходя из различных проблем, связанных с недостаточностью ферментативного синтеза Z-APM (например, относительно низкая активность фермента, инактивация фермента во время реакции конденсации и гидролиза продукта Z-APM и исходного материала L- или D, L-фенилаланинметилового сложного эфира (PM) ), обусловленной чрезмерной продолжительностью реакционного времени, и/или неблагоприятными pH-условиями, совершенно очевидно, что необходимо разработать такие ферменты, которые имели бы более высокую активность в отношении синтеза Z-APM, чем термолизин дикого типа. Следует отметит, что в настоящей заявке принятое выше обозначение PM относится также и к солям этого сложного эфира.

Краткое описание изобретения

Целью настоящего изобретения является решение указанных выше проблем. Было установлено, что путем соответствующей замены аминокислот в соответствующих положениях, выбранных из различных кандидатов, могут быть получены ферменты, обладающие прекрасными свойствами. Так, например, из термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы, имеющей аминокислотную последовательность (дикого типа) SEQ ID N 1, показанную в конце описания, могут быть получены новые протеазы путем замены одной или нескольких аминокислотных остатков в определенных положениях указанной последовательности другими аминокислотными остатками, отличающимися от исходных. В частности, новые модифицированные протеазы настоящего изобретения были получены из протеаз дикого типа путем замены, по крайней мере, одного из следующих аминокислотных остатков: 144 (лейцин), 150 (аспарагиновая кислота), 187 (глутаминовая кислота) и 327 (аспарагин), другими, отличающимися от указанных аминокислотными остатками.

В частности, модифицированные ферменты, имеющие вышеуказанную последовательность, но модифицированную, по крайней мере, в одном из аминокислотных остатков в положениях 144, 150, 187 и 227, обнаруживают более высокую специфическую активность в отношении синтеза или гидролиза Z-APM, чем фермент дикого типа. Это обстоятельство позволяет решить проблемы повышения активности термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы, происходящей от Bacillus stearothermophilus, в отношении синтеза Z-APM. Кроме того, указанные ферменты обладают более высокой активностью при более низком pH, в результате чего во время синтеза Z-APM имеет место меньший гидролиз Z-APM и PM.

Следует отметить, что те ферменты, которые были получены путем замены в двух или нескольких из указанных выше положений, разумеется, входят в объем настоящего изобретения. Это относится также и к тем ферментам, которые были получены путем замены, по крайней мере, одного из указанных выше аминокислотных остатков, и путем дополнительной замены, по крайней мере, одного из других аминокислотных остатков отличающимся от него аминокислотным остатком.

Подробное описание изобретения

Новые протеазы настоящего изобретения представляют собой производные, имеющие модифицированную последовательность, отличающуюся от последовательности термолизин-подобной нейтральной протеазы дикого типа. В частности, эта новые протеазы обладают повышенной активностью в отношении Z-APM-ситнтеза и гидролиза. Этот факт в основном был установлен путем анализа активности в отношении Z-APM-синтеза и/или гидролиза и сравнения этих активностей с активностями термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы дикого типа, определенными аналогичным способом. Этот способ описан в приведенных ниже примерах.

Модифицированные ферменты могут быть получены способами известными perse.

Предпочтительный способ получения модифицированных протеаз настоящего изобретения предусматривает введение изменений в аминокислотную последовательность, по крайней мере, в одном из заранее определенных положений, таких, как 144, 150, 187 и 227 положения, термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы с использованием техники рекомбинантных ДНК. Пригодность полученных протеаз может быть установлена с помощью аналитических тестов на соответствие конечным целям применения. Для введения мутаций в клонированные ДНК может быть использован ряд известных способов. Например, фрагменты мутантного npr M-гена получали методом мутагенеза фага M13 (Vandeyar M., и др. , (1988) Gene 65, 129).

В этом методе плазмид и фаговые ДНК, используемые в качестве матриц, были получены из известной плазмиды pMK1 (Kubo M., и Jmanaka T., (1989) J.Bacteriol, 171, 4080 - 4082). Для переваривания и клонирования фрагментов npr M-гена в другую плазмиду или в фаговые векторы было использовано несколько рестриктирующих эндонуклеаз. При этом мутагенные праймеры должны быть комплементарны одноцепочечной матричной ДНК, содержащей npr M-ген, за исключением кодона (или кодонов) для заменяемого аминокислотного остатка (или остатков). Для этих целей могут быть использованы различные нуклеотидные последовательности. Используя указанные мутагенные праймеры, которые имеют соответствующий кодон (кодоны) для заменяемого аминокислотного остатка (остатков), могут быть получены нужные аминокислотные замещения.

Альтернативно npr M-ген может быть мутирован с помощью техники PCR (полимеразно-цепной реакции), использующей химически синтезированные праймеры (Higuchi R. , Kzummel B., и Saiki R.K. (1988) Nucleic Acids Res., 16, 7351-7367). Указанный PCR-метод является особенно предпочтительным, если сайты рестриктирующих ферментов находятся поблизости от сайта мутации. Так, например, поскольку сайт рестрикции для рестриктирующего фермента Sph1 находится вблизи кодона для аспарагиновой кислоты в 150 положении термолизин-подобной металлопротеазы дикого типа, то для продуцирования мутантов в 150-положении могут быть использованы мутагенные праймеры, содержащие этот Sph1-сайт. Таким образом, указанный мутагенный праймер используется в качестве смыслового праймера. В качестве обратно направленного (антисмыслового) праймера может быть использован олигонуклеотид, являющийся комплементарным npr M-гену, расположенному ниже (в прямом направлении), например, сайта рестрикции Aat1 гена npr M-гена.

Для осуществления мутагенеза в более чем одном сайте могут быть использованы два способа. Один способ заключается в проведении одновременного мутагенеза во всех целевых сайгах, тогда, как второй способ предусматривает последовательное введение мутаций, фактически оба способа позволяют получить плазмиды с мутациями в нескольких сайтах.

В общих чертах способ получения рекомбинантной термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы описан в литературе (Kubo M. и Imanaka (1989) J. Bacteriol, 171, 4080 - 4082), и включает в себя: введение ДНК, кодирующей модифицированную термолизин-подобную нейтральную металлопротеазу, в экспрессирующий вектор; использование указанного вектора для трансформации клетки-хозяина; культивирование полученного трансформанта до тех пор, пока в культуре не будет аккумулироваться модифицированная металлопротеаза; и наконец, выделение модифицированного фермента из культуры. Однако используемая в этой работе плазмида pMK1 имеет размер более чем 20 кв, а поэтому осуществление трансформации ebschrichia coli с использованием этой плазмиды представляется довольно затруднительным. Более того, было обнаружено, что и в случае Bacillus subtilis плазмида pMK1 в значительной степени "выбывает" из более поздней стадии культивирования.

Поэтому для решения указанных проблем заявители сконструировали челночные векторы, с помощью которых могут быть трансформированы оба хозяина: E. coli и B.subtilis и которые могут экспрессировать npr M-ген в этих хозяевах. Так, например, были сконструированы два челночных вектора, содержащие ген npr M (pUBTZ1 и pUBTZ2) (см. рис. 1-4). При их использовании для трансформации таких штаммов E. coli, как HA101 и JM103, в этих штаммах экспрессировался npr М-ген. Кроме того, трансформация таких штаммов Bacillus subtilis как DB104, DB117 и МТ-2 с помощью указанных плазмид способствовала успешной экспрессии npr М-гена. При этом в последней стадии культивирования также не наблюдалось факта "выпадения" плазмид.

Аналогичные результаты и преимущества использования этих челночных векторов были получены с использованием генов модифицированной термолизин-подобной металлопротеазы вместо гена дикого типа.

Модифицированная термолизин-подобная нейтральная протеаза может быть продуцирована в рекомбинантных бактериях и секретирована в культуральных средах. Эти протеазы выделяют путем осаждения сульфатом аммония и очищают до гомогенности традиционным способом, например, с помощью гидрофобной хроматографии и/или гель-фильтрации.

Использование модифицированных протеаз для синтеза Z-APM, который является предшественником аспартама, более эффективно, чем использование термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы дикого типа. Такой вывод был сделан в результате сравнения активностей модифицированных протеаз с активностями фермента дикого типа в отношении Z-APM-гидролиза и Z-APM-синтеза. Эти сравнения показали, что активности модифицированных протеаз значительно выше активностей фермента дикого типа. Измерение величин указанных активностей описано в примерах, представленных ниже.

Было установлено, что в настоящем изобретении большое значение для усиления активности в отношении Z-APM-гидролиза и синтеза имеют положения 144, 150, 187 и 227 в амино-конце последовательности термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы, особенно в сочетании двух или трех указанных cайтов.

Следует отметить, что активность гидролиза казеина не коррелирует с активностью Z-APM-синтеза или гидролиза. Если сравнить активности мутантных ферментов для казеина и Z-APM, то будет совершенно очевидно, что даже при снижении активности казеинового гидролиза активность в отношении Z-APM-синтеза и/или гидролиза может значительно возрастать. Представленные ниже примеры лишь иллюстрируют настоящее изобретение и никоим образом не должны рассматриваться как ограничение его объема.

Пример 1

(Синтез мутантной термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы, имеющей мутацию в 187-(Пример A) или в 227 (Пример 1B) аминокислотном остатка)

1 мкг плазмиды pMK1, содержащей npr M-ген термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы, происходящей из Bacillus stearothermophilus MK232, переваривали 5 единицами каждого из pst1 и Bam H1 в 20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5 10 мМ MgCl₂, 1 мМ ДТТ ) при 37^oC в течение 2 ч.

Образец подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле, и ДНК-фрагмент (приблизительно 3,5 кв ) выделяли и очищали с использованием набора для очистки ДНК (Bio-101 Gene Clea - n DNA).

Отдельно 1 мкг плазмиды PU C9 обрабатывали 5 единицами каждого из Pst1 и Bam H1 в 20 мкл той же самой реакционной смеси (см. выше) при 37^oC в течение 2 ч.

Pst1 - Bam H1-фрагмент npr M-гена лигировали с Pst1 - Bat H1 переваром плазмиды pU C9 с использованием набора для лигирования ДНК (Takara Shuzo). Эту лигирующую смесь использовали для трансформации E.coli JM109 традиционным способом, в результате чего получали рекомбинантную плазмиду (pUCTZ55), содержащую Pst1 - Bam H1- фрагмент гена npr М (фиг. 5).

1 мкг рекомбинантной плазмиды pUCTZ55 переваривали 5 единицами каждого из ферментов Spt1 и Bc11 в 20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорид при 7,5, 10 мM MgCl₂, 100 мМ NaCl, 1 мM ДТТ) при 37^oC в течение 2 ч. Образец подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле, и ДНК-фрагмент приблизительно в 550 т. п. о. выделяли и очищали с использованием набора для очистки ДНК (Bio101 Clean DNA).

Отдельно 1 мкг фагового вектора M13 mp18 переваривали 5 единицами каждого из Sph1 и Bam H1 в 20 мкл той же самой реакционной смеси (см. выше) при 37^oC в течение 2 ч.

Sph1 - Bc 11-фрагмент гена npr M лигировали с Sph1 - Bam H1-переваром вектора M13mp18 с использованием набора для лигирования ДНК (Takara Shuzo). Полученную лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli JM109 стандартным способом, в результате чего получали рекомбинантный фаг (M13TZSp-Bc), содержащий Sph1-Bc11-фрагмент npr M-гена (рис. 6).

Из этого M13TSZp-Bc стандартным способом получали одноцепочечную ДНК и подвергали мутагенезу. Олигонуклеотиды, используемые для мутагенеза, получали с помощью ДНК-синтезатора (Applied Biosystems, модель 380B).

Ниже приводятся мутагенные олигонуклеотиды, используемые для замены 187 остатка (глутаминовую кислоту на глутамин) (Пример 1A) и 227 остатка (аспарагин на гистидин) (Пример 1B).

-l- аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, способ гидролиза бензилоксикарбонил--l-аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, патент № 2151186" SRC="/images/patents/320/2151186/2151186-2t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">

Мутагенез осуществляли с использованием набора для in vitro мутагенеза USB T7-GEN, после чего полученную ДНК секвенировали для подтверждения наличия мутации.

Двухцепочечную ДНК мутированного M13TZSp-Bc получали традиционным способом, и 1 мкг полученной двухцепочечной ДНК переваривали 5 единицами каждого из Sph1 и Act1 в 20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорид при pH 7,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ) при 37^oC в течение 2 ч, после чего каждый образец подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле. ДНК-фрагмент в около 550 кв выделяли из каждого M13TZSp-Bc-перевара, и полученные ДНК-фрагменты очищали с использованием набора для очистки ДНК (Bio101 Gene Clean DNA).

Одновременно фрагмент вектора для экспрессии в Bacillys subtilis продуцировали способом, описанным ниже. Из плазмиды рМК4 (Jamada и др., (1991) Gene, 32, 109 - 114), ДНК-фрагмент (около 1,0 кв), содержащий часть npr М-гена, переваривали ферментом Bc11 и клонировали в Bam H1-caйте плазмиды pUC9 в целях конструирования плазмиды pUCTZ37 (рис. 1).

Эта плазмида pUCTZ37 была неполной, т.е. она не содержала 5"-концевую область npr М-гена. Плазмиду pUCTZ37 переваривали рестриктирующей эндонуклеазой Hind111 и Hind11-фрагмент (около 1,2 кв) от рМК4 клонировали в больший фрагмент pUCTZ37 для конструирования плазмиды pUCTZ47 (рис. 2). Рекомбинантная плазмида pUCTZ47 содержала полную последовательность npr M и его последовательность промотора транскрипции.

Для конструирования челночных векторов для E.coli и Bacillus subtilis обе плазмиды pUCTZ47 и pB110 (Lacey и др., 1974) переваривали ферментом EcoRI и лигировали с использованием полинуклеотидкиназы Т4, в результате чего получали конструкцию плазмиды pUBTZ1, как показано на рис. 3.

И наконец, ДНК-фрагмент между сайтами рестрикции для эндонуклеаз Sma1 и Pvu11 удаляли из плазмиды pUBTZ1, как показано на рис. 4, и получали в результате плазмиду pUBTZ2. Пдазмида pUBTZ2 имела уникальные сайты рестрикции для Bam H1, Sph1 и Aat 1 в гене npr М. Замену гена дикого типа мутантным геном осуществляли в соответствии с приведенными ниже описаниями.

Плазмиду pUBTZ2 переваривали ферментами Sph1 и Aat1, а фрагмент 7,6 кв выделяли. Мутированные Sph1-Aat1-фрагменты npr M-гена (около 550 п.о.) лигировали с полученным Sph1-Aat1-фрагментом плазмиды pUBTZ2 с использованием набора для лигирования ДНК (Takara Shuzo). Лигирующую смесь использовали для трансформации E.coli JM103 стандартным способом, в результате чего получали рекомбинантные плазмиды pUBTZ2 (E1870) и pUBTZ2 (N227H) (рис. 7).

Рекомбинантную плазмиду pUBTZ2 (мутант) трансформировали в штамм МТ-2 Subtilis традиционным способом. Клеточную суспензию наносили путем разбрасывания на чашку с LB-агаром, содержащим 1% казеин и 5 мкг/мл канамицина и инкубировали в течение ночи при 37^oC. И наконец, путем выделения галообразующих колоний получали рекомбинантную плазмиду pUBTZ2 (мутант).

Единичную колонию рекомбинантного Bacillus MT-2/pUBTZ2 (мутанта) переносили в 5 мл LB-среды, содержащей канамицин (5 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37^oC. Эту культуру переносили в 500 мл 2 L-среду (2% Бактотриптон, 1% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl), содержащую канамицин (5 мкг/мл), и инкубировали в течение 20 ч при 37^oC. Культуральную жидкость центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 мин для удаления бактерий, к супернатанту добавляли сульфат аммония до получения 60% насыщения, и полученную смесь размешивали в течение ночи при 4^oC

Преципитат выделяли путем центрифугирования и растворяли в 10 мл Буфера A (20 мМ Трис-гидрохлорид, pH 9,0, 10 мM CaCl₂). Этот раствор вводили в 20 мл Бутил-Toyopeasl, а затем элюировали буфером A со скоростью потока 1,5 мл/мин. Активные фракции объединяли и подвергали высаливанию с использованием 60% насыщенного сульфата аммония. Преципитат собирали путем центрифугирования при 15000 об/мин в течение 30 мин и растворяли в 5 мл Буфера B (20 мМ Трис-гидрохлорид при 7,5, 10 мM CaCl₂). Затем ферментный раствор вводили в колонку для гель-фильтрации (ТSК Gel G2000 SW 21,5 x 600 мм), с последующим элюированием Буфером B со скоростью потока 1 мл/мин. Активные фракции элюата объединяли и получали очищенный фермент.

Пример 2

(Синтез мутантной термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы, имеющей мутацию в 144 аминокиолотном остатке, полученную c помощью неспецифического мутагенеза).

Рекомбинантный фаг M13ZBa-Sp, содержащий Bam H1-Sph1-фрагмент npr М-гена получали способом, аналогичным способу, описанному в Примере 1, за исключением того, что вместо рестриктирущих ферментов (Pst1 и Bam H1 использовали Bam H1 и Sph1), а вместо М13-фагового вектора mp18 использовали mp19. Процедура получения рекомбинантного фага M13TZBa-Sp показана на рис. 8.

Одноцепочечную ДНК M13TZBa-Sp инкубировали при 21,5^oC в течение 4,5 ч в 20 мкл 0,25 М натрийацетатного буфера, содержащего 1M нитрита натрия (pH 4,3), и выделяли ДНК путем осаждения этанолом.

Выделенную ДНК растворяли в реакционной смеси для PCR (67 мМ Трис-гидрохлорид, pH 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl₂, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,2 мМ dATP, 0,2 мM dTTIP, 0,2 мМ dGTP, 0,2 мM dCTP, 1 мкМ раннего универсального праймера M13, 1 мкМ обратного праймера M13), и добавляли 1 ед. Tth-ДНК-полимеразы. Сверху на раствор наносили одну каплю минерального масла. Денатурацию (при 93^oC, 1 мин), отжиг (при 45^oC, 1 мин) и наращивание (при 72^oC, 45 с) повторяли 30 раз. После окончания реакции водный слой выделяли, экстрагировали фенолом, и обрабатывали этанолом, после чего амплифицированную ДНК выделяли путем осаждения.

Половину от полученного количества ДНК переваривали 5 единицами каждого из ферментов Bam H1 и Sph1 при 37^oC в течение 2 часов в 20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ). Затем эту реакционную смесь инкубировали при 70^oC в течение 5 мин. Мутированный Bam H1-Sph1-фрагмент лигировали с Bam H1-Sph1-фрагментом плазмиды pUBTZ2 (7,4 кв), используя набор для лигирования ДНК (Takara Shuzo). Лигирующую смесь использовали для трансформации E.coli JM103 стандартным методом и получали трансформант JM103/pUBTZ2 (мутант).

3 мл щелочного раствора (0,2 н. NaOH, 0,2% ДСН) добавляли в агаровую чашку, содержащую трансформантные колонии, для растворения этих колоний, после чего выделяли 1 мл раствора. К этому раствору добавляли 1 мл 5 М ацетата калия и полученную смесь центрифугировали 20 мин, а затем после выдерживания на льду 10 мин преципитат удаляли. Супернатант обрабатывали фенолом и осаждали этанолом. После осушки в вакууме преципитат растворяли и использовали в качестве мутантной библиотеки.

Штамм МТ-2 Bacillus subtilis трансформировали с помощью мутантной библиотеки стандартным способом. Клеточную суспензию наносили на чашки с LB-агаром, содержащие 1% казеин и 5 мкг/мл канамицина, и инкубировали в течение ночи при 37^oC, после чего выделяли 140 галообразующих колоний.

Одиночные колонии переносили в 3 мл LB-среду, содержащую 5 мкг/мл канамицина, и в течение ночи инкубировали при 37^oC. Культуру центрифугировали 5 мин при 10000 об./мин, а затем к 1,2 мл супернатанта добавляли 0,3 мл насыщенного раствора аммония и 0,04 мл бутил-тоиопеарла (toyopearl 650S). Полученную смесь размешивали и выдерживали при комнатной температуре 5 мин. Затем раствор центрифугировали при 10000 об./мин в течение 1 мин для удаления супернатанта, а полученный осадок суспендировали в промывочном растворе (8 мМ Трис-гидрохлорид при pH 8,0, 8 мМ хлорида кальция, 20% насыщенный сульфат аммония) и упаковывали в колонку небольшого диаметра, имеющую форму пипетки. После промывки 0,6 миллилитрами промывочного раствора фермент элюировали 0,3 миллилитрами элюента (содержащего 10 мМ Трис-гидрохлорид при pH 8,0, 10 мМ хлорида кальция). Этот ферментный раствор обессоливали с помощью гель-фильтрации (Сефадекс PD10), в результате чего получали 0,5 мл очищенного ферментного раствора.

Концентрацию фермента определяли путем анализа на связывание с красителями (Bradford M. M. (1976), Anal Biochem., 72, 248 - 254), а активность Z-APM-гидролиза измеряли путем скрининга мутированных ферментов следующим образом.

1 мл субстратного раствора (10 мМ Трис-малеата при pH 8,0, 10 мМ хлорида кальция, 10 мМ Z-APM) смешивали с 0,05 мл ферментного раствора и инкубировали 20 мин при 37^oC. Затем добавляли 0,5 мл стоп-раствора (0,1 М уксусной кислоты) с последующим добавлением 1 мл раствора нингидрина. После 15-минутного инкубирования при 100^oC добавляли 2 мл 50% этанола и измеряли оптическую плотность при 570 нм. Специфическую активность, определяемую как изменение оптической плотности на миллиграмм ферментного белка, выражали в относительных величинах по отношению к ферменту дикого типа. Были получены два клона, имеющие наиболее высокую активность в отношении Z-APM-гидролиза:

Фермент - Активность к Z-APM-гидролизу (%)

дикого типа - 100

клон 1 - 260

клон 2 - 280

Следует отметить, что указанные величины активности были определены путем грубой оценки.

Из этих двух клонов экстрагировали плазмидную ДНК и определяли нуклеотидные последовательности этих клонов. Из полученных нуклеотидных последовательностей было установлено, что эти два клона являются идентичными, и что 38 глициновый остаток и 144 лейциновый остаток были заменены глутамином и серином соответственно. Далее полученный клон обозначали G380-L144S.

1 мкг каждой из плазмид pUBTZ2(G280-L144S) и pU13TZ2 (дикого типа) инкубировали в 20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при 7,5, 10 мМ хлорида магния, 50 мМ хлорида натрия, 1 мМ ДТТ), содержащей 5 ед. Hind111, при 37^oC в течение 2 ч. Эти образцы подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле, в результате чего выделяли ДНК-фрагмент в около 1,1 кв и ДНК-фрагмент в около 7 кв соответственно, и оба фрагмента очищали с использованием набора для очистки ДНК (B10-101 Gene Clean DNA).

ДНК-фрагмент (около 7 кв), происходящий от pUBTZ2(G38Q-L144S) и ДНК-фрагмент (около 1,1 кв) от плазмиды pUBTZ2 (дикого типа), лигировали с использованием набора для лигирования ДНК Takaza Shuzo. Каждую лигирующую смесь использовали для трансформации E.coli JM103 стандартным методом. Трансформанты скринировали путем быстрого выделения ДНК и ДНК-секвенирования и выделяли клон pUBTZ2 (L144S).

Каждую единичную колонию каждого трансформанта Bacillus subtilis MT-2/pUBTZ2(G380-L144S) и MT-2/pUBTZ2(L144S) переносили в 5 мл LB-среды, содержащей канамицин (5 мкг/мл), и выдерживали в течение ночи при 37^oC. Полученную культуру переносили в 500 мл 2L-среды (2% Бакто-триптон, 1% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl), содержащую канамицин (5 мкг/мл), и инкубировали 20 ч при 37^oC. Культуральную жидкость центрифугировали 30 мин при 8000 об. /мин для удаления бактерий, после чего добавляли к супернатанту сульфат аммония до достижения 60% насыщения, и полученную смесь размешивали при 4^oC в течение ночи.

Осадок выделяли путем центрифугирования и растворяли в 10 мл Буфера A (20 мM Трис-гидрохлорид при pH 9,0, 10 мМ CaCl₂). Полученный раствор вводили в 20 мл Бутил-Toyopear1, а затем элюировали Буфером A со скоростью потока 1,5 мл/мин. Активные фракции объединяли и высаливали с помощью 60% насыщенного сульфата аммония. Преципитат собирали путем центрифугирования при 15000 об/мин в течение 30 мин и растворяли в 5 мл Буфера B (20 мМ Трис-гидрохлорид при pH 7,5; 10 мM CaCl₂). Затем ферментный раствор вводили в колонку для гельфильтрации (TSKGel G2000 SK 21,5 x 300 нм) с последующим элюированием Буфером B со скоростью потока 1 мл/мин. Активные фракции собирали и получали в результате каждый очищенный фермент.

Пример 3

(Синтез мутантной термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы, которая имеет мутацию в 150 аминокислотном остатке)

Олигонуклеотиды, используемые для мутагенеза, синтезировали с помощью ДНК-синтезатора (Модель 380B, производства Applied Biosystems Co. LTD). Праймеры для мутагенеза имели следующие нуклеотидные последовательности:

-l- аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, способ гидролиза бензилоксикарбонил--l-аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, патент № 2151186" SRC="/images/patents/320/2151186/2151186-3t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">

Кроме того, был синтезирован антисмысловой праймер, имеющий следующую нуклеотидную последовательность:

(SEQ ID N 7)

5"-GAGATACCACTTTATTTCACCCCA-3"

1 нг плазмиды pUBTZ2 растворяли в 100 мкл реакционной смеси для PCR (67 мМ Трис-гидрохлорид, pH 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мM MgCl₂ 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,05 мМ dATP, 0,05 мМ dTTP, 0,05 мM dGTP, 0,05 мМ dCTP, 1 мкМ праймера для мутагенеза, 1 мкМ антисмыслового праймера), и добавляли 1 ед. Tth-ДНК-полимеразы. Полученный раствор покрывали одной каплей минерального масла. Денатурацию (93^oC, 1 мин), отжиг (45^oC, 1 мин) и наращивание (72^oC, 45 сек) повторяли 30 раз. После завершения реакции водный слой выделяли, экстрагировали фенолом и обрабатывали этанолом, в результате чего выделяли амплифицированную ДНК.

20 мкл реакционной смеси 50 мМ Трис-гидрохлорида, pH 7,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мM NaCl, 1 мM ДТТ, содержащую половинное количество ДНК, гидролизовали 5 единицами каждого из Sph1 и Aat1 в течение 2 ч при 37^oC и инкубировали 5 мин при 70^oC. Мутированный Sph1-Aat1-фрагмент лигировали с Sph1-Aat1-фрагментом от плазмиды pUBTZ2 (7,6 кв) с использованием набора для лигирования ДНК (Takara Shuzo). Лигирующую смесь использовали для трансформации E.coli JM103 стандартным методом, в результате чего получали трансформант JM103/pUBTZ2 (мутант). Замещение аминокислоты подтверждали путем определения нуклеотидной последовательности этой плазмиды.

Единичную колонию трансформанта B.subtilis МТ-2/pUBTZ2 (мутант) переносили в 5 мл LВ-среды, содержащей канамицин (5 мкг/мл), и оставляли на ночь при 37^oC. Эту культуру переносили в 500 мл 2L-среды (2% Бакто-триптон, 1% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl), содержащий канамицин (5 мкг/мл), и инкубировали 20 ч при 37^oC. Культуральную жидкость центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 мин для удаления бактерий, после чего к супернатанту добавляли сульфат аммония до 60%-ного насыщения, и полученную смесь размешивали в течение ночи при 4^oC.

Осадок, выделенный путем центрифугирования, растворяли в 10 мл Буфера A (20 мМ Трис-гидрохдорид, pH 9,0, 10 мM CaCl). Этот раствор вводили в 20 мл Бутил-Toyopear1, а затем элюировали Буфером A со скоростью потока 1,5 мин. Активные фракции объединяли и высаливали с использованием 60% насыщенного сульфата аммония. Осадок собирали путем центрифугирования при 15000 об/мин в течение 30 мин, и растворяли в 5 мл Буфера B (20 мМ Трис-гидрохлорид, pH 7,5, 10 мM CaCl₂). После этого ферментный раствор вводили в колонку для гель-фильтрации (TSK Ge1 G2000 SW 21,1 х 600 мм) и элюировали Буфером C со скоростью потока 1 мл/мин. Активные фракции объединяли и получали каждый очищенный фермент.

Пример 4

(Синтез мутантной термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы, имеющей мутации в 144, 150 и 227 аминокислотных остатках).

Мутанты в трех положениях термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы конструировали следующим образом. Плазмиду pUBTZ2 (N227H), которая содержит мутацию в кодоне для 227 аминокислотного остатка (гистидин вместо аспарагина), использовали в качестве матрицы для полимеразно-цепной реакции. Как и в Примере 3, использовали такие же праймеры для мутагенеза и антисмысловой праймер.

Праймеры для мутагенеза:

-l- аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, способ гидролиза бензилоксикарбонил--l-аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, патент № 2151186" SRC="/images/patents/320/2151186/2151186-4t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">

1 нг плазмиды pUBTZ2 (N227H) растворяли в 100 мкл реакционной смеси PCR (67 мM Трис-гидрохлорид, pH 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl₂, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,05 мМ dATP, 0,05 мМ dTTP, 0,05 MM dCTP, 0,05 мM dCTP, 1 мкМ праймера для мутагенеза, 1 мкМ антисмыслового праймера), и добавляли 1 ед. Tth-ДНК-полимеразы. Раствор покрывали одной каплей минерального масла. Денатурацию (93^oC, 1 мин), отжиг (45^oC, 1 мин) и наращивание (72^oC, 45 с) повторяли 30 раз. Поcле этой реакции водный слой удаляли, экстрагировали фенолом и осаждали в этаноле, в результате чего выделяли амплифицированную ДНК (D150N - N227H (Пример 4A), D150H-N227H (Пример 4B)).

20 мкл реакционной смеси (50 мМ Триc-гидрохлорид, pH 7,5, 10 мM MgCl₂ 100 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ), содержащей половинное количество ДНК, гидролизовали 5 единицами каждого фермента Sph 1 и Aat1 в течение 2 ч при 37^oC и обрабатывали 5 мин при 70^oC. Мутированный Sph1-Aat1-фрагмент лигировали c 7,6 кв - Sph1-Aat1-фрагментом плазмиды pUBTZ2 (L144S), используя набор для лигирования ДНК (Takaza Shuzo). Лигирующую смесь использовали для трансформации E. coli JM103 стандартным способом, в результате чего получали трансформант JM103/pUBTZ2 (мутант). Замещение аминокислоты подтверждали путем определения нуклеотидной последовательности этой плазмиды.

Единичную колонию трансформанта Bacillus subtilis MT-2/pUBTZ2 (мутант) инокулировали в 5 мл B-среде, содержащей канамицин (5 мкг/мл), в течение ночи при 37^oC. Затем эту культуру переносили в 500 мл 2 L-среды (2% Bacto-триптон, 1% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl), содержащей канамицин (5 мкг/мл), и инкубировали 20 ч при 37^oC. Культуральную жидкость центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 мин для удаления бактерий, после чего добавляли к супернатанту cульфат аммония до 60% насыщения, и полученную смесь размешивали в течение ночи при 4^oC.

Осадок, выделенный путем центрифугирования, растворяли в 10 мл буфера (20 мМ Трис-гидрохлорид, pH 9,0, 10 мМ CaCl₂). Этот раствор вводили в 20 мл Бутил-Toyopear1 и элюировали тем же буфером со скоростью потока 1,5 мл/мин. Активные фракции объединяли и обессоливали c помощью 60% насыщенного сульфата аммония. Осадок собирали путем центрифугирования при 15000 об/мин в течение 30 мин и растворяли в 5 мл буфера (20 мМ Триc-гидрохлорида, pH 7,5, 10 мМ CaCl₂). Ферментный раствор затем вводили в колонку для гель-фильтрации (TSK GeI G2000 SW 21,5 х 600 мм), и элюировали тем же самым буфером со скоростью потока 1 мл/мин. Активные фракции объединяли и получали каждый очищенный фермент (L144S-D150N-N227H (Пример 4A), L144S-D150H-N227H (Пример 4B)).

Два рекомбинантных штамма Bacillus subtilis, которые экспрессируют модифицированную термолилизин-подобную нейтральную металлопротеазу настоящего изобретения, а именно Bacillus subtilis MT-2/pUBTZ2(TZ-1), где лейциновый остаток в 144 положении заменен на серин; остаток аспарагиновой кислоты в 150 положении заменен на гистидин, а аспарагиновый остаток в 227 положении заменен на гистидин; и Bacillus subtilis MT-2/pUBTZ2(TZ-2), где лейциновый остаток в 144 положении заменен на серин, остаток аспарагиновой кислоты в 150 положении заменен на аспарагин, а аспарагиновый остаток в 227 положении заменен на гистидин, были депонированы в Научно-исследовательском институте ферментации, в Агентстве технических наук и технологии и в Министерстве международной торговли и промышленности Японии (1-3, Higashi I-Chome, Tsukuba-Shi, Ibaraki, 305 Japan) под номерами допуска NN FERM BP-4112 и FERM BP-4113 соответственно.

На рис. 9 показана схема конструирования рекомбинантной плазмиды pUBTZ2 (мутанта) (L144S - D150N - N227H или L144S - D150H - N227H).

Пример 5

(Определение активности при гидролизе казеина и гидролизе Z-APM)

Для определения активности гидролиза казеина и активности гидролиза Z-APM использовали различные модифицированные ферменты, такие, как N227H, обозначающий фермент, который в 227 положении содержит гистидин (вместо аспарагина); N227K, обозначающий фермент, который в 227 положении содержит лизин (вместо аспарагина); N227P, обозначающий фермент, который в 227 положении содержит аргинин (вместо аспарагина) L144S, обозначающий фермент, который в 144 положении содержит серин (вместо лейцина), E1870, обозначающий фермент, который в 187 положении содержит глутамин (вместо глутаминовой кислоты), D150N, обозначающий фермент, который содержит в 150 положении аспарагин (вместо аспарагиновой кислоты), D150H, обозначающий фермент, который в 150 положении содержит гистидин (вместо аспарагиновой кислоты), L144S - D150N - N227H, обозначающий фермент, который в 144 положении содержит серин (вместо лейцина), в 150 положении содержит аспарагин (вместо аспарагиновой кислоты), в 227 положении содержит гистидин (вместо аспарагина); и L144S - D150H - N227H, обозначающий фермент, который в 144 положении содержит серин (вместо лейцина), в 150 положении содержит гистидин (вместо аспарагиновой кислоты), и в 227 положении содержит гистидин (вместо аспарагина).

В случае гидролиза казеина 1 мл раствора каждого очищенного фермента (полученного путем растворения фермента в 10 мM боратного буфера, pH 8,0, 2 мМ сульфата кальция) добавляли к 1 мл субстратного раствора (1% казеина, 1/15 М фосфатного буфера, pH 7,2). Смесь инкубировали 10 мин при 35^oC, а затем добавляли 2,0 стоп-раствора (0,1 М TCA, 0,2 М ацетата натрия, 0,3 М уксусной кислоты) и инкубировали 30 мин при 35^oC. После фильтрации к 1 мл фильтрата добавляли 5 мл щелочного раствора (0,4 М карбоната натрия) и 1 мл реагента Folin (5-кратное разведение фенолового реагента дистиллированной водой), и полученную смесь инкубировали 20 мин при 35^oC. Затем измеряли оптическую плотность смеси при 660 нм. Одну единицу (PV) фермента выделяли из некоторого количества молочного казеина от гидролизного продукта, который способен давать окраску фолина (как определяли путем увеличения оптической плотности при 660 нм), эквивалентную 1 мкг тирозина за 1 мин ранней стадии реакции при 35^oC, pH 7,2. Специфическую активность (PV/мг) определяли по отношению к ферменту дикого типа и эти относительные значения систематизировали в табл. 1.

В случае гидролиза Z-APM 0,5 мл раствора каждого очищенного фермента (полученного путем растворения фермента в 10 мМ Трис-малеатного буфера при pH 8,0, 10 мМ хлорида кальция) добавляли к 0,5 мл субстратного раствора (10 Трис-малеата, pH 8,0, 10 мМ хлорида кальция, 10 мМ Z-APM. Полученную смесь инкубировали 20 мин при 37^oC, а затем добавляли 0,5 мл стоп-раствора (0,1 М уксусной кислоты), с последующим добавлением 1 мл нингидринового раствора. После 15-минутной обработки при 100^oC добавляли 2 мл 50% этанола и измеряли оптическую плотность при 570 нм. Специфическую активность определяли как изменение оптической плотности на мг фермента и выражали в виде относительных величин по отношению к ферменту дикого типа. Полученные результаты представлены в табл.1.

Пример 6

(Активность для Z-APM-синтеза)

Для определения активности при Z-APM-синтезе были использованы различные модифицированные ферменты, такие, как N-227H, обозначающий фермент, который в 227 положении содержит гистидин (вместо аспарагина); L144S, обозначающий фермент, который в 144 положении содержит серин (вместо лейцина); D150N, обозначающий фермент, который в 150 положении содержит аспарагин (вместо аспарагиновой кислоты); D150H, обозначающий фермент, который в 150 положении содержит гистидин (вместо аспарагиновой кислоты); L144S - D150N - N227H, обозначающий фермент, который в 144 положении содержит серин вместо лейцина, в 150 положении содержит аспарагин (вместо аспарагиновой кислоты), а в положении 227 содержит гистидин (вместо аспарагина); и L144S - D150H - N227H, обозначающий фермент, который в 144 положении содержит серин (вместо лейцина), в 150 паложении содержит гистидин (вместо аспарагиновой кислоты, а в 227 положении содержит гистидин (вместо аспарагина).

0,1 мл раствора каждого фермента (1 мг/мл) добавляли к 1 мл субстратного раствора (0,1 М бензилоксикарбонил --l- аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, способ гидролиза бензилоксикарбонил--l-аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, патент № 2151186" SRC="/images/patents/320/2151014/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-L- -аспарагиновая кислота, 0,1 M L-фенилаланинметилового сложного эфира гидрохлорид и 0,2 М трис-малеатного буфера при pH 7,0) и после смешивания проводили ферментную реакцию (в водяной бане) при 37^oC. Через 10, 20 и 30 мин, из каждой реакционной смеси брали образец в 10 мкл и анализировали его на обращенно-фазовой ВЖХР-колонке. После этого подсчитывали количество Z-APM, продуцированного ферментной реакцией, используя при этом в качестве эталона стандартный образец Z-APM, и определяли специфическую активность, выражая ее в относительных величинах по отношению к ферменту дикого типа. Полученные результаты представлены в табл. 2

Пример 7

(Влияние pH на синтез мутантных ферментов Z-APM)

Влияние pH синтез Z-APM определяли для обоих мутантных ферментов (L144S - D150H - N227H (TZ - 1), L144S - D150N - N227H (TZ - 2)) и для термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы дикого типа. Измерения проводили так же, как и в Примере 6, за исключением того, что pH Трис-малеатного буфера составлял 5,0 - 8,0. Полученные результаты показаны в табл. 3.

Активность выражали в относительных величинах по отношению к ферменту дикого типа при pH 7,0. Как видно из полученных результатов, pH реакционной смеси оказывает сильное влияние на активность синтеза Z-APM.

Предпочтительно проводить синтез Z-APM при более низких pH, поскольку при низком pH происходит меньший гидролиз метилового сложного эфира субстратов. Таким образом, настоящее изобретение позволяет решить вышеуказанные проблемы и получать более высокие активности фермента при более низких pH, чем активности фермента дикого типа при его оптимальном значении pH. Активности L144S - D150H - N227H (TZ - 1) и L144S - D150N - N227H (TZ - 2) при pH 6,0 являются гораздо более высокими, чем активность фермента дикого типа при pH 7,0.

Краткое описание рисунков

На фиг. 1 показана схема конструирования рекомбинантной плазмиды, обозначенной pUCTZ37, из известной плазмиды рМК4.

На фиг. 2 показана схема конструирования рекомбинантной плазмиды, обозначенной pUCTZ47, из плазмиды рМК4 и плазмиды pUCTZ37.

На фиг. 3 показана схема конструирования рекомбинантной плазмиды, обозначенной pUBTZ1, из известной плазмиды pUCTZ47 и плазмиды pUB110.

На фиг. 4 показана схема конструирования плазмиды, обозначенной pUBTZ2 из плазмиды pUBTZ1.

На фиг. 5 показана схема конструирования рекомбинантной плазмиды, обозначенной pUCTZ55, из известной плазмиды pMK1.

На фиг. 6 показана схема конструирования рекомбинантного фага M13, обозначенного М13TZSp-Bc, из плазмиды pUCTZ55.

На фиг. 7 показана схема конструирования плазмиды pUBTZ2 (мутанта) из плазмиды pUBTZ2 и М13TZSp-Bc (мутанта).

На фиг. 8 показана схема конструирования рекомбинантного фага M13, обозначенного М13TZBa-Sp, из плазмиды pUCTZ55.

На фиг. 9 показана схема конструирования рекомбинантной плазмиды pUBTZ2 (мутанта) (L144S - D150N - N227H или 1144S - D150H - N227H) из плазмиды pUBTZ2 (L144S) и мутагенных PCR - продуктов, полученных из плазмиды pUBTZ2 (N227H) и реакционной смеси PCR, содержащей праймеры для мутагенеза (D150N).

Хотя настоящее изобретение подробно описано на конкретных примерах, в него могут быть внесены различные изменения, не выходящие, однако, за рамки существа и объема изобретения.