способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа
Классы МПК: | A61K9/19 лиофилизированные A61K38/58 из пиявок, например гирудин, эглин |
Автор(ы): | ФУРУЯ Хидеюки (JP), МОРИТА Хироюки (JP), ТАКАТСУ Юкитака (JP), МИТИБУТИ Косе (JP), ТАНИГАВА Макото (JP) |
Патентообладатель(и): | ДЖАПЭН ЭНЕРДЖИ КОРПОРЕЙШН (JP) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1998-01-19 публикация патента:
10.03.2002 |
Способ стабилизации гирудина или вариантов гирудина, содержащего последовательность -Asp-Gly- или Asn-Gly-, который включает в себя регулируемую замену последовательности -Asp-Gly- или Asn-Gly- на сукцинимидный фрагмент или
-перегруппированный фрагмент и лиофилизированную фармацевтическую композицию, содержащую гирудин с превосходной стабильностью, благодаря применению данного стабилизирующего способа. Способ стабилизации данного пептида включает в себя добавление органической кислоты и доведение рН раствора данного пептида до 5,0-6,5 и лиофилизацию полученной смеси. В качестве пептида используется десульфированный гирудин или вариант гирудина. Сахароза, маннит и тому подобное могут быть добавлены помимо данной органической кислоты. Изобретение позволяет эффективно предохранять гирудин при длительном хранении. 2 с. и 12 з.п. ф-лы, 8 табл., 1 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180053/946.gif)
Формула изобретения
1. Способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, который содержит последовательность Asp-Gly- или -Asn-Gly-, которая с течением времени может быть преобразована в сукцинимидный фрагмент, представленный общей формулой (1)![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180218/2180218-3t.gif)
или в
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180053/946.gif)
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180218/2180218-4t.gif)
при этом способ включает в себя получение раствора указанного гирудина, добавление органической кислоты, добавление гидроксида щелочного металла для доведения рН раствора до 5,0-6,5 и лиофилизацию раствора, который по существу состоит из компонентов, происходящих из гидроксида щелочного металла, добавленного для доведения рН, углеводов, таких, как белый сахар и маннит, которые включены дополнительно, органической кислоты и гирудина и/или вариантов гирудина. 2. Способ по п. 1, при котором гидроксид щелочного металла представляет собой гидроксид натрия. 3. Способ по п. 1 или 2, при котором гирудин представляет собой десульфированный гирудин или вариант гирудина. 4. Способ по любому из пп. 1-3, при котором органическая кислота представляет собой виннокаменную кислоту, лимонную кислоту или уксусную кислоту. 5. Способ по любому из пп. 1-4, при котором органическая кислота выбрана из ряда фармацевтически приемлемых карбоновых кислот, которые представляют собой двухосновные или трехосновные карбоновые кислоты, имеющие структуру с гидроксильной группой, замещенной по
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180039/945.gif)
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180218/2180218-5t.gif)
или в
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180053/946.gif)
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180218/2180218-6t.gif)
и органическую кислоту с добавлением гидроксида щелочного металла для доведения рН раствора до 5,0-6,5 и лиофилизацией раствора, который, по существу, состоит из компонентов, происходящих из гидроксида щелочного металла, добавленного для доведения рН, углеводов, таких, как белый сахар и маннит, которые включены дополнительно, органической кислоты и гирудина и/или вариантов гирудина, причем молярное соотношение гирудина и/или вариантов гирудина и органической кислоты составляет 1: 5-100. 9. Лиофилизированная содержащая гирудин фармацевтическая композиция по п. 8, в которой гидроксид щелочного металла представляет собой гидроксид натрия. 10. Лиофилизированная содержащая гирудин фармацевтическая композиция по п. 8, содержащая десульфированный гирудин или вариант гирудина и органическую кислоту в молярном соотношении 1: 5-100. 11. Лиофилизированная содержащая гирудин фармацевтическая композиция по п. 10, содержащая десульфированный гирудин или вариант гирудина, органическую кислоту и белый сахар в молярном соотношении 1: 5-100: 1-500. 12. Лиофилизированная содержащая гирудин фармацевтическая композиция по п. 10, содержащая десульфированный гирудин или вариант гирудина, органическую кислоту, белый сахар и маннит в молярном соотношении 1: 5-100: 1-500: 10-1000. 13. Лиофилизированная содержащая гирудин фармацевтическая композиция по любому из пп. 10-12, которая получена путем лиофилизации раствора десульфированного гирудина или варианта гирудина в концентрации 0,1-500 мг/мл. 14. Лиофилизированная содержащая гирудин фармацевтическая композиция по п. 13, в которой органическая кислота выбрана из различных фармацевтически приемлемых карбоновых кислот, которые представляют собой двухосновные или трехосновные карбоновые кислоты, имеющие структуру с гидроксильной группой, замещенной по
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180039/945.gif)
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к способу стабилизации и регуляции изменения в пептиде, который включает в себя последовательность -Asp-Gly- или -Asn-Gly- в аминокислотной последовательности, в которой последовательность -Asp-Gly- или -Asn-Gly- изменяется на сукцинимидный фрагмент с помощью реакции дегидратации или реакции дезамидирования и последующих изменений на![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180053/946.gif)
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180053/946.gif)
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180053/946.gif)
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180053/946.gif)
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180053/946.gif)
получение раствора пептида, который содержит последовательность -Asp-Gly- или -Asn-Gly-, которая может быть преобразована в сукцинимидный фрагмент, представленный с помощью нижеследующей общей формулы (1),
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180218/2180218-1t.gif)
или в
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180053/946.gif)
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180218/2180218-2t.gif)
добавление органической кислоты и доведение рН раствора до 5,0-6,5, и
лиофилизацию полученной смеси. В качестве пептида в настоящем изобретении использовали десульфированный гирудин или гирудиновый вариант. Кроме того, вышеуказанная цель достигается в настоящем изобретении с помощью фармацевтической композиции, полученной с применением вышеупомянутого способа стабилизации пептида, в частности, лиофилизированной фармацевтической композиции, содержащей гирудин, включающей в себя 5-100 молей органической кислоты, добавляемой к 1 молю десульфированного гирудина или гирудинового варианта. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, помимо органической кислоты, к данному пептидному раствору для лиофилизации добавляли 1-500 молей сахарозы и, по необходимости, 10-1000 молей маннита на один моль десульфированного гирудина или гирудинового варианта. На чертеже приведены хроматограммы, полученные жидкостной хроматографией, после того как лиофилизированные образцы, которые хранились в термостате при 40oС в течение 3-х месяцев, были проанализированы в экспериментальном примере 6, в котором номера соответствуют указанным здесь номерам. Способ настоящего изобретения применим к пептиду, включающему в себя аминокислотную последовательность -Asp-Gly- или -Asn-Gly- для контроля за заменой с течением времени этих радикалов на сукцинимидный фрагмент общей формулы (1) или на
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180053/946.gif)
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180039/945.gif)
Экспериментальный пример 1
Вариант гирудина HV1C3, обладающий аминокислотной последовательностью, представленный последовательностью 1 в таблице последовательностей, глицин и маннит растворяли в очищенной воде до конечной концентрации, соответственно, 6 мг/мл (0,86 мМ), 6,7 мг/мл (0,89 мМ) и 33,5 мг/мл (184 мМ). Полученный раствор делили на шесть равных порций. В этих порциях рН доводили до значений, показанных в таблице 1, добавлением 30 мМ виннокаменной кислоты, фосфорной кислоты или раствора Трис-буфера. Полученные пептидные растворы, в которых таким образом доводили рН, фильтровали через 0,22-микрометровый мембранный фильтр. Полученные фильтраты вносили в 6-миллилитровые пробирки в количестве 1 мл на каждую пробирку. Для каждого значения рН раствора получали 50 таких пробирок, всего 300 пробирок. Все эти 300 пробирок лиофилизировали. Лиофилизированные образцы хранили в термостате при 50oС и извлекали из термостата, соответственно, через 1, 2, 4, 6, 8 недель. 1 мл очищенной воды добавляли в каждую извлеченную пробирку. Растворы, дополнительно разбавленные 50-кратно, подвергали жидкостной хроматографии для измерения процентного содержания пиковой области варианта гирудина HV1C3 в условиях, показанных в таблице 2. Определяли количество (процентное содержание) варианта гирудина HV1C3, остающееся в данном лиофилизированном образце после хранения в термостате, отнесенное к количеству варианта гирудина HV1C3, содержащегося в начале хранения. Полученные результаты приведены в таблице 1. Из вышеприведенных результатов можно видеть, что лиофилизация образцов после доведения рН до 5,0-6,5 обеспечивает лучшую стабильность. Экспериментальный пример 2
Вариант гирудина HV1C3, очищенную сахарозу и маннит растворяли в очищенной воде до конечной концентрации, соответственно, 6 мг/мл (0,86 мМ), 1,6 мг/мл (4,7 мМ) и 10 мг/мл (55 мМ). Полученный раствор делили на пять равных порций. В четырех порциях рН доводили до 5,5 добавлением 30 мМ уксусной кислоты, виннокаменной кислоты, лимонной кислоты или фосфорной кислоты. Пептидные растворы, рН которых доводили таким образом, и пептидный раствор без доведения рН фильтровали через 0,22-микрометровый мембранный фильтр. Полученные фильтраты переносили в 6-миллилитровые пробирки в количестве 1 мл в каждую пробирку. Для каждого значения рН раствора получали по 50 таких пробирок, всего 250 пробирок. Содержимое всех этих 250 пробирок было лиофилизировано. Лиофилизированные образцы хранили в термостате при 60oС и извлекали из термостата, соответственно, через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 недель. В каждую извлеченную пробирку добавляли 1 мл очищенной воды. Растворы, дополнительно разбавленные в 50 раз, использовали для измерения количества (в процентном содержании) варианта гирудина, остающегося в лиофилизированном образце тем же способом, что и в эксперименте примера 1. Полученные результаты представлены в таблице 3. Из вышеприведенных результатов можно видеть, что в лиофилизированных образцах стабильность улучшена после доведения рН добавлением органической кислоты. Однако стабильность не улучшается при использовании фосфорной кислоты, которая является неорганической кислотой. Экспериментальный пример 3
Вариант гирудина HV1C3, очищенную сахарозу и маннит растворяли в очищенной воде до конечной концентрации, соответственно, 6 мг/мл (0,86 мМ), 1,6 мг/мл (4,7 мМ) и 10 мг/мл (55 мМ). Полученный раствор делили на четыре равные порции. Из них в трех порциях рН доводили до 5,0, 5,5 и 6,0 с использованием 30 мМ виннокаменной кислоты. Пептидные растворы с доведенным таким образом рН и пептидный раствор без доведения рН фильтровали через 0,22-микрометровый мембранный фильтр. Фильтраты переносили в 6-миллилитровые пробирки в количестве 1 мл на каждую пробирку. Для каждого рН раствора получали 50 таких пробирок, всего 200 пробирок. Все эти 200 пробирок были лиофилизированы. Лиофилизированные образцы хранили в термостате при 60oС и извлекали из него, соответственно, через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 недель. В каждую извлеченную пробирку добавляли 1 мл очищенной воды. Растворы, дополнительно разбавленные в 50 раз, использовали для измерения количества (в процентном содержании) варианта гирудина HV1C3, остающегося в лиофилизированном образце, тем же способом, что и в экспериментальном примере 1. Полученные результаты представлены в таблице 4. Из вышеприведенных результатов можно видеть, что стабильность отчетливо улучшена при доведении рН до 5,0-6,5 с использованием органической кислоты, особенно виннокаменной кислоты. Экспериментальный пример 4
Вариант гирудина HV1C3 и очищенную сахарозу растворяли в очищенной воде до конечной концентрации, соответственно, 5 мг/мл (0,86 мМ) и 1,6 мг/мл (4,7 мМ). Полученный раствор делили на четыре равные порции. В трех из этих порций рН доводили до 5,5 с использованием, соответственно, 5 мМ виннокаменной кислоты, 10 мМ виннокаменной кислоты и 30 мМ виннокаменной кислоты. Маннит добавляли к раствору без доведения рН до концентрации 10 мг/мл (55 мМ). Эти растворы фильтровали через 0,22-микрометровый мембранный фильтр. Фильтраты вносили в 6-миллилитровые пробирки в количестве 1 мл в каждую пробирку. 50 таких пробирок получали для какого рН раствора, всего 200 пробирок. Все эти 200 пробирок были лиофилизированы. Лиофилизированные образцы хранили в термостате при 60oС и извлекали из термостата, соответственно, через 1, 2, 3, 4, 5 и 6 недель. Количество (процентное содержание) варианта гирудина HV1C3, остающегося в лиофилизированном образце, определяли тем же способом, что и в экспериментальном примере 1. Результаты представлены в таблице 5. Из вышеприведенных результатов можно видеть, что изучаемай эффект настоящего изобретения проявляется в достаточной мере при концентрации добавленной органической кислоты до 5 мМ. Экспериментальный пример 5
Тем же способом, что и в экспериментальном примере 1, вариант гирудина HV1C3, очищенную сахарозу и маннит растворяли в очищенной воде до концентрации 6 мг/мл (0,86 мМ) варианта гирудина HV1C3 и концентрации очищенной сахарозы и маннита, представленных, соответственно, в таблице 6. рН данного раствора доводили до 5,0 с использованием 5 мМ виннокаменной кислоты для получения пептидного раствора. Пептидные растворы, рН которых был доведен, и пептидный раствор перед доведением рН, фильтровали через 0,22-микрометровый мембранный фильтр. Фильтраты вносили в 6-миллилитровые пробирки в количестве 1 мл в каждую пробирку и лиофилизировали. Все лиофилизированные образцы оказались стабильными, демонстрируя эффективность очищенного белого сахара и маннита в качестве наполнителей. Лиофилизированные образцы хранили в термостате при 60oС и извлекали из термостата, соответственно, через 4 и 8 недель. В каждую извлеченную пробирку добавляли 1 мл очищенной воды. Растворы, дополнительно разбавленные в 50 раз, подвергали жидкостной хроматографии для измерения процентного содержания изомеров, помимо варианта гирудина HV1C3, в пиковой области. Полученные результаты представлены в таблице 6. Из этих результатов можно видеть, что очищенная сахароза и маннит почти не влияют на стабильность. В частности, как показано в таблице 6, разница в количестве изомеров увеличивается через 4 недели и 8 недель очень незначительно, свидетельствуя о том, что добавление очищенной сахарозы или маннита не ослабляет эффекта органической кислоты на улучшение стабильности. Экспериментальный пример 6
Лиофилизированные образцы, включающие в себя вариант гирудина HV1C3, были получены из пептидных растворов с помощью препаратов, представленных в таблице 7. Лиофилизированные образцы хранили в термостате при 40oС и извлекали из термостата через три месяца. В каждую извлеченную пробирку добавляли 1 мл очищенной воды. Растворы, дополнительно разбавленные в 50 раз, использовали для измерения количества (в процентном содержании) варианта гирудина HV1C3, остающегося в лиофилизированном образце, тем же способом, что и в экспериментальном примере 1. Средние значения по трем образцам представлены ниже. Хроматограммы, полученные в данном эксперименте, представлены на чертеже. - Остаточный пептид (%)
1 - 98,5
2 - 98,2
3 - 96,9
4 - 90,0
Из этих результатов можно видеть, что добавление органической кислоты для доведения рН в диапазоне от 5,0 до 6,5 увеличивает устойчивость при длительном хранении. ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Настоящее изобретение может эффективно предохранять пептид, имеющий последовательность -Asp-Gly- или -Asn-Gly-, такой как десульфированный гирудин или варианты гирудина, от превращения со временем в сукцинимидное соединение или в
![способ стабилизации гирудина и/или вариантов гирудина, лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная с применением данного способа, патент № 2180218](/images/patents/290/2180053/946.gif)
Класс A61K9/19 лиофилизированные
Класс A61K38/58 из пиявок, например гирудин, эглин