устройство и способ для проведения иммунофлуоресцентных анализов

Формула изобретения

1. Устройство для проведения иммунофлуоресцентных анализов путем возбуждения быстро исчезающего поля, в котором расположен по меньшей мере один источник 7, 7" света, испускающий практически монохроматический свет и направляющий световые лучи с длиной волны, вызывающей флуоресценцию маркирующего вещества, связанного с химическим или биохимическим партнером общей системы рецептор - лиганд, под углом , определяющим быстро исчезающее поле посредством заданной глубины проникновения d, на пограничную поверхность 20 между оптически прозрачной подложкой 1, выполненной из материала, показатель преломления n₁ которого больше показателя преломления n₂ материала над пограничной поверхностью 20, и приемной зоной 2 для образца, имеющей форму кюветы и покрытой покрывающей пластиной 3, расположенной с противоположной от подложки 1 стороны, при этом между подложкой 1 и покрывающей пластиной 3 или зоной впуска для образца в приемную зону 2 расположен по меньшей мере один функциональный слой 26, 27, 28, 28", 29, обтекаемый в боковом или поперечном направлении посредством разрежения, давления или капиллярной силы, предназначенный для приготовления образца, причем с той же стороны подложки 1, где расположен источник света, расположен детектор 5 для обнаружения флуоресцентного излучения.

2. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что между подложкой 1 и покрывающей пластиной 3 расположена прокладка 4, образующая указанную приемную зону 2 в форме кюветы.

3. Устройство по пп. 1 и 2, отличающееся тем, что в покрывающей пластине имеются впускное отверстие и выпускное отверстие 9, 11.

4. Устройство по одному из пп. 1-3, отличающееся тем, что функциональный(ые) слой(и) 26, 27, 28, 28", 29 состоит(ят) из волокнистого материала, целлюлозы, нитроцеллюлозы, полипропилена, поликарбоната, поливинилдифторида, или из гидрогеля, или полиэлектролитов, или из ядерных трэковых или стекловолоконных мембран, или выполнены в виде наполненных колонок.

5. Устройство по одному из пп. 1-4, отличающееся тем, что по меньшей мере один функциональный слой 29 в приемной зоне 2 находится в непосредственном контакте с подложкой.

6. Устройство по одному из пп. 1-5, отличающееся тем, что функциональные слои 26, 27, разделенные разделяющими слоями 25, 25", расположены поочередно один над другим, обеспечивая возможность соединения впускного и выпускного отверстий 9, 11 через приемную зону 2 посредством отверстий.

7. Устройство по п. 5, отличающееся тем, что по меньшей мере два различных функциональных слоя 28, 28", 29 расположены рядом друг с другом в одной плоскости.

8. Устройство по одному из пп. 1-5, отличающееся тем, что функциональные слои 28, 28", 29 расположены непосредственно один над другим.

9. Устройство по одному из пп. 1-8, отличающееся тем, что имеется контейнер 10 для образца, задающий определенный объем образца, расположенный таким образом, что между ним и приемной зоной 2 в форме кюветы образовано соединение.

10. Устройство по одному из пп. 1-9, отличающееся тем, что в контейнере 10 для образца во впускном канале, в приемной зоне 2 образуется твердая фаза или по существу образуется функциональный слой.

11. Способ проведения иммунофлуоресцентных анализов путем возбуждения быстро исчезающего поля, при котором объем образца направляют посредством разрежения или давления, или посредством капиллярных сил через функциональный слой или функциональные слои 26, 27, 28, 28", 29, предназначенные для приготовления образца, затем - к поверхности образца в приемной зоне 2, выполненной в форме кюветы, через эту зону присоединяют меченые химические или биохимические компоненты, определяемые в соответствии с биохимическим анализом, и путем возбуждения быстро исчезающего поля измеряют с помощью детектора 5 флуоресцентное излучение в зависимости от времени.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что при помощи функционального(ых) слоя(ев) 26, 27, 28, 28", 29 проводят фильтрацию, разделение и удаление мешающих веществ и высвобождение реагентов или химические реакции.

13. Способ по пп. 11-12, отличающийся тем, что нарастание в измеренной интенсивности флуоресцентного излучения используют для определения концентрации анализируемого вещества.

14. Способ по пп. 11 и 12, отличающийся тем, что разницу между двумя сигналами S₁ и S₂ интенсивности флуоресценции, измеренными с интервалами, которые могут быть заданы, используют для определения концентрации анализируемого вещества.

15. Способ по одному из пп. 11-14, отличающийся тем, что проводят биохимические анализы общих систем рецептор - лиганд, таких как антиген - антитело, лектин - углевод, ДНК или РНК - комплементарная нуклеиновая кислота, ДНК иди РНК - белок, гормон - рецептор, фермент - кофакторы фермента, белок G или белок А - иммуноглобин или авидин - биотин.

16. Способ по одному из пп. 11-15, отличающийся тем, что проводят сэндвич-анализы, анализы титрования, конкуренции и/или замещения.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к устройству, специально предназначенному для проведения количественных иммунофлуоресцентных анализов путем возбуждения быстро исчезающего поля. Большинство разнообразных известных биохимических анализов общих систем рецептор - лиганд, таких как антиген - антитело, лектин - углевод, ДНК или РНК - комплементарная нуклеиновая кислота, ДНК или РНК - белок, гормон - рецептор, фермент - кофакторы фермента, белок G или белок А - иммуноглобин или авидин - биотин, могут быть взяты за основу. Однако предпочтительны системы антиген - антитело. В частности согласно данному изобретению можно обнаружить высокомолекулярные и низкомолекулярные соединения (например, гаптены).

Иммунофлуоресцентные анализы или даже иммунофлуоресцентные сенсоры уже используются на протяжении длительного времени и служат для определения неизвестного количества конкретного химического или биохимического вещества, находящегося главным образом в форме жидкого образца. Антитела здесь селективно связаны с определяемым веществом. Определяемое вещество специалисты в данной области называют антигеном. В иммунофлуоресцентных анализах антитела, специфические к анализируемому веществу, мечены маркирующим веществом, которое превращается в оптически возбужденное при определенной, специфической для данного вещества длине волны и флуоресцентное излучение с другой длиной волны, которая обычно больше, используется вместе с подходящим детектором для оценки интенсивности флуоресцентного излучения. Использование возбуждения быстроисчезающего поля в проведении таких иммунофлуоресцентных анализов или, соответственно, в иммунофлуоресцентных сенсорах уже является частью уровня техники. Так, различные растворы уже описаны в WO 94/27137, R. A. Badlay, R.A.L. Drake, I.A. Shanks, F.R.S., A.M. Smith и P.R. Stephenson в "Optical biosensors for immunoassays; fluorescence capillary-fill device", Phil. Trans. R. soc. Lund. В 316, 143-160 (1987) и D. Christensen, S. Dyer, D. Fowers и J. Herron, "Analysis of Exitation and Collection Geometries for Planar Waveguide Immunosensors", Proc. SPIE-lnt. Opt. Eng. Vol. 1986, Fiber Optic Sensors in Medical Diagnostics, 2-8 (1993).

Кроме того, в WO 90/05295 А1 описывается оптическая биосенсорная система. В этой системе один или более чем один образец направляется, с использованием насосов и вентилей, через каналы к одной или более чем одной проточной измерительной ячейке. Эти проточные измерительные ячейки открыты сверху, и биомолекулы могут быть количественно обнаружены с помощью оптической структуры, расположенной над ними. Следовательно, успешное исследование новых образцов требует значительных затрат на их очистку с целью избежания ошибок измерения. Кроме того, в случае необходимости, процесс приготовления образца должен осуществляться вне этой системы перед действительным измерением, так как никаких элементов или средств измерения, подходящих для этой цели, здесь не упоминается.

В WO 90/06503 описан сенсор, в котором возбужденный свет направлен под соответствующим углом через оптически прозрачный субстрат на пограничную поверхность на оптически прозрачный буферный слой. Над ним создан дополнительный светопроводящий слой, с которым, в свою очередь, могут быть связаны анализируемые вещества, концентрация которых должна быть определена.

Показатель преломления буферного слоя здесь меньше, чем таковой у субстрата и светопроводящего слоя. На пограничном слое субстрат/буфер полное отражение определяется соответствующим выбором угла возбужденного света, и продуцируемое здесь быстро исчезающее поле позволяет возбужденному свету проникать в светопроводящий слой, расположенный над буферным слоем. Свет, проникнув в светопроводящий слой, направляется путем полного отражения в светопроводящем слое, и быстро исчезающее поле, образующееся в ходе этого процесса, соответствует используемому для возбуждения флуоресценции.

Образец может быть принят в одну или более чем одну полость, причем соответствующие размеры такой полости ограничены только величиной, которая делает возможным транспорт этих образцов в эти полости посредством капиллярной силы. После того как образец принят в полости, никакого дальнейшего течения или движения образца не происходит.

Однако известные растворы обладают обычно тем недостатком, что они подходят только для конкретных видов анализа и требуют дорогостоящего оборудования для проведения анализа и управления этим процессом.

Поэтому задачей данного изобретения является создание возможного пути подходящего для проведения с помощью очень просто сконструированного устройства, количественного иммунофлуоресцентного теста в различных биохимических анализах.

Согласно данному изобретению эта задача решается при использовании устройства, характеризующегося признаками, содержащимися в отличительной части пункта 1, и признаками пункта 11 для способа. Преимущественные воплощения и развития изобретения возникают при использовании устройства, характеризующегося признаками, содержащимися в зависимых пунктах.

В устройстве, описанном в опубликованном, но не приоритетном DE 19611025, свет по меньшей мере одного источника света направлен под углом на границу двух сред с различными показателями преломления. Здесь выбирается источник света, испускающий практически монохроматический свет с длиной волны, подходящей для возбуждения маркирующего вещества, в этом случае флуорофора. Особенно подходящими здесь в качестве источника света являются лазерные диоды, так как они имеют подходящий профиль прогона и достаточную световую эффективность при маленьком конструктивном размере и низком потреблении энергии.

Однако другие источники света, которые испускают монохроматический свет, также могут быть использованы.

Угол , под которым испускаемый свет направлен на пограничную поверхность, вместе с длиной волны света, а также с показателем преломления материала, расположенного в траектории пучка перед пограничной поверхностью, и материала, примыкающего к ней, определяет глубину проникновения d для быстро исчезающего поля. Показатель n₁ преломления материала, расположенного в траектории пучка перед пограничной поверхностью, должен делать возможным полное отражение на пограничной поверхности и должен, поэтому, быть больше, чем показатель преломления n₂ другого материала, расположенного после нее. Угол предпочтительно выбирается таким образом, чтобы выполнялось условие: sin()>n₂/n₁. Если это условие выполнено, весь свет отражается на пограничной поверхности и, таким образом, достигается полное отражение. Однако, когда это условие выполнено, относительно небольшая часть света проникает через пограничную поверхность в материал, расположенный в траектории пучка за пограничной поверхностью, и продуцируется быстро исчезающее поле. Благодаря этому быстроисчезающему полю, только те маркирующие вещества оказываются оптически возбужденными, которые локализованы в непосредственной близости от пограничной поверхности. При проведении иммунофлуоресцентных анализов результатом этого является то, что маркирующие вещества только тех антител или антигенов, которые связаны с поверхностью пограничной поверхности, оказываются возбужденными. Интенсивность флуоресценции света, испускаемого этими флуорофорами, таким образом, прямо пропорциональна концентрации меченых антител или антигенов, связанных с поверхностью, и, в соответствии с используемым биохимическим анализом, пропорциональна или обратно пропорциональна концентрации антигена.

В настоящее время в устройстве, описанном в DE 19611025, используется по меньшей мере один источник света, который испускает практически монохроматический свет и направляет его под углом, обеспечивающим глубину проникновения d для быстро исчезающего поля, на подложку, которая является прозрачной для этого света. Показатель преломления n₁ этой подложки должен быть больше, чем 1,33. С другой стороны этой подложки, перед покрывающей пластиной, образуется приемная зона в форме кюветы. Между подложкой и приемной зоной в форме кюветы образуется указанная пограничная поверхность, и быстро исчезающее поле может действовать с данной глубиной проникновения d в пределах приемной зоны в форме кюветы на меченых химических или биохимических партнеров, связанных с поверхностью, общей системы рецептор - лиганд и возбуждать флуорофоры, используемые в качестве маркирующего вещества.

Соответствующая интенсивность флуоресценции, вызванной таким образом, измеряется с помощью детектора. Детектор здесь расположен с той же стороны подложки, что и источник света.

В качестве детектора здесь может быть использован единственный светочувствительный детектор или несколько светочувствительных детекторов с линейной или поверхностной схемой расположения.

Здесь также отмечается, что преимуществом является направление на образец поляризованного света, концентрацию которого надо определить. С этой целью в траектории пучка света, вслед за источником света может быть расположен поляризатор.

Прокладка и разделяющие слои, которые могут быть использованы, составляют 0,001-10 мм в толщину, предпочтительно 50 мкм, а углубление в прокладке образует приемную зону для образца. Прокладка и разделяющие слои могут предпочтительно представлять собой биосовместимую клейкую пленку, липкую с обеих сторон.

Способ по изобретению основан по существу на том факте, что определенный объем образца направляется через приемную зону в форме кюветы и там подвергается возбуждению быстроисчезающим полем, как уже было описано. Этот объем образца может направляться через приемную зону в форме кюветы и функциональный(ые) слой(и) посредством разрежения, давления, капиллярных сил.

В преимущественном воплощении в покрывающей пластине сделано по меньшей мере одно впускное отверстие, в которое может быть вставлен или в котором может быть расположен контейнер для образца, причем это отверстие так расположено в покрывающей пластине, что образуется соединение между впускным отверстием или контейнером для образца и приемной зоной. Кроме того, существует второе отверстие, которое также связано с приемной зоной в форме кюветы и представляет собой выпуск.

В покрывающей пластине может быть сделано также второе отверстие. С этим вторым отверстием может быть соединен внешний насос, или в него может быть вставлен внутренний насос.

Изобретение отличается тем, что относительно просто сконструированная основная конфигурация устройства по изобретению может быть изменена или использована в наиболее подходящем для конкретного эксперимента виде. Так, существенные элементы, такие как подложка, покрывающая пластина и прокладка с приемной зоной в форме кюветы могут быть объединены самыми разнообразными способами посредством функциональных слоев и разделяющих слоев, расположенных, если необходимо, в середине, но тем не менее позволяющих образцу течь насквозь. Однако один или более чем один функциональный слой может также быть расположен во впускной зоне для образца в приемную зону, причем впускное отверстие или соединение между контейнером для образца, который может быть вставлен во впускное отверстие, и приемной зоной или соединение впускного отверстия и приемной зоны образуют часть этой впускной зоны.

С помощью устройства по данному изобретению можно проводить различные виды анализа и, следовательно, в равной степени можно определять высоко- и низкомолекулярные соединения. Можно проводить все известные виды анализа, такие как сэндвич, титрование, конкуренция и замещение.

В случае, когда разделяющие слои располагаются между функциональными слоями или по обе стороны от них, эти разделяющие слои должны иметь соответствующие отверстия, которые позволяют объему образца течь через внутреннее устройство. В качестве разделяющих слоев можно использовать клейкие пленки, например такие, в которых путем штамповки сделаны отверстия.

На чертежах представлены:

фиг.1 - часть устройства по изобретению для приема образца;

фиг. 2 - схематическое изображение воплощения устройства, сконструированного по данному изобретению, с двумя источниками света;

фиг.3 - устройство с контейнером для образца;

фиг.4 - устройство с цилиндрическим полым корпусом;

фиг. 5 - устройство с дополнительными функциональными слоями, с боковым потоком;

фиг. 6 - устройство с множеством функциональных слоев и с поперечным потоком;

фиг.7 и 8 - образцы зависимой от времени интенсивности флуоресценции;

фиг.9 - вид сэндвич - анализа;

фиг.11 - вид анализа титрование или конкуренция;

фиг. 12 и 13 - вид анализа конкуренция или замещение, с прямо пропорциональным соотношением концентрации анализируемого вещества и интенсивности сигнала;

фиг.14 - вид анализа, использующего дополнительную твердую фазу;

фиг.15 - анализ замещение с дополнительной твердой фазой;

фиг.16 - дальнейший анализ замещение;

фиг.17 - общий ключ для видов анализа, представленных на фиг.9-16.

На фиг. 1 представлена основная структура части устройства по изобретению. Три части, представленные здесь, подложка 1, прокладка 4 и покрывающая пластина 3, могут быть соединены друг с другом непосредственно перед проведением иммунофлуоресцентного анализа или образовывать уже полностью завершенную единицу и напоминать по своей структуре проточную ячейку и измерительную кювету.

Подложка 1 состоит из высокорефракционного прозрачного материала, такого как, например, стекло или пластмасса, такая как полимер (РММА или PC), с показателем преломления ₁>1,33. Толщина подложки может быть в пределах диапазона от 0,01 до 10 мм, предпочтительно между 0,5 и 1 мм.

Прокладка 4 предпочтительно представляет собой тонкую фольгу, которая снабжена по обеим сторонам клейкой пленкой, либо тонкая клейкая пленка может быть нанесена, во-первых, на подложку 1 и, во-вторых, на покрывающую пластину 3. Общая толщина прокладки, включая используемый адгезив, должна быть в диапазоне между 0,001 и 10 мм, предпочтительно между 0,01 и 0,2 мм, а толщина 50 мкм является наиболее предпочтительной. В прокладке 4 сделано отверстие, и оно образует приемную зону 2 в форме кюветы.

На фиг.1 также можно видеть покрывающую пластину 3, в которой образованы сплошные отверстия 9 и 11, в этом примере высверленные. Их функция будет обсуждаться позднее. Отверстия 9 и 11 здесь расположены таким образом, что они по меньшей мере частично перекрывают область приемной зоны 2 прокладки 4. Прокладка 4 может предпочтительно также состоять из биосовместимой клейкой пленки, которая снабжена по обеим сторонам отделяемым защитным слоем и уже имеется в продаже.

В примере, представленном на фиг. 2, в устройстве по изобретению используют два источника света 7, 7^,, фильтры 19, 19^, и поляризаторы 18, 18". Источник света 7^, испускает свет с длиной волны, которая отличается от первого источника света 7. В этом примере предпочтительно используется поляризованный свет.

Устройство, представленное на фиг.2, может преимущественно применяться, когда используются различные маркирующие вещества, возбуждаемые при разных длинах волн. Примерами их являются флуорофоры Су 5 и Су 7. Чтобы возбудить флуорофор Су 5, используется лазерный диод, испускающий свет с длиной волны между 635 и 655 нм, а для возбуждения флуорофора Су 7 используется лазерный диод, испускающий свет с длиной волны между 730 и 780 нм.

С помощью данного воплощения изобретения измерение осуществляется таким образом, что диоды 7 и 7^, включены либо альтернативно, либо, например, используются соответственно синхронизированные прерыватели, которые обеспечивают выполнение условия, что свет только от одного источника света 7 или 7" может достичь образца для его возбуждения, и таким образом, не происходит никаких искажений.

Однако, так как здесь два различных сигнала флуоресценции должны пройти через один и тот же фильтр, широкополосный фильтр 8 не может больше использоваться. Следовательно, два фильтра 8 и 8" должны быть расположены последовательно, что селективно блокирует длины волн возбуждающих источников света 7 и 7^,. Режекторные фильтры, например, могут быть использованы для этой цели.

С помощью данного приспособления сначала должен быть получен опорный сигнал, что делает возможным внутреннюю калибровку сигнала измерения. Для определения точки отсчета используется эталонное антитело, которое не направлено против антигена из образца. Эталонное антитело сначала определяют количественно и делают отличимым, с помощью различных маркирующих веществ, от специфичного к анализируемому веществу антитела Ak. Количество эталонного антитела, действительно связанного с поверхностью, может быть определено с помощью второго источника света 7", который вызывает флуоресценцию различных маркирующих веществ, второго рассеивающего светофильтра 8" и детектора 5. С помощью такого определения могут быть учтены потери меченых специфичных к анализируемому веществу антител Ak или антигенов Аg, не связанных с поверхностью.

Однако помимо получения опорного сигнала, можно, независимо один от другого, осуществлять два иммуноанализа, отличающихся использованием различных флуорофоров.

На фиг.3 показано, как контейнер для образца 10 расположен по отношению к отверстию 9 в покрывающей пластине 3, и таким образом осуществляется соединение между контейнером для образца 10 и приемной зоной 2 через отверстие 9. Здесь контейнер для образца 10 образует контейнер, в котором известное количество биокомпонента, меченого маркирующим веществом флуорофором, замешано в образец, концентрацию которого необходимо определить. Контейнер для образца 10 четко определяет объем образца, и, таким образом, с помощью фиксированного и известного объема образца может быть получено количественное представление о концентрации антигена. Контейнер для образца 10 должен, поэтому, всегда быть заполнен одним и тем же количеством для того, чтобы получать воспроизводимые результаты. Преимущественно он должен быть всегда заполнен до максимума. В некоторых видах анализов, которые можно проводить, конкретный биокомпонент находится, соответственно, на поверхности контейнера для образца 10 и, вследствие контакта с жидким образцом, он сам отделяется от поверхности и поступает в образец. Более того, биокомпоненты также могут находиться на дополнительных твердых фазах в контейнере для образца 10. Простой и уже известный способ состоит в нанесении лиофилизированных антител на поверхность контейнера для образца 10. В данном случае становится возможным хранить все это относительно долгое время, до фактического проведения иммуноанализа. Приемная зона 2 определяет поверхность на подложке, на которой, в соответствии с видом анализа, иммобилизованы соответствующие химические или биохимические вещества.

На фиг. 4 представлен предпочтительно цилиндрический полый корпус 12, в который вставлен поршень 13 или какое-либо другое подходящее покрытие, причем оба служат в качестве насоса. Если поршень 13 движется наружу из цилиндрического полого корпуса 12, создается отрицательное давление, которое отсасывает материал образца из контейнера для образца 10 через приемную зону 2 по направлению к цилиндрическому полому корпусу 12. Поток поддерживается с помощью капиллярных сил в приемной зоне 2 и с помощью поглощающего полотна с ворсом до тех пор, пока весь объем образца не будет транспортирован через приемную зону 2. Цилиндрический полый корпус 12 может передвигаться, или имеет отверстие в своем основании, так, что существует соединение с приемной зоной 2. Это может осуществляться через второе отверстие 11 в качестве варианта соединения в покрывающей пластине 3. Если не используется покрывающая пластина 3, возможность соединения может быть спланирована другим способом.

Кроме того, внешний насос также может быть присоединен к отверстию 11.

После нанесения образца (с помощью контейнера для образца 10) необходимо подождать соответствующее время, чтобы желаемое связывание между партнерами общей системы рецептор - лиганд прошло полностью. После этого насос 12, 13 активируется и нужно подождать до тех пор, пока вся жидкость будет перекачана через приемную зону 2. После возбуждения с помощью источника света 7 или источников света 7 и 7" может быть определена концентрация антигена, для чего следует использовать структуру по изобретению, как она представлена на фиг.2.

Эта структура, как ранее показано и описано, может быть использована для самых разнообразных биохимических анализов, и в дальнейших примерах авторы вернутся к этому.

Как видно, особенно на фиг.1, 5 и 6, существенная часть устройства по изобретению может быть сконструирована самыми разнообразными способами. Так, различные элементы (пластины, слои) могут быть скомпонованы из набора в самых разнообразных конфигурациях и, соответственно, это делает устройство доступным для различных видов анализов in situ, в соответствии с требованиями.

Так, на фиг.5 показан пример устройства по изобретению, в котором представлены дополнительные функциональные слои с боковым потоком. Здесь, кроме того, функциональные слои 26 и 27 и разделяющие слои 25 и 25^, включены в структуру, уже известную из описания фиг.1. В данном примере два функциональных слоя 26 и 27 расположены один над другим, причем с обеих сторон к ним прилегают разделяющие слои 25 и 25". Разделяющие слои здесь предпочтительно могут быть спланированы как клейкие пленки, в которых сделаны отверстия, как уже описывалось выше. Эти отверстия нужны для того, чтобы делать возможным соединение между впускным отверстием 9, функциональными слоями 26, 27, приемной зоной 2 и выпускным отверстием 11. Стрелки, нарисованные на фиг.5, воспроизводят здесь направление потока.

Адаптация к различным видам анализа может быть достигнута путем изменения схемы расположения и/или выбором функциональных слоев 26, 27. Так, функциональные слои 26 и 27 могут представлять собой, например, резервуар для реагента или чистый реакционный слой.

Однако также существует возможность расположения по меньшей мере двух различных функциональных слоев в одной плоскости так, что они могут быть обтекаемы последовательно.

Структура, представленная на фиг. 6, части устройства по изобретению отличается от представленной на фиг.5 тем, что может достигаться поперечный поток. В этом примере три функциональных слоя 28, 28" и 29 расположены непосредственно один над другим, то есть без разделяющих слоев, непосредственно на подложке. В пределах стопы слоев, образованной таким образом из функциональных слоев 28, 28" и 29, прокладка 4 с приемной зоной 2 в форме кюветы в данном примере расположена непосредственно под покрывающей пластиной 3. Здесь также стрелки, нарисованные на фиг.6, указывают направление потока.

В отличие от структуры, показанной на фиг.6, естественно, также могут быть использованы другие схемы расположения, которые обеспечивают поперечный поток. Как уже упоминалось, функциональные слои могут варьироваться по их числу, схеме расположения и выбору функции. В противоположность продемонстрированному примеру может также быть разработана схема расположения функциональных слоев над прокладкой 4.

В данном примере также могут быть использованы разделяющие слои, но при этом нужно иметь в виду, что для поперечного потока не должно быть помех. Функциональные слои вновь могут служить в качестве резервуара для реагента или в качестве реакционного слоя.

Функциональные слои, которые следует использовать по настоящему изобретению, обладают здесь тем преимуществом, что получается завершенная, составляющая единое целое (интегрированная) измерительная система, и только образец должен проводиться через эту структуру.

Комбинации поперечного и бокового потока (комбинации примеров на фиг.5 и 6) также возможны.

Функциональные слои 26, 27, 28, 28" и 29 могут быть использованы с целью приготовления образцов (забуферивание, фильтрация, разделение, устранение помех среди прочего), могут быть использованы в качестве слоя-носителя реагента (например, для высвобождения коньюгата) или в качестве реакционного слоя (например, для дериватизации, для иммобилизации биокомпонентов или для ряда химических и/или иммунохимических реакций).

Подходящими материалами для различных функциональных слоев являются:

для приготовления образца - например мембраны, сделанные из волокнистого материала, для разделения плазмы и эритроцитов, которые доступны, например, от компании Pall Biosupport как "Hemadyne-Membrane". Однако фильтровальная бумага, сделанная из целлюлозы или регенерированной целлюлозы, также может быть использована для этой цели;

слой-носитель реагента - для него также может быть использована бумага, сделанная из 100% целлюлозы, или активированный нейлон 66, причем эти поверхности могут быть активированными или модифицированными для того, чтобы изменять свойства потока (коммерчески доступны от компании Pall Biosupport под товарным знаком "Prodyne оder ACCUWIK-Membrane"), или, особенно для систем с боковым потоком, полиэфирные носители с модифицированной поверхностью, в которых свойства потока можно контролировать;

реакционные слои - так называемые проточные нитромембраны, сделанные из нитроцеллюлозы, ПВДФ (поливинилдифторид) мембрана (коммерчески доступна от компании Millipor под товарным знаком "Immobilon"), и здесь также поверхность может быть модифицирована.

В общем, волокнистые материалы, целлюлоза, нитроцеллюлоза, полипропилен, поликарбонат, поливинил дифторид, гидрогели (например декстран, акриламид, агар-агар, карагинан, альгиновая кислота), полиэлектролиты (например акриловая кислота, поли-L-лизин, поли-L-глутаминовая кислота) или ядерные трэковые мембраны, или стекловолоконные мембраны могут быть использованы.

Основные возможные пути оценки сигналов измерения представлены на фиг.7 и 8.

На фиг.7 показана зависимость от времени интенсивности измеренного сигнала флуоресценции. С линейным нарастанием интенсивности сигнала флуоресценции достаточно определить нарастание сигнала путем дифференцирования, так как это нарастание может быть скоррелировано с временным изменением количества флуорофора, которое может быть измерено с помощью устройства по изобретению. В этом случае время измерения может поддерживаться очень коротким, так как нарастание интенсивности флуоресценции должно быть определено только в течение короткого периода времени, независимо от того, происходит это вначале или в более поздний момент времени, при проведении химического или биохимического анализа. Следует иметь ввиду только диапазон насыщения и заботиться о том, чтобы измерение проводилось только в отрезок времени, в который временное изменение интенсивности сигнала флуоресценции может быть обнаружено.

В отличие от этого, другая возможность представлена в принципе на фиг.8. Здесь образуется и используется для оценки разница между начальной и конечной величиной. Вначале получают основной сигнал S₁ перед добавлением анализируемого вещества, концентрацию которого необходимо определить, во время t₁ и, после добавления анализируемого вещества в момент времени t₂, который может быть задан, определяют конечную величину S₂ измеренной интенсивности флуоресценции. Концентрация анализируемого вещества может быть затем определена через разницу величин S₂ и S₁. Разница между временем t₂ и t₁ должна быть столь велика, чтобы образовалось равновесие.

На фиг.9-16 представлены возможные виды анализа, которые можно проводить с помощью данного изобретения.

На фиг. 9 представлен вид сэндвич-анализа, который практически подходит только для высокомолекулярных соединений (белки, среди прочего).

Этот вид сэндвич-анализа в принципе можно проводить в устройстве, как оно представлено на фиг.5 или 6, в котором следует использовать по меньшей мере один функциональный слой.

Здесь анализируемое вещество сначала следует инкубировать с меченым антителом, а затем помещать в детекторную зону подложки 3 для возбуждения быстро исчезающим полем и последующей флуоресценции.

Другой возможный путь проведения сэндвич-анализа в последовательной форме заключается в том, что сначала анализируемое вещество, а затем меченое антитело образуют сэндвич шаг за шагом.

Другими возможными путями иммобилизации антитела в области подложки являются:

1. адсорбция;

2. ковалентное связывание;

3. аффинное связывание (например, антитела с белком A/G или, после биотинилирования, с авидином);

4. путем гибридизации маркера нуклеиновой кислоты, локализованного на антителе (однонитевая РНК или ДНК) с иммобилизованной однонитевой нуклеиновой кислотой (РНК или ДНК) с комплементарной последовательностью.

Более того, покрытие области подложки для возбуждения быстро исчезающим полем белком A/G, авидином среди прочего, дает возможность получения универсального элемента (для самых разнообразных анализируемых веществ).

В особенно преимущественном воплощении предлагается преинкубация анализируемого вещества с биотинилированным (коллектор) антителом и флуоресцентно меченым (детектор) антителом. Эти два антитела могут, например, быть выделены одновременно или последовательно из функционализированных слоев. Весь иммунокомплекс затем связывается путем связывания с сенсорной поверхностью, покрытой авидином (альтернативно стрептавидином или нейтравидином). Критической для формирования сигнала является очень высокая аффинность между биотином и авидином, это ведет к улучшению чувствительности анализа.

В данном воплощении устройство по фиг.2 может также быть использовано вместе с двумя различными маркирующими веществами, и, таким образом, может проводиться определение концентрации двух различных анализируемых веществ как бы одновременно, а также независимо от соответствующих сайтов связывания в приемной зоне, так что связывание меченых биокомпонентов не должно было происходить местно селективно.

Однако также можно проводить вид анализа, при котором антитело и фрагмент меченого антитела (например Fc-часть или ScFv-фрагмент) инкубируются одновременно с анализируемым веществом, как показано на фиг.10. Здесь только полное антитело связывается (с белком A/G или, после биотинилирования, также с авидином), и, таким образом, необходимость в инкубации исчезает. В этом виде анализа существует основная возможность регенерирования используемой структуры. Это, однако, невозможно при образовании комплекса авидин/биотин.

При одновременной инкубации анализируемого вещества, антитела и фрагмента меченого антитела в сэндвич-анализе, как показано на фиг.10, фрагмент меченого антитела и антитело могут содержаться, например в функциональном слое 27 примера, показанного на фиг.5.

Вместо иммобилизации коллекторного антитела другие биокомпоненты, связывающие анализируемое вещество, также могут быть иммобилизованы (например, белок A/G в случае сэндвич-анализа для определения антител).

Во всех видах сэндвич-анализа имеет место прямо пропорциональная корреляция между сигналом и концентрацией анализируемого вещества.

Кроме того, один или более чем один компонент иммунохимической реакции могут быть приготовлены на функциональных слоях, как в случае с высвобождением коньюгата, например.

На фиг.11 представлены возможности для видов анализа титрование/конкуренция, которые отличаются друг от друга последовательной или одновременной инкубацией иммунокомпонентов. Эти два вида анализа особенно подходят для определения низкомолекулярных соединений, которые не могут образовывать сэндвич.

Кроме того, виды анализа, представленные на фиг.11, обладают не прямо пропорциональной, а обратно пропорциональной корреляцией между концентрацией анализируемого вещества и интенсивностью измеренного сигнала флуоресценции.

Так, в верхнем примере, показанном на фиг.11, меченое антитело может находиться, например в функциональном слое 27 примера, показанного на фиг.5.

Средний пример фиг.11 может быть спланирован таким образом, что меченое анализируемое вещество может содержаться, например также в этом слое. Нижнее изображение фиг.11 может быть воплощено таким образом, что меченое анализируемое вещество содержится, например в функциональном слое 26, а антитело - в слое 27 примера, показанного на фиг.5. Воплощение нижнего примера, показанного на фиг. 11, также может осуществляться таким образом, что антитело содержится в функциональном слое 26, а меченое анализируемое вещество в слое 27 примера, показанного на фиг.5.

Из этого следует, что в видах анализов, показанных на фиг.11, либо анализируемое вещество, либо антитело могут быть иммобилизованы (ср. верхний и средний примеры фиг.11). Таким образом, способы, описанные для видов сэндвич-анализа, также могут быть использованы по меньшей мере частично. Так, родовое антитело (ср. нижний пример фиг.11) или белок A/G (после биотинилирования специфического антитела также авидин) могут быть иммобилизованы. В этом случае иммобилизованный биокомпонент служит исключительно для обогащения добавленного специфического антитела и может, таким образом, быть иммобилизован в избытке.

Дальнейшие виды анализа, имеющие прямо пропорциональную корреляцию между концентрацией анализируемого вещества и интенсивностью сигнала флуоресценции, будут описаны ниже.

Для этого существуют в основном две возможности, причем можно проводить соответствующий анализ с дополнительной твердой фазой или в растворе.

Например, все компоненты можно инкубировать в растворе. В виде анализа, показанного на фиг.12, предлагается преинкубация реагирующих веществ и образование равновесия связывания. Свободное анализируемое вещество конкурирует с меченым анализируемым веществом за связывание с антителом, причем это же тело иммобилизовано на подложке 3 в детекторной зоне и также содержится в растворе.

Иммобилизация может проводиться в виде сэндвич-анализа.

Так как определяется только свободное, то есть не связанное с антителом, меченое анализируемое вещество, то в результате имеет место прямо пропорциональная корреляция между концентрацией анализируемого вещества и сигналом флуоресценции.

Более того, иммобилизованный биокомпонент служит исключительно для обогащения коньюгата гаптен-флуорофор и может, таким образом, быть иммобилизован в избытке. Посредством иммобилизации специфического антитела соответствующая структура устройства по изобретению может использоваться, однако, только для соответственно одного анализируемого вещества.

Вид анализа, показанный на фиг. 12, может проводиться с помощью устройства, как оно показано на фиг.5, если меченое анализируемое вещество содержится в функциональном слое 26, а антитело в функциональном слое 27.

В случае, когда вместо меченого анализируемого вещества используется меченый аналог анализируемого вещества, который обладает определенно пониженной аффинностью к антителу, может проводиться анализ замещение. Это показано на фиг.13. Меченое анализируемое вещество или аналог анализируемого вещества может здесь содержаться, например в функциональном слое 28 примера, показанного на фиг.6.

Также может быть использована дополнительная твердая фаза, которая размещается либо в отдельном реакционном пространстве, либо в качестве функционального слоя непосредственно в детекторной зоне подложки 3.

Дополнительная твердая фаза может, в принципе, осуществлять те же функции, что и функциональные слои.

Применение отдельного реакционного пространства (например, инкубационной пробирки) такого, как контейнер для образца 10, который показан на фиг.3 и 4, имеет то преимущество, что могут быть использованы общие структуры, то есть структуры, используемые для всех анализируемых веществ.

На этой универсальной структуре иммобилизовано не специфическое, а родовое антитело или белок A/G, авидин (после биотинилирования антитела) среди прочего. Так как только один биокомпонент наверху подложки 3 обогащен, иммобилизованные компоненты могут быть нанесены в избытке.

Процедура может, в общем, быть такова, что один из иммунокомпонентов (меченое антитело или меченое анализируемое вещество) удерживается на твердой фазе, например функциональном слое, с помощью коньюгата гаптен-белок. Только в присутствии свободных анализируемых веществ существует часть меченых компонентов, не связанных с твердой фазой, и которые могут затем быть измерены над подложкой 3 в детекторной зоне. Эти детали представлены схематически в примере, показанном на фиг.14.

Здесь свободное анализируемое вещество и анализируемое вещество, иммобилизованное на твердой фазе, конкурируют за связывание со специфическим антителом, как показано на первой стадии фиг.14, сверху.

Твердая фаза минует только те антитела, которые до этого связались с анализируемым веществом, как представлено в нижней части фиг.14. Следовательно, только связанное с анализируемым веществом антитело может быть обнаружено, например с помощью родового антитела. Здесь также существует прямо пропорциональная корреляция между концентрацией анализируемого вещества и интенсивностью измеренной флуоресценции.

Если, в данном конкретном случае фиг.14, в качестве дополнительной твердой фазы используется мембрана, которая интегрирована в эту структуру, функциональный слой 26 (резервуар для меченого антитела) и твердая фаза в качестве слоя 27 примера, показанного на фиг.5, может быть использована в примере, показанном на фиг.14.

Различные материалы могут служить в качестве твердых фаз, и среди них мембраны могут быть особенно легко интегрированы как функциональные слои. Такие мембраны могут представлять собой нитроцеллюлозу, иммунодайн, коньюгат высвобождающие мембраны, регенерированную целлюлозу, среди прочего. В данном случае соответствующий биокомпонент может быть иммобилизован путем адсорбции, ковалентного связывания или аффинного связывания. Гаптены могут быть иммобилизованы как коньюгат гаптен-белок.

В противоположность мембранам с поперечным потоком, мембраны с боковым потоком и наполненные колонки дают преимущества благодаря повторному установлению равновесия и делают возможным количественное связывание биокомпонентов. Подходящими материалами для наполненных колонок являются: сефароза, пористая среда среди прочего.

Стенки возможно используемого сосуда, например стенки упомянутого контейнера для образца 10 или подводящих трубок, также могут служить в качестве твердой фазы, которая, соответственно, будет представлять собой полистирольные сосуды или стеклянные капилляры. Также твердой фазой могут служить частицы в суспензии, когда образец представляет собой суспензию с твердыми частицами (магнитные частицы, латекс среди прочего), Эти частицы могут быть отделены посредством применения магнитного поля или посредством последовательного фильтрования.

С помощью данного изобретения также возможно проводить так называемый вид анализа замещения, где в принципе возможны два варианта. Замещение может происходить на дополнительной твердой фазе в функциональном слое или снаружи, то есть не в интегрированном функциональном слое, или непосредственно на подложке 3 в детекторной зоне.

На фиг. 15 в принципе представлен пример анализа замещение с использованием дополнительной твердой фазы. Твердая фаза может представлять собой либо упомянутый контейнер для образца 10, либо подводящую трубку, либо функциональный слой. Меченое антитело или анализируемое вещество связано здесь посредством специфического лиганд/рецепторного взаимодействия. Вследствие добавления свободных анализируемых веществ можно достичь замещения биокомпонентов.

Твердая фаза может представлять собой, например функциональный слой 26 из примера согласно фиг.5.

В примере, представленном на фиг.15, меченое антитело связано с подложкой 3 в детекторной зоне посредством родового антиантитела (антитела против антитела), или белка A/G, авидина среди прочего.

Однако, если проводится противоположная процедура, и меченое анализируемое вещество связано с иммобилизованным антителом и затем замещено, в детекторной зоне на подложке 3 иммобилизовано специфическое антитело, направленное против анализируемого вещества. Поскольку в каждом случае всегда обнаруживают замещенный компонент, существует прямо пропорциональная корреляция между концентрацией соответствующего анализируемого вещества и интенсивностью сигнала флуоресценции.

Замещение можно, однако, проводить непосредственно в детекторной зоне на подложке, в качестве очень простой формы анализа, поскольку только один образец проводится через данный элемент.

Любые преинкубации и другие аналогичные стадии отсутствуют. Кондиционирования образца можно достичь вследствие встраивания соответствующих функциональных слоев. Здесь также присутствуют два различных возможных способа иммобилизации анализируемого вещества или специфического антитела, как показано на фиг.16.

Здесь соответственно измеряют уменьшение интенсивности сигнала флуоресценции так, что имеет место обратно пропорциональная корреляция между концентрацией анализируемого вещества и интенсивностью сигнала флуоресценции. Абсолютная величина нарастания интенсивности сигнала флуоресценции прямо пропорциональна концентрации анализируемого вещества и может быть оценена уже описанным способом.

Фиг. 17 служит в качестве общего ключа для различных видов анализа, представленных на фиг.9-16.