способ определения или обнаружения повреждения органа- донора после ксенотрансплантации на основе анализа веществ, полученных из органа-донора

Формула изобретения

1. Способ определения или обнаружения присутствия вещества, полученного из органа-донора, в принципиально не донорской биологической жидкости, в присутствии или отсутствии соответствующего вещества реципиента, указывающий на повреждение органа-донора после ксенотрансплантации, позволяющий идентифицировать повреждение органа ксенотрансплантата у реципиента, включающий в себя захват или обнаружение этого вещества донора антителом, которое специфично для полученного из органа-донора вещества или способно вступать в перекрестную реакцию с этим полученным из органа-донора веществом, и прямое или опосредованное определение полученного из органа донора вещества.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реципиент - это человеческое существо.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что реципиент - это примат, не являющийся человеком.

4. Способ по любому из пп.1 - 3, отличающийся тем, что орган-донор получают из свиньи.

5. Способ по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что указанный орган - почка.

6. Способ по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что указанный орган - печень.

7. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что полученное из органа-донора вещество - это белок.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что полученное из органа-донора вещество - это фермент.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что фермент - это S-трансфераза глютатиона (GST).

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что фермент - это альфа-GST.

11. Способ по любому из пп.4 - 10, отличающийся тем, что антитело - это поликлональная анти-GST свиньи.

12. Способ по любому из пп.2 - 11, отличающийся тем, что антитело - это анти-GST человека, которая проявляет в принципе 100%-ную перекрестную реактивность с GST свиньи.

13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что любую присутствующую GST человека обнаруживают с использованием специфической анти-GST человека в отдельной системе анализа.

14. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что материал донора испытывают на жизнеспособность до ксенотрансплантации.

Описание изобретения к патенту

Область назначения изобретения

Это изобретение относится к способу определения или обнаружения присутствия вещества, полученного из органа-донора, в биологической жидкости, указывающего на поражение органа-донора после ксенотрансплантации.

Уровень техники

В настоящее время во всем мире существует нехватка органов-доноров для аллотрансплантации (например, печень, почка и сердце), и было предложено и показано, что эту проблему можно преодолеть, хотя и временно, путем использования органов животных до ортотопической трансплантационной хирургии. Чари Р. С. и др. ("The New England Journal of Medicine" (1994), том 33, N 4, стр. 234-237) лечили печеночную недостаточность путем перфузии печени свиньи ex vivo с последующей ортотопической трансплантацией печени. Один пациент получил стабилизацию на 10 дней и затем подвергся успешной ортотопической трансплантации печени. Однако предыдущие попытки межвидовой трансплантации органов (ксенотрансплантации) не были успешными из-за феномена, известного как сверхострое отторжение, поскольку вновь пересаженный орган подавляется и отторгается иммунной системой реципиента в течение нескольких часов после трансплантации в реципиента. Последние успехи в области молекулярной генетики сделали возможным появление трансгенных животных (в основном свиней), чьи органы подвергаются генной инженерии, чтобы быть менее иммуногенными при пересадке в другие виды (т.е. примат человек/примат не человек) (Transplant News (1995); том 5, N 9). В этом сообщении постулируется, что иммунологическая толерантность достигается экспрессией гена человека "фактор ускорения распада" в трансгенном органе, который предотвращает активацию в реципиенте комплементных компонентов (например, комплекса Cb3) и поэтому сводит к минимуму сверхострое (гиперострое) отторжение. Однако, как и в случае межвидовой трансплантации органов (аллотрансплантация), отторжение ксенотрансплантата все еще остается проблемой, которую должен решать врач-трансплантатор, и она еще более осложняется тем очевидным фактом, что в реципиенте, подвергнутом трансплантации, присутствуют ткани различных видов.

Традиционные тесты функции печени не способны выявить различие между веществами, полученными из органов донора и реципиента (например, свиньи и человека). Например, измерения сывороточных аланин аминотрансферазы (ALT)/ аспарат аминотрансферазы (AST) не позволяют выявить различия между ферментами свиньи и человека, тем самым делая тщетной любую попытку идентифицировать ферментный источник пост-трансплантата. Аналогичная ситуация будет иметь место в случае анализа ксенотрансплантата почки. Фактически, сейчас нет общепринятого белкового маркера целостности почки.

S-трансферазы глютатиона (GST) представляют собой мультигенное семейство белков, состоящее в основном из изоформ альфа ( GST), мю ( GST), пи ( GST) и тета-класса ( GST), как они определены изоэлектрической точкой, которые отвечают за детоксикацию целого набора ксенобиотиков, в основном посредством образования конъюгатов с глютатионом (Беккет Дж.Дж. и Хейс Дж.Д., "Advances in Clinical Chemistry" (1993); 30, 281-380). У людей равномерное печеночное распределение GST в печени вместе с относительно высоким содержанием в печени и коротким периодом полувыведения плазмы (примерно 1 час) означает, что этот фермент более чувствителен, чем аминотрансферазы в качестве индикатора статуса печени после трансплантации и вызванного лекарствами повреждения печени.

В EP-A 0 640 145 раскрывается способ, который помогает при ранней диагностике отторжения у реципиента трансплантата печени и который включает в себя измерение увеличения содержания GST в плазме или сыворотке у реципиента в отсутствие любого изменения трансаминазы плазмы или сыворотки или до такого изменения.

S-трансфераза пи-глютатиона локализуется в цитоплазме эпителиальных клеток желчного протока в печени и, как считается, существует только в гомодимерной форме. Такое гетерогенное распределение GST в печени говорит о том, что разные изоферменты имеют уникальные функции in vivo в разных участках печени, и потому можно сделать вывод, что измерение содержания GST в плазме или желчи облегчит отслеживание статуса печени человека. Аналогичное уникальное распределение также существует в почечных тканях, где GST находится в проксимальной области трубочки, a GST сосредоточена в периферической области трубочки нефрона (Кэмпбелл Дж. А. Х. и др., "Рак" (Филадельфия) (1991); 67, 1608-1613). В опубликованном недавно сообщении предлагалось использовать одновременное обнаружение / GST в моче человека для выявления различия между нефротоксичностью циклоспорина A и отторжением трансплантата, соответственно, благодаря специфичному к расположению характеру соответствующего поражения ткани (Сандберг А.Дж.М. и др., "Нефрон", (1994); 67, 306-316.

Соответственно, существует необходимость в способе различения между веществами реципиента и полученными от трансплантата как средство обнаружения повреждения органа трансплантата или, на самом деле, для проведения различия между повреждением органа реципиента или/и трансплантата.

Раскрытие изобретения

Изобретение предусматривает способ определения или обнаружения присутствия полученного из органа-донора вещества, в принципиально лишенной донора биологической жидкости, в присутствии или отсутствие соответствующего вещества реципиента, указывающего на повреждение органа донора после ксенотрансплантации, что позволяет идентифицировать повреждение органа ксенотрансплантата в этом реципиенте, причем этот способ включает в себя захват или обнаружение этого донора антителом, которое:

а) специфично для полученного из органа-донора вещества; или

б) способно к вступлению в перекрестную реакцию с этим полученным из органа-донора веществом;

и непосредственное или косвенное определение полученного из органа-донора вещества.

Соответственно, способ согласно изобретению позволяет найти различие между полученными от реципиента и полученными от донора веществами и тем самым получить указание на статус ксенотрансплантата и, возможно, отторжение, так что можно предпринять соответствующую корректирующую терапию, как только полученное из органа-донора вещество идентифицировано в биологической жидкости реципиента, как будет подробнее продемонстрировано ниже.

Под биологической жидкостью здесь имеются в виду, например, такие имеющиеся в организме жидкости как желчь, плазма, сыворотка и моча, а также средства поддержки тканей и перфузаты. Здесь также биологические жидкости в общем случае называются матрицами.

При указании "полученным из органа-донора" здесь имеются в виду органы как таковые, а также ткани и клетки, являющиеся их составными частями или полученные из них.

Аналогичным образом, под материалом донора здесь имеются в виду органы как таковые, а также ткани и клетки, являющиеся их составными частями или полученные из них.

Таким образом, как пример, материалом донора может быть печень, часть печени, такая как доля печени или гепатоциты. Обычно, в случае гепатоцитов будет использоваться кассета гепатоцитов.

В общем случае, реципиентом будет человеческое существо или примат, не являющийся человеком.

Соответственно, материал донора предпочтительно будут получать из примата, не человека, или из животного, такого как свинья, которая физиологически и биохимически аналогична человеческому существу.

Животное-донор может быть трансгенным животным.

Ксенотрансплантация может быть in vivo или ex vivo.

Удобно, чтобы подвергающийся ксенотрансплантации орган был сердцем, почкой или печенью.

Предпочтительно, чтобы полученное из органа-донора вещество было белком, в частности ферментом.

Предпочтительно полученное из органа-донора вещество будет специфическим для донора. В том случае, если имеется соответствующее вещество реципиента, предпочтительно, чтобы вещество реципиента имело низкую степень гомологии с этим полученным из органа-донора веществом. Однако, полученное из органа-донора вещество может иметь высокую степень гомологии (например, более 80% гомологии) с соответствующим веществом реципиента и, тем не менее, быть обнаруживаемым в соответствии с изобретением, как описано ниже.

Предпочтительный фермент - это S-трансфераза глютатиона, конкретнее GST.

Далее, предпочтительно определение выделенного из органа-донора вещества производить посредством иммунологического анализа. Пригодные методы иммунологического анализа включают в себя иммунологические анализы ферментов.

Таким образом, в случае наличия GST свиньи в биологической жидкости человека, GST свиньи может быть захвачена IgG [анти-свиная GST], непосредственно или косвенно связанной с твердой фазой или, в качестве альтернативы, IgG [анти- GST человека], проявляющей перекрестную реактивность.

Был выращен поликлональный иммуноглобулин IgG кролика [анти-свиная GST] , который в высшей степени специфичен для свиной GST. В том случае, если антитело также проявляет малую степень (примерно 5-10%) перекрестной реактивности c GST человека, например, при высокой концентрации GST человека, то GST человека можно определить отдельно и правильно подсчитать количество свиной GST, как описано ниже.

Была идентифицирована моноклональная анти- GST человека с почти 100% перекрестной реактивностью со свиной GST, как описано ниже в примере 3.

Иммунологический анализ ферментов может быть выполнен с формированием "сандвича" или как полу-конкурентный иммунологический анализ, как описано ниже в примерах 1 и 2, соответственно.

В еще одном аспекте изобретения материал донора испытывают на жизнеспособность до ксенотрансплантации.

Таким образом, изобретение позволяет также определять жизнеспособность материала донора путем измерения содержания полученного из органа-донора вещества в биологической жидкости, которая контактирует с материалом донора с применением описанного выше способа.

В этом аспекте изобретения можно обнаружить вещество в соответствии с любым известным способом в дополнение к способам согласно изобретению. Например, если полученное из органа вещество - это фермент, то можно использовать ферментный анализ на основе применения субстрата для фермента для определения указанного полученного из органа вещества.

Изобретение также предусматривает наличие тест-набора или пакета для использования при осуществлении способа согласно изобретению, как описано выше.

Краткое описание чертежей

На сопроводительных чертежах:

Фиг. 1 это схематическая диаграмма иммунологического анализа фермента с формированием "сандвича" из примера 1;

Фиг. 2 это график зависимости поглощения при 450/630 нм относительно концентрации GST (мкг/л) согласно данным количественного иммунологического анализа фермента с формированием "сандвича" для GST свиньи из примера 1;

Фиг. 3 это схематическая диаграмма полу-конкурентного иммунологического анализа фермента по примеру 2;

Фиг. 4 это график зависимости поглощения при 450/630 нм относительно концентрации GST (мкг/л) согласно данным количественного конкурентного иммунологического анализа фермента для GST свиньи по примеру 2;

Фиг. 5 это данные анализа методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE анализ) GST человека и свиньи;

Фиг. 6 - данные иммуно-блот анализа GST человека и свиньи с использованием конъюгатов IgG [анти- GST человека] IgG козла [анти- IgG кролика] -HRP (пероксидаза хрена);

Фиг. 7 - данные иммуно-блот анализа GST человека и свиньи с использованием конъюгатов IgG [анти- GST] и IgG [анти-IgG кролика] HRP (пероксидаза хрена);

Фиг. 8 это иммуноблот-анализ GST человека и свиньи с использованием IgG [анти- GST человека] и IgG козла [анти-IgG мыши] HRP (пероксидаза хрена).

Режимы осуществления изобретения

Изобретение будет далее проиллюстрировано посредством следующих примеров.

Подготовительный пример A

Очистка GST свиньи

Альфа GST была выделена из печени свиньи аффинной хроматографией и хроматофокусированием (pH 9,5 - 6,0). Точные подробности процедуры очистки следующие:

а. 30 г печени свиньи гомогенизировали в течение 2 минут в буфере для гомогенизации в отношении одна часть печени на три части буфера с использованием гомогенизатора Уоринга (Waring это товарный знак). Буфер для гомогенизации имел следующий состав:

10 мМ трис-HCl

250 мМ сахарозы

5 мМ EDTA рН 7,8

2 мкг/мл лейпептина

2 мкг/мл пепстатина.

б. Гомогенат печени центрифугировали при 10000 g в течение 60 минут.

в. Затем надосадочную жидкость загружали в колонку для аффинной хроматографии с глютатион (GSH)-сефарозой, предварительно приведенной в равновесие в 10 мМ трис-буфера (pH 9,1). Уравновешивающий буфер применялся снова для элюирования несвязанного белка. Наконец использовали 50 мМ трис-буфера (pH 9,1), содержащие 5 мМ GSH, для элюирования из аффинной колонки связанной GST.

г. Затем элюированный материал подвергался диализу относительно 25 мМ этаноламина pH 9,5 и направлялся в хроматофокусирующую колонку (РВЕ94, поставляемую фирмой Pharmacia). Для элюирования использовали буфер марки Polybuffer 96, приготовленный согласно инструкциям производителя.

Подготовительный пример Б

Получение и очистка антител

Очищенная GST свиньи инъецировалась в белых новозеландских кроликов подкожно (п.к.) согласно временному графику, приведенному ниже, и сыворотка оценивалась на анти- GST реактивность. Когда титр IgG (анти- GST свиньи) был достаточен (определялось с помощью дот-блот анализа), животных обескровливали, и собирали сыворотку. Общее количество IgG очищалось от сыворотки кроликов аффинной хроматографией белка A и использовалось как для нанесения на микротитрационный планшет (полу-конкурентный EIA - пример 2), так и для биотинилирования (сандвич EIA - пример 1). Моноклональный IgG (анти- GST человека, такой), как асцит, получали в Университетской больнице города Ниймеген, Нидерланды, и не очищали далее до использования.

График иммунизации (общий):

День 1: Брали кровь из уха кролика (5 мл предсыворотки) и затем 0,5 мл антигена GST свиньи (100 мкг) смешивали с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Антиген и адъювант гомогенизировали до получения хорошей эмульсии. Затем эта смесь вводилась п.к. в ряд мест на спине кролика, которую перед этим обривали.

День 28: Брали кровь из уха кролика (5 мл сыворотки) и затем 0,5 мл антигена (100 мкг) смешивали с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Антиген и адъювант гомогенизировали до получения хорошей эмульсии. Затем смесь инъецировалась п.к. в ряд мест на спине кролика.

День 42: Для исследования брали 100 мл крови из уха кролика.

День 56: Вторая бустер-инъекция давалась кролику, как описано для дня 28.

День 70: Для исследования брали 10 мл крови из уха кролика. Когда титр был достаточно высок, кролика убивали, и собирали как можно больше крови.

Подготовительный пример В

Иммуноблоттинг

Все поликлональные и моноклональные IgG для использования в следующих примерах проверялись на реактивность и перекрестную реактивность относительно GST человека и свиньи, соответственно, посредством следующих комбинаций иммуноблота:

(а) IgG кролика [анти- GST человека] использовали для зондирования нитроцеллюлозных мембран, содержащих иммобилизованные GST человека и свиньи.

(б) IgG кролика [анти- GST свиньи] использовали для зондирования нитроцеллюлозных мембран, содержащих иммобилизованные GST человека и свиньи.

(в) ldG мыши [анти- GST человека] использовали для зондирования нитроцеллюлозных мембран, содержащих иммобилизованные GST человека и свиньи.

Способ, использованный для обнаружения иммуноблота, был следующим:

1. GST человека и свиньи (0,5 мкг/след) подвергались электрофорезу на 15% SDS-PAGE, с использованием маркеров молекулярного веса.

2. После электрофореза полиакриламидный гель разрезали и одну половину окрашивали на белок, тогда как оставшуюся часть использовали для электрофорезного переноса на нитроцеллюлозу.

3. После электрофорезного переноса нитроцеллюлозные мембраны блокировали в течение 1 часа с помощью 5% (вес/объем) раствора Marvel (Marvel это товарный знак) в солевом фосфатном буфере, содержащем 0,05% (вес/объем) блокирующего буфера TWEEN-20 (PBST).

4. Затем приготавливали следующие растворы:

(I) IgG кролика [анти- GST человека] в 1% (веса и объема) Marvel в PBST

(ii) IgG кролика [анти- GST свиньи] в 1% (вес/объем) Marvel в PBST

(iii) IgG мыши [aнти- GST человека] в 1% (вес/объема) Marvel в PBST

и добавляли их к мембранам после декантирования блокирующего буфера. Инкубация с растворами антител продолжалась в течение одного часа.

5. Затем нитроцеллюлозные мембраны промывали в PBST (2х в течение 5 мин каждая).

6. Затем приготовлялся конъюгат IgG кролика и HRP 1/1000 в 1% (вес/объем) Marvel в PBST и добавлялся в 4(I) и (ii), указанные выше. Также приготовлялся конъюгат IgG мыши-HRP (1/1000) и добавлялся к раствору 4(iii), указанному выше. Противовидовые (кролик-мышь) конъюгаты, использованные для иммунологического анализа, приобретались в фирме Bio-Rad Laboratories Limited.

7. После одного часа инкубации с противовидовыми конъюгатами реагенты удаляли, и мембраны промывались, как описано в 5 выше.

8. Затем готовился субстрат диаминобензидин и добавлялся к мембране. На положительную реакцию указывал коричневый осадок на нитроцеллюлозной мембране.

Подготовительный пример Г

Синтез конъюгата GST свиньи и пероксидазы хрена (HRP)

Конъюгаты GST-HRP синтезировались с использованием методики конъюгации тиоэфира. Реакционноспособные малеимидные группы вводились в молекулы GST с использованием SMCC (сукцинимидил 4-(N-малеимидометил) циклогексан 1-карбоксилат), и маскированные сульфгидрильные группы связывались с HRP (Данкен Р.Дж.С. и др., (1983)б "Anal. Biochem", 132, 68-73). После этапа демаскировки для получения реакционноспособных сульфгидрильных активированные малеимидом GST и HRP-SH перемешивались вместе и реагировали в течение 4,5 часов. Получившийся конъюгат GST-HRP, образованный ковалентной тиоэфирной связью, доводился до 50% (объем/объем) глицеролом и хранился при -20^oC для использования в полу-конкурентном анализе EIA в примере 2.

Подготовительный пример Д

Биотинилирование IgG [анти- GST свиньи]

Биотинилированная IgG [анти- GST свиньи] готовили соединением очищенного поликлонального IgG [анти- GST свиньи], ранее полученного иммунизацией кроликов с помощью очищенной GST (как описано в подготовительном примере Б), с N-гидроксисукцинимид-биотином (NHS-биотин) в щелочной среде. Затем не прореагировавший NHS-биотин удалялся экстенсивным диализом, а биотинилированный IgG отбирался и хранился замороженным при -20^oC до использования.

Пример 1

Иммунологический анализ ферментов методом "сандвича"

Используемая процедура схематически описана на фиг. 1.

а. На микротитрационный планшет Nunc Maxisorp (Nunc Maxisorp - это товарный знак) наносили моноклональный IgG мыши [анти- GST человека] (упомянутый в подготовительном примере Б), иммобилизованный посредством фрагментов F(ab)₂ козла [анти-IgG0 мыши] . Этот способ нанесения антител способствует ориентации Mab - связывающих участков (сайтов) и также улучшает чувствительность анализа, сводя к минимуму вызванную прилипанием денатурацию иммобилизованного антитела. Микротитрационный планшет блокировали раствором белок/сахароза.

б. GST свиньи, выделенная из печени, как описано в подготовительном примере А, полученная сразу же после экспирации и хранящаяся при 2-8^oC или -20^oC, использовалась для калибровки.

в. Биотинилированные конъюгаты IgG [анти- GST свиньи] использовали для облегчения обнаружения захваченных/иммобилизованных GST.

г. Конъюгат стрептавидина - пероксидазы хрена (HRP) затем использовался для обнаружения всего антигенного комплекса-сандвича в связи с использованием субстрата тетраметилбензидин (ТМВ).

д. Реакция фермента прекращалась добавлением 1 H H₂SO₄, и измеряли поглощение при 450 нм с использованием 630 нм в качестве базовой длины волны. Интенсивность цвета пропорциональна концентрации GST, и после получения графика зависимости А_{450.630 нм} от концентрации (мкг/л) можно определить концентрацию неизвестных образцов (см. фиг. 2). Общее время анализа составило менее 3,5 часов.

Пример 2

Полу-конкурентный иммунологический анализ ферментов

Использованная процедура схематически описана на фиг. 3.

а. В этом случае пластины Nunc Maxisorp покрывались поликлональным иммуноглобулином IgG [анти- GST свиньи], иммобилизованным посредством белка А, т.к. было обнаружено, что непосредственное покрытие поликлональным IgG не облегчает захват GST, возможно, из-за денатурации IgG после образования связи с микротитрационным планшетом.

б. GST, меченая HRP, использовалась в качестве конъюгата в этом случае и добавлялась в микро-лунку, чтобы впоследствии стать немеченым калибратором/образцом. Таким образом инициировалась реакция конкурентного типа между меченой HRP и немеченой GST.

в. После подходящего инкубационного периода, обычно 60 минут, микротитрационный планшет промывали, и добавили субстрат ТМВ.

г. Реакция фермента прекращалась добавлением 1 H H₂SO₄, и измеряли поглощение при 450 нм с использованием 630 нм как базовой длины волны. Интенсивность цвета обратно пропорциональна концентрации GST свиньи, и после построения графика зависимости А_{450/630 нм} от концентрации (мкг/л), достигается количественное обнаружение неизвестных образцов (см. фиг. 4).

Пример 3

Оценка чистоты реагентов в иммунологическом анализе

Иммуноблоттинг проводился в соответствии с процедурой, описанной в подготовительном примере В. Результаты приведены на фиг. 5-8.

Ключ к следам на фиг. 5-8:

След 1: Маркеры молекулярного веса.

След 2: GST человека (0,5 мкг).

След 3: GST свиньи (0,5 мкг).

На фиг. 5 показана чистота (указанная одной полоской в каждом случае) GST человека и свиньи до иммунизации в кроликов, что подтверждает отсутствие любых других полученных от человека или свиньи белков, которые, в противном случае, могли бы снизить специфичность анализа. Иммуноблот-анализ реакционной способности антител показывает, что IgG [анти- GST человека] в высшей степени специфичен для GST человека и не проявляет какой-либо значительной перекрестной реактивности с GST свиньи (фиг. 6), на что указывает большая интенсивность сигнала GST человека при относительно малой интенсивности сигнала GST свиньи. Эта находка подтверждается отсутствием реакционной способности GST свиньи ( GST)p в специфическом для GST ( GST)h человека иммунологическом анализе ферментов, набор для которого поставляется на рынок фирмой Biotrin International Limited, Маунт Меррион, Каунти Дублин, Ирландия, под названием HEPKIT. Результаты представлены в табл. 1, показывающей оценку реакционной способности GSTp в HEPKIT фирмы Biotrin. Очевидно, что никакой перекрестной реактивности не имеет место, когда GST анализируется с помощью набора HEPKIT.

Значимость этого факта является чрезвычайно важной, поскольку это подразумевает, что иммунологический анализ ферментов для количественного определения GST человека специфичен для обнаружения GST человека. Таким образом, любая GST человека, присутствующая в образцах, в которых также можно измерить GST свиньи, может быть специфически обнаружена без перекрестного загрязнения от антигена свиньи. Это отсутствие перекрестной реактивности в иммунологическом анализе ферментов GST человека и обнаружение того, что примерно 5-10% перекрестной реактивности очевидны между IgG [анти- GST свиньи] и GST человека (фиг. 7), как указывает малая интенсивность сигнала GST человека при относительно большой интенсивности сигнала GST свиньи, означают, что можно использовать одновременное количественное определение GST человека в иммунологическом анализе ферментов HEPKIT и GST свиньи в иммунологическом анализе ферментов для GST свиньи для корректировки любого вклада GST человека в иммунологическом анализе GST свиньи.

Например, если образец дает следующие показания:

Анализ - GST (мкг/л)

EIA свиньи ( GST свиньи) - 10000

ElA Hepkit ( GST человека) - 1000

то, принимая во внимание примерно 7% перекрестную реактивность GST человека в EIA свиньи, можно сделать вывод, что GST человека вносит вклад в показания GST свиньи. Поэтому присутствуют 10000 - 70 = 9930 мкг/л GST свиньи.

Более того, как упоминалось выше, экстенсивная перекрестная реактивность между IgG мыши [анти- GST человека] и GST свиньи явно показана на фиг. 8, о чем свидетельствует сравнительная интенсивность соответствующих полос/сигналов. Этим явлением можно воспользоваться при использовании этого антитела в иммунологическом анализе методом сандвича в примере 1 для GST свиньи в качестве иммобилизованного или покрывающего планшету антитела.

Пример 4

Специфичность анализа

Поскольку анализы в примерах 1 и 2 будут прежде всего использоваться для обнаружения GST свиньи в не принадлежащих свиньям биологических жидкостях, важно, чтобы чувствительность и специфичность анализа оценивалась с использованием GST свиньи, присутствующих в следующих матрицах:

- моча человека;

- сыворотка человека;

- плазма человека;

- желчь человека;

- среды поддержки тканей.

Для достижения этого анализа GST "вкалывалась" во все вышеуказанные матрицы и затем анализировалась в иммунологических анализах примеров 1 и 2. В дополнение к количественному обнаружению GST, линейность (параллельность) анализа также оценивалась, как и чувствительность анализа. Более того, необходимо также, чтобы специфичность анализа облегчала обнаружение только GST свиньи и чтобы любая GST человека не вызывала значительных помех при проведении иммунологического анализа. С этой целью, потенциальная перекрестная реактивность GST человека была исследована путем примешивания образцов, содержащих GST свиньи, к разным количествам GST человека для оценки потенциальной перекрестной реактивности. При условии, что такая значительная гомология последовательностей между обоими изоферментами это далеко не тривиальная задача, и ее можно решить только экстенсивным анализом антисывороток [анти- GST свиньи] на предмет потенциальной перекрестной реактивности c GST человека.

Результаты количественного определения GST свиньи в различных матрицах при определении иммунологическими анализами ферментов по методу сандвича и полу-конкурентным анализом приведены в табл. 2.

Из табл. 2 ясно, что количественная регенерация GST свиньи достижима во всех испытанных матрицах. Очевидно, важно, чтобы GST была обнаруживаема как в плазме, так и в моче человека, соответственно, чтобы облегчить статус ксенотрансплантата печени и почки, и это действительно так. Однако, заметно, что матрица-плазма, очевидно, несовместима с методикой полу-конкурентного иммунологического анализа, возможно из-за взаимодействия IgG с иммобилизованным белком A, что приводит к аномальным показаниям. За исключением этого, все другие жидкости, кажется, совместимы с этими методиками анализа. Особенно интересна возможность обнаруживать GST свиньи в средах поддержки тканей, что должно облегчить возможность предтрансплантационной оценки ксенотрансплантата или анализа живучести изолированных гепатоцитов свиньи (присутствующих в кассетах), т.к. эти системы в основном поддерживаются в обычных средах поддержки. Кроме того, эта совместимость матрицы-образца должна сильно облегчить обнаружение GST в средах, используемых для сохранения органов-доноров ex vivo, причем орган-донор (например, печень) поддерживается экстракорпорально в контакте с культуральной средой.

Пример 5

Оценка влияния присутствия GST человека при иммунологическом анализе ферментов GST свиньи по методу сандвича

Проводилась оценка влияния присутствия GST человека в иммунологическом анализе ферментов GST свиньи по методу сандвича. Никаких помех при анализе при измерении поглощения не было отмечено при концентрации микро-лунок менее 25 мкг/л (эквивалентной концентрации образцов 125 мкг/л при разбавлении 1/5 в разбавителе образцов). Результаты представлены в табл. 3.

Результаты, приведенные в табл. 3, показывают специфичность иммунологических анализов для обнаружения GST свиньи. Из данных очевидно, что присутствие GST человека не влияет на данные иммунологического ферментного анализа даже при концентрациях образцов, доходящих до 125 мкг/л (25 мгк/л х 5), что представляет собой величину, в 15 и 6 раз большую нормального верхнего предела для GST сыворотки и мочи человека, соответственно. При более высоких уровнях GST человека (> 250 мкг/л; 50 мкг/л х 5) очевидно, что некоторое наложение имеет место, и было подсчитано, что имеется примерно 5-10% перекрестной реактивности между GST человека и IgG [анти- GST свиньи] . Однако совместное измерение уровней GST в количественных иммунологических анализах для GST и человека, и свиньи должно позволить рассчитать точное количество присутствующей GST человека, и таким образом, его можно учесть во время количественного определения GST свиньи в биологических жидкостях человека.

Далее следует заметить, что иммунологические анализы согласно изобретению можно также применять для обнаружения GST свиньи в полученных от свиньи биологических жидкостях, и это было бы справедливо для токсикологических исследований in vitro или in vivo, включающих в себя свиней или органы свиней. Эта находка имеет большое значение, поскольку известно, что физиология/биохимия свиньи и человека вполне схожи и, следовательно, свиней часто используют в качестве животных моделей для предсказания лекарственной токсичности у людей.