способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа

Формула изобретения

1. Способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, который содержит последовательность Asp-Gly- или -Asn-Gly-, которая с течением времени может быть преобразована в сукцинимидный фрагмент, представленный общей формулой (1)



или в -перегруппированный фрагмент, представленный общей формулой (2)



при этом способ включает в себя получение раствора указанного гирудина, добавление органической кислоты, добавление гидроксида щелочного металла для доведения рН раствора до 5,0-6,5 и лиофилизацию раствора, который по существу состоит из компонентов, происходящих из гидроксида щелочного металла, добавленного для доведения рН, углеводов, таких, как белый сахар и маннит, которые включены дополнительно, органической кислоты и гирудина и/или вариантов гирудина.

2. Способ по п. 1, при котором гидроксид щелочного металла представляет собой гидроксид натрия.

3. Способ по п. 1 или 2, при котором гирудин представляет собой десульфированный гирудин или вариант гирудина.

4. Способ по любому из пп. 1-3, при котором органическая кислота представляет собой виннокаменную кислоту, лимонную кислоту или уксусную кислоту.

5. Способ по любому из пп. 1-4, при котором органическая кислота выбрана из ряда фармацевтически приемлемых карбоновых кислот, которые представляют собой двухосновные или трехосновные карбоновые кислоты, имеющие структуру с гидроксильной группой, замещенной по -углеродному атому карбоновой кислоты.

6. Способ по любому из пп. 1-5, включающий в себя добавление белого сахара вдобавок к органической кислоте.

7. Способ по п. 6, дополнительно включающий в себя добавление маннита вдобавок к органической кислоте и белому сахару.

8. Лиофилизированная фармацевтическая композиция, содержащая гирудин, который содержит последовательность -Asp-Gly- или -Asn-Gly-, которая с течением времени может быть преобразована в сукцинимидный фрагмент, представленный общей формулой (1)



или в -перегруппированный фрагмент, представленный общей формулой (2)



и органическую кислоту с добавлением гидроксида щелочного металла для доведения рН раствора до 5,0-6,5 и лиофилизацией раствора, который, по существу, состоит из компонентов, происходящих из гидроксида щелочного металла, добавленного для доведения рН, углеводов, таких, как белый сахар и маннит, которые включены дополнительно, органической кислоты и гирудина и/или вариантов гирудина, причем молярное соотношение гирудина и/или вариантов гирудина и органической кислоты составляет 1: 5-100.

9. Лиофилизированная содержащая гирудин фармацевтическая композиция по п. 8, в которой гидроксид щелочного металла представляет собой гидроксид натрия.

10. Лиофилизированная содержащая гирудин фармацевтическая композиция по п. 8, содержащая десульфированный гирудин или вариант гирудина и органическую кислоту в молярном соотношении 1: 5-100.

11. Лиофилизированная содержащая гирудин фармацевтическая композиция по п. 10, содержащая десульфированный гирудин или вариант гирудина, органическую кислоту и белый сахар в молярном соотношении 1: 5-100: 1-500.

12. Лиофилизированная содержащая гирудин фармацевтическая композиция по п. 10, содержащая десульфированный гирудин или вариант гирудина, органическую кислоту, белый сахар и маннит в молярном соотношении 1: 5-100: 1-500: 10-1000.

13. Лиофилизированная содержащая гирудин фармацевтическая композиция по любому из пп. 10-12, которая получена путем лиофилизации раствора десульфированного гирудина или варианта гирудина в концентрации 0,1-500 мг/мл.

14. Лиофилизированная содержащая гирудин фармацевтическая композиция по п. 13, в которой органическая кислота выбрана из различных фармацевтически приемлемых карбоновых кислот, которые представляют собой двухосновные или трехосновные карбоновые кислоты, имеющие структуру с гидроксильной группой, замещенной по -углеродному атому карбоновой кислоты.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способу стабилизации и регуляции изменения в пептиде, который включает в себя последовательность -Asp-Gly- или -Asn-Gly- в аминокислотной последовательности, в которой последовательность -Asp-Gly- или -Asn-Gly- изменяется на сукцинимидный фрагмент с помощью реакции дегидратации или реакции дезамидирования и последующих изменений на -перегруппированный фрагмент с помощью реакции изомеризации, в частности, способом регуляции такого изменения в пептиде, таком как десульфированный гирудин или гирудиновый вариант. Настоящее изобретение относится также к лиофилизированной фармацевтической композиции, содержащей пептид, в котором указанное изменение регулируется с помощью данного способа стабилизации.

Гирудин представляет собой антикоагулянтный фактор крови, который выделяется слюнными железами медицинской пиявки. Так как гирудин проявляет антитромбиновую активность, это соединение и его варианты применяются в качестве противосвертывающих лекарственных препаратов крови.

Гирудин и большинство гирудиновых вариантов содержат последовательность -Asp-Gly- или -Asn-Gly-, и изменение в сукцинимидных соединениях связано с изменением в этой последовательности по прошествии времени. Кроме того, сукцинимидные соединения меняются на -перегруппированные соединения. Вследствие этого, даже если соединения технологически достаточно очищены, степень чистоты соединений снижается со временем из-за образования сукцинимидных соединений и -перегруппированных соединений. Поскольку сукцинимидные соединения и -перегруппированные соединения, сами по себе, проявляют антитромбиновую активность (выложенная Японская патентная заявка 310788/1993), такое уменьшение степени чистоты в целом не вызывает серьезных проблем. Однако такое ухудшение чистоты нежелательно, когда эти соединения применяются в качестве лекарственных препаратов. По этой причине был проведен ряд исследований по улучшению стабильности гирудина.

Эти примеры включают в себя способ добавления водорастворимых солей кальция и/или магния к гирудину с целью повышения стабильности гирудина (выложенная Японская патентная заявка 267877/1995), способ добавления калийфосфата и сахара (WO 95/20399) и тому подобное. Однако эти предлагаемые способы не приводят к достаточному повышению стабильности гирудина.

В настоящем изобретении эти проблемы успешно разрешены.

В частности, цель настоящего изобретения заключается в создании способа по стабилизации пептида, содержащего последовательность -Asp-Gly- или -Asn-Gly-, который включает в себя регулируемое изменение последовательности -Asp-Gly- или -Asn-Gly- на сукцинимидный фрагмент или -перегруппированный фрагмент.

Вторая цель настоящего изобретения заключается в создании лиофилизированной фармацевтической композиции, содержащей гирудин, с превосходной стабильностью благодаря применению этого способа стабилизации.

Вышеуказанная цель достигается в настоящем изобретении с помощью способа стабилизации, включающего в себя:

получение раствора пептида, который содержит последовательность -Asp-Gly- или -Asn-Gly-, которая может быть преобразована в сукцинимидный фрагмент, представленный с помощью нижеследующей общей формулы (1),



или в -перегруппированный фрагмент, представленный с помощью нижеследующей общей формулы (2),



добавление органической кислоты и доведение рН раствора до 5,0-6,5, и

лиофилизацию полученной смеси.

В качестве пептида в настоящем изобретении использовали десульфированный гирудин или гирудиновый вариант.

Кроме того, вышеуказанная цель достигается в настоящем изобретении с помощью фармацевтической композиции, полученной с применением вышеупомянутого способа стабилизации пептида, в частности, лиофилизированной фармацевтической композиции, содержащей гирудин, включающей в себя 5-100 молей органической кислоты, добавляемой к 1 молю десульфированного гирудина или гирудинового варианта. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, помимо органической кислоты, к данному пептидному раствору для лиофилизации добавляли 1-500 молей сахарозы и, по необходимости, 10-1000 молей маннита на один моль десульфированного гирудина или гирудинового варианта.

На чертеже приведены хроматограммы, полученные жидкостной хроматографией, после того как лиофилизированные образцы, которые хранились в термостате при 40^oС в течение 3-х месяцев, были проанализированы в экспериментальном примере 6, в котором номера соответствуют указанным здесь номерам.

Способ настоящего изобретения применим к пептиду, включающему в себя аминокислотную последовательность -Asp-Gly- или -Asn-Gly- для контроля за заменой с течением времени этих радикалов на сукцинимидный фрагмент общей формулы (1) или на -перегруппированный фрагмент общей формулы (2). Поэтому настоящее изобретение может быть применимо ко всем пептидам, содержащим последовательность -Asp-Gly- или -Asn-Gly-, таким как десульфированный гирудин HV-1 (выложенная Японская патентная заявка 136597/1985), HV-2 (Harvey с соавт. , Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 1084 (1986)), гирудиновый вариант HV1C3, представленный последовательностью 1 (выложенная Японская патентная заявка 173798/1992), гормон роста человека, или лизозим, с особенно предпочтительным пептидом, обладающим гирудиновым вариантом HV1C3 (таблица последовательностей, последовательность 1). Кроме того, включены пептиды, к которым применим способ настоящего изобретения, представляющие собой различные варианты гирудина, полученные из десульфированного гирудина HV-1 или варианта гирудина HV1C3 путем модификации аминокислотной последовательности, а также сохраняющие последовательность -Asp-Gly- или -Asn-Gly-. Конкретные примеры представляют собой rHV-1-9 (таблица последовательностей, последовательность 2 rHV-1-10 (таблица последовательностей, последовательность 3), rHV-1-14 (таблица последовательностей, последовательность 4), rHV-1-15 (таблица последовательностей, последовательность 5) и rHV-1-16 (таблица последовательностей, последовательность 6), описанные в Европейской патентной публикации ЕР 0625580 А1, или HV-17 (таблица последовательностей, последовательность 7), описанная в WO 92/15610.

В настоящем изобретении такой пептид вначале растворяют в воде до конечной концентрации от 0,1 до 500 мМ. Затем рН полученного раствора доводят до 5,0-6,5 добавлением органической кислоты, при необходимости, щелочным раствором, таким как водный раствор гидроксида натрия. В качестве органической кислоты можно использовать ряд фармацевтически приемлемых карбоновых кислот. Примеры таких карбоновых кислот включают в себя одноосновные кислоты, такие как молочная кислота, и двухосновные или трехосновные кислоты, такие как виннокаменная кислота, лимонная кислота и яблочная кислота. Из них особенно предпочтительными, с точки зрения наилучшего эффекта стабилизации пептидов, из двухосновных и трехосновных кислот являются виннокаменная кислота и лимонная кислота, а из одноосновных кислот - уксусная кислота. Обычно карбоновая кислота имеет структуру, в которой гидроксильная группа в -положении замещена углеродом, в частности, цепь карбоновой кислоты, содержащая структуру С-СН(ОН)-СООН, цепочка из двухосновной кислоты или трехосновной кислоты является особенно предпочтительной. Когда рН водного раствора пептида составляет более 6,5 или менее 5,0, продукт лиофилизации такого пептидного раствора обладает очень низкой стабильностью.

В случае вышеописанного десульфированного гирудина или варианта гирудина желательно добавлять от 5 до 100 мМ органической кислоты на 1 мМ гирудина или, при необходимости, дополнительно добавлять водно-щелочной раствор для доведения рН в диапазоне от 5,0 до 6,5. Фармацевтическую композицию, содержащую гирудин, можно получить лиофилизацией этого раствора. В этом случае продукт, полученный путем лиофилизации смеси лишь с добавленной органической кислотой, представляет собой мягкое вещество, несколько похожее на пух или пыль, с которым трудно иметь дело в процессе получения и при назначении больному. Поэтому, помимо органической кислоты, желательно добавлять от 1 до 500 мМ сахарозы в качестве наполнителя. Более желательно на 1 мМ гирудина добавлять кроме этого 10-1000 мМ маннита. Не существует ограничений для последовательности осуществления этих операций по установлению рН добавлением органической кислоты, добавлению сахарозы и добавлению маннита. Любой из этих компонентов может быть добавлен первым, или все компоненты могут быть добавлены одновременно.

Желательно, чтобы пептидный раствор, полученный таким образом, был изотоничным. Этот раствор лиофилизируют традиционным способом. Полученный лиофилизированный продукт может быть вновь растворен и немедленно использован в качестве лекарственного средства.

Теперь опишем специфические особенности настоящего изобретения с помощью экспериментальных примеров. В данных примерах содержание разных компонентов, добавляемых к фармацевтическим композициям, соответствует конечной концентрации компонентов в пептидном растворе для лиофилизации при получении этих фармацевтических композиций. Указанные значения рН соответствуют также рН пептидного раствора, который лиофилизируется.

Примеры

Экспериментальный пример 1

Вариант гирудина HV1C3, обладающий аминокислотной последовательностью, представленный последовательностью 1 в таблице последовательностей, глицин и маннит растворяли в очищенной воде до конечной концентрации, соответственно, 6 мг/мл (0,86 мМ), 6,7 мг/мл (0,89 мМ) и 33,5 мг/мл (184 мМ). Полученный раствор делили на шесть равных порций. В этих порциях рН доводили до значений, показанных в таблице 1, добавлением 30 мМ виннокаменной кислоты, фосфорной кислоты или раствора Трис-буфера. Полученные пептидные растворы, в которых таким образом доводили рН, фильтровали через 0,22-микрометровый мембранный фильтр. Полученные фильтраты вносили в 6-миллилитровые пробирки в количестве 1 мл на каждую пробирку. Для каждого значения рН раствора получали 50 таких пробирок, всего 300 пробирок. Все эти 300 пробирок лиофилизировали.

Лиофилизированные образцы хранили в термостате при 50^oС и извлекали из термостата, соответственно, через 1, 2, 4, 6, 8 недель. 1 мл очищенной воды добавляли в каждую извлеченную пробирку. Растворы, дополнительно разбавленные 50-кратно, подвергали жидкостной хроматографии для измерения процентного содержания пиковой области варианта гирудина HV1C3 в условиях, показанных в таблице 2. Определяли количество (процентное содержание) варианта гирудина HV1C3, остающееся в данном лиофилизированном образце после хранения в термостате, отнесенное к количеству варианта гирудина HV1C3, содержащегося в начале хранения. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Из вышеприведенных результатов можно видеть, что лиофилизация образцов после доведения рН до 5,0-6,5 обеспечивает лучшую стабильность.

Экспериментальный пример 2

Вариант гирудина HV1C3, очищенную сахарозу и маннит растворяли в очищенной воде до конечной концентрации, соответственно, 6 мг/мл (0,86 мМ), 1,6 мг/мл (4,7 мМ) и 10 мг/мл (55 мМ). Полученный раствор делили на пять равных порций. В четырех порциях рН доводили до 5,5 добавлением 30 мМ уксусной кислоты, виннокаменной кислоты, лимонной кислоты или фосфорной кислоты. Пептидные растворы, рН которых доводили таким образом, и пептидный раствор без доведения рН фильтровали через 0,22-микрометровый мембранный фильтр.

Полученные фильтраты переносили в 6-миллилитровые пробирки в количестве 1 мл в каждую пробирку. Для каждого значения рН раствора получали по 50 таких пробирок, всего 250 пробирок. Содержимое всех этих 250 пробирок было лиофилизировано.

Лиофилизированные образцы хранили в термостате при 60^oС и извлекали из термостата, соответственно, через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 недель. В каждую извлеченную пробирку добавляли 1 мл очищенной воды. Растворы, дополнительно разбавленные в 50 раз, использовали для измерения количества (в процентном содержании) варианта гирудина, остающегося в лиофилизированном образце тем же способом, что и в эксперименте примера 1. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Из вышеприведенных результатов можно видеть, что в лиофилизированных образцах стабильность улучшена после доведения рН добавлением органической кислоты. Однако стабильность не улучшается при использовании фосфорной кислоты, которая является неорганической кислотой.

Экспериментальный пример 3

Вариант гирудина HV1C3, очищенную сахарозу и маннит растворяли в очищенной воде до конечной концентрации, соответственно, 6 мг/мл (0,86 мМ), 1,6 мг/мл (4,7 мМ) и 10 мг/мл (55 мМ). Полученный раствор делили на четыре равные порции. Из них в трех порциях рН доводили до 5,0, 5,5 и 6,0 с использованием 30 мМ виннокаменной кислоты. Пептидные растворы с доведенным таким образом рН и пептидный раствор без доведения рН фильтровали через 0,22-микрометровый мембранный фильтр. Фильтраты переносили в 6-миллилитровые пробирки в количестве 1 мл на каждую пробирку. Для каждого рН раствора получали 50 таких пробирок, всего 200 пробирок. Все эти 200 пробирок были лиофилизированы.

Лиофилизированные образцы хранили в термостате при 60^oС и извлекали из него, соответственно, через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 недель. В каждую извлеченную пробирку добавляли 1 мл очищенной воды. Растворы, дополнительно разбавленные в 50 раз, использовали для измерения количества (в процентном содержании) варианта гирудина HV1C3, остающегося в лиофилизированном образце, тем же способом, что и в экспериментальном примере 1. Полученные результаты представлены в таблице 4.

Из вышеприведенных результатов можно видеть, что стабильность отчетливо улучшена при доведении рН до 5,0-6,5 с использованием органической кислоты, особенно виннокаменной кислоты.

Экспериментальный пример 4

Вариант гирудина HV1C3 и очищенную сахарозу растворяли в очищенной воде до конечной концентрации, соответственно, 5 мг/мл (0,86 мМ) и 1,6 мг/мл (4,7 мМ). Полученный раствор делили на четыре равные порции. В трех из этих порций рН доводили до 5,5 с использованием, соответственно, 5 мМ виннокаменной кислоты, 10 мМ виннокаменной кислоты и 30 мМ виннокаменной кислоты. Маннит добавляли к раствору без доведения рН до концентрации 10 мг/мл (55 мМ). Эти растворы фильтровали через 0,22-микрометровый мембранный фильтр. Фильтраты вносили в 6-миллилитровые пробирки в количестве 1 мл в каждую пробирку. 50 таких пробирок получали для какого рН раствора, всего 200 пробирок. Все эти 200 пробирок были лиофилизированы.

Лиофилизированные образцы хранили в термостате при 60^oС и извлекали из термостата, соответственно, через 1, 2, 3, 4, 5 и 6 недель. Количество (процентное содержание) варианта гирудина HV1C3, остающегося в лиофилизированном образце, определяли тем же способом, что и в экспериментальном примере 1. Результаты представлены в таблице 5.

Из вышеприведенных результатов можно видеть, что изучаемай эффект настоящего изобретения проявляется в достаточной мере при концентрации добавленной органической кислоты до 5 мМ.

Экспериментальный пример 5

Тем же способом, что и в экспериментальном примере 1, вариант гирудина HV1C3, очищенную сахарозу и маннит растворяли в очищенной воде до концентрации 6 мг/мл (0,86 мМ) варианта гирудина HV1C3 и концентрации очищенной сахарозы и маннита, представленных, соответственно, в таблице 6.

рН данного раствора доводили до 5,0 с использованием 5 мМ виннокаменной кислоты для получения пептидного раствора. Пептидные растворы, рН которых был доведен, и пептидный раствор перед доведением рН, фильтровали через 0,22-микрометровый мембранный фильтр. Фильтраты вносили в 6-миллилитровые пробирки в количестве 1 мл в каждую пробирку и лиофилизировали.

Все лиофилизированные образцы оказались стабильными, демонстрируя эффективность очищенного белого сахара и маннита в качестве наполнителей. Лиофилизированные образцы хранили в термостате при 60^oС и извлекали из термостата, соответственно, через 4 и 8 недель. В каждую извлеченную пробирку добавляли 1 мл очищенной воды. Растворы, дополнительно разбавленные в 50 раз, подвергали жидкостной хроматографии для измерения процентного содержания изомеров, помимо варианта гирудина HV1C3, в пиковой области. Полученные результаты представлены в таблице 6.

Из этих результатов можно видеть, что очищенная сахароза и маннит почти не влияют на стабильность. В частности, как показано в таблице 6, разница в количестве изомеров увеличивается через 4 недели и 8 недель очень незначительно, свидетельствуя о том, что добавление очищенной сахарозы или маннита не ослабляет эффекта органической кислоты на улучшение стабильности.

Экспериментальный пример 6

Лиофилизированные образцы, включающие в себя вариант гирудина HV1C3, были получены из пептидных растворов с помощью препаратов, представленных в таблице 7.

Лиофилизированные образцы хранили в термостате при 40^oС и извлекали из термостата через три месяца. В каждую извлеченную пробирку добавляли 1 мл очищенной воды. Растворы, дополнительно разбавленные в 50 раз, использовали для измерения количества (в процентном содержании) варианта гирудина HV1C3, остающегося в лиофилизированном образце, тем же способом, что и в экспериментальном примере 1. Средние значения по трем образцам представлены ниже. Хроматограммы, полученные в данном эксперименте, представлены на чертеже.

- Остаточный пептид (%)

1 - 98,5

2 - 98,2

3 - 96,9

4 - 90,0

Из этих результатов можно видеть, что добавление органической кислоты для доведения рН в диапазоне от 5,0 до 6,5 увеличивает устойчивость при длительном хранении.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Настоящее изобретение может эффективно предохранять пептид, имеющий последовательность -Asp-Gly- или -Asn-Gly-, такой как десульфированный гирудин или варианты гирудина, от превращения со временем в сукцинимидное соединение или в -перегруппированное соединение, увеличивая тем самым стабильность такого пептида (таблицу последовательностей см. в конце описания).