способ получения препарата коллагеназы

Формула изобретения

1. Способ получения препарата коллагеназы, включающий гомогенизацию гепатопанкреаса крабов, отделение экстракта центрифугированием, осаждение коллагеназы сульфатом аммония, повторное центрифугирование для отделения осадка коллагеназы, растворение последнего в ацетатно-аммиачном буфере и хроматографическую очистку раствора препарата, с последующей элюцией сорбированных ферментов, концентрированием, обессоливанием элюата и лиофильной сушкой препарата, отличающийся тем, что очистку препарата ведут методом аффинной хроматографии, при этом сорбцию коллагеназы осуществляют на аффинном сорбенте - макропористом кремнеземе, содержащем ковалентно связанный антибиотик - полимиксин М, элюцию ведут трисовым буфером с добавлением ацетата кальция, а концентрирование и обессоливание ведут ультрафильтрацией.

2. Способ получения препарата коллагеназы по п.1, отличающийся тем, что гомогенизацию проводят в ацетат-аммонийном буфере, содержащем ацетат кальция при рН 6,4-6,2.

3. Способ получения препарата коллагеназы по п.1, отличающийся тем, что осаждение ведут путем добавления сульфата аммония 60-70% насыщения.

4. Способ получения препарата коллагеназы по п.1, отличающийся тем, что сорбцию ведут в присутствии ацетат-аммонийного буфера.

5. Способ получения препарата коллагеназы по п.1, отличающийся тем, что элюцию ведут при рН 8,0-8,5.

6. Способ получения препарата коллагеназы по п.1, отличающийся тем, что ультрафильтрацию ведут на установке с мембраной, задерживающей белки с М.М. выше 10 КДа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных, высокоактивных ферментных препаратов, которые могут быть использованы в медицине, биохимии и пищевой промышленности, а также для исследовательских целей.

В настоящее время известны очищенные препараты коллагеназ, выпускаемые зарубежными фирмами, например Sigma, ICN. Эти ферментные препараты приготовлены из культуральной жидкости Clostridium hystoliticum, патогенного микроорганизма, являющегося возбудителем газовой гангрены. В связи с этим препараты дороги, их применение в пищевой и медицинской промышленности невозможно из-за опасности микробного заражения. В то же время гепатопанкреас крабов, особенно, камчатского краба, богат протеолитическими ферментами, в том числе и коллагеназами. Гепатопанкреас является доступным, дешевым и нетоксичным сырьем для получения ферментных препаратов.

Известен способ получения коллагеназы, предусматривающий гомогенизацию гепатопакреас промысловых крабов в забуференных водных растворах путем автолиза, проводимого при перемешивании в течение 2-8 час при температуре 0-30^oС, к полученному раствору добавляют раствор хитозана с рН 2,0-6,5 до достижения концентрации 0,01-0,4 мас.%. Полученные раствор после отделения нерастворимого материала подвергают последовательно ультрафильтрации на мембране, отсекающей примесные вещества с мол.м. 100 кДа и более, собирая проходящий через мембрану раствор, а затем на мембране, отсекающей вещества с мол.м. 30 кДа и менее, собирая фермент, не проходящий через мембрану. Раствор, содержащий ферментативную активность лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы 10800-11200 ед/мг белка. Липиды в препарате отсутствуют.

В известном способе удается отделить раствор от сопутствующих липидов и белков с мол. весом выше 100000 и ниже 30000, что приводит к более полному удалению примесных белков, а также изъять из процесса экологически грязные органические и неорганические соединения. Способ, при его небольших затратах материалов, технологического времени и сырья, практически лишен недостатков, за исключением хитозана, который может инъактивировать фермент (Патент РФ, 2039819, C 12 N 9/48, 20.07.95).

Известен также способ получения коллагеназы, предусматривающий использование в качестве исходного сырья замороженный гепатопанкреас камчатского краба Paralithodes camtshatica, из которого выделяют экстракцией комплекс ферментов, помещением его в раствор 0,1-1,0 М хлорида щелочного металла. Смесь выдерживают в течение 14-16 час, поддерживая температуру 19-21^oС, при соотношении сырья и хлорида щелочного металла 1:2,2-2,3, периодически перемешивая. Осадок отделяют последовательной фильтрацией через фильтры с размером пор 10 мм, 0,5 мм, и 0,1 мм. Отделение липидной фракции осуществляют микрофильтрацией на мембранах с размером пор 0,45 мкм, ультрафильтрацию проводят на мембранных фильтрах с лимитом пропускания 10000 Да.

Полученный концентрат лиофильно высушивают.

Коллагенолитическая активность полученного препарата составляет не менее 2000 ед. Мандл/мг, содержание белка в препарате - 97%.

Недостатком известного способа является длительность процесса как на стадии гомогенизации сырья, так и на стадии выделения коллагеназы, включающую последовательную фильтрацию, микрофильтрацию, ультрафильтрацию, что снижает выход продукта (Патент РФ 2096456, C 12 N 9/48, 20.11.97).

Кроме того, известен способ получения коллагеназы, включающий гомогенизацию гематопанкреаса крабов в солевом буферном растворе (2,0 М раствор хлористого натрия), фракционированием материала сульфатом аммония, отделение центрифугированием нерастворимых веществ и очистку с использованием гидрофобной хроматографии, причем сорбцию фермента на сорбент осуществляют при уравновешивании последнего буферным раствором соли в концентрации не менее 1,0 М, а элюцию фермента проводят при ступенчатом уменьшении концентрации буферного раствора соли до 0,025 М. Полученный элюат обессоливают диализом.

В качестве буферного раствора при сорбции продукта используют сульфат аммония, а при десорбции - бикарбонат аммония. Для удаления балластных белков и пигментов фракционирование материала сульфатом аммония осуществляют путем многократного его переосаждения указанным реагентом до 50% насыщения. В качестве сорбента используют поливинил пирралидоновые носители типа Fractogel или Toyperl.

Известный способ позволяет эффективно удалять примеси пигментов и белков, однако выход продукта составляет 22-24% и вследствие этого непригоден для условий масштабного производства (Патент РФ 2121503, С 12 N 9/48, 10.11.98).

Наиболее близким к заявляемому является способ получения препарата коллагеназы из гепатопанкреаса промысловых видов краба, включающий гомогенизацию его в 0,1 М ацетате аммония рН 6,4, содержащем 0,1-1,0 мМ ацетата кальция, отделение супернатанта центрифугированием и осаждение препарата сульфатом аммония 60-70% насыщения. Осадок, содержащий коллагеназу, отделяют центрифугированием, растворяют в 0,1 М ацетате аммония рН 5,2-6,4 с добавлением 0,1-1,0 мМ Са²⁺. Затем проводят ионообменную хроматографию на аминированных силикатных материалах при рН 5,2-6,4, коллагеназу элюируют буферным раствором, содержащим 1 М NaCl, в присутствии 15-25% изопропанола при рН 7,0-8,5. Для дополнительной очистки и концентрации фермента коллагеназу высаливают из элюирующего раствора, насыщая его сульфатом аммония до 60%. Слой, содержащий активную коллагеназу, отделяют, диализируют и лиофильно высушивают.

В качестве аминированных силикатных материалов используют аминосилохром, аминоаэросил, аминосиликагель.

Выход коллагеназы составляет 50%, очистка в 40 раз.

К недостаткам способа следует отнести невысокий выход и недостаточную очистку целевого продукта. Последнее особенно важно при медицинском применении препарата. Кроме того, применение анионообменной хроматографии приводит к потере ценных компонентов, изоэлектрическая точка которых выше 5. Обессоливание препарата коллагеназ диализом приводит к потере ферментов, т.к. коллагеназа за время диализа (2 суток) частично гидролизует диализные мешки. Длительное пребывание ферментов в дистиллированной воде с рН 5,6 приводит к частичной инактивации ряда протеолитических ферментов (Патент РФ 2008353, C 12 N 9/64, 28.02.94 г.).

Задачей изобретения является повышение выхода, удельной активности, чистоты препарата и сокращения времени проведения процесса.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения препарата коллагеназы, включающем гомогенизацию гепатопанкреаса крабов, отделение экстракта (супернатанта) центрифугированием, осаждение коллагеназы сульфатом аммония, повторное центрифугирование для отделения осадка коллагеназы, растворение последнего в ацетатно-аммиачном буфере и хроматографическую очистку раствора препарата с последующей элюцией сорбированных ферментов, концентрированием, обессоливанием элюата и лиофильной сушкой препарата, очистку препарата ведут методом аффинной хроматографии, при этом сорбцию коллагеназы осуществляют на аффинном сорбенте - макропористом кремнеземе, содержащем ковалентно связанный антибиотик - полимиксин М, элюцию ведут трисовым буфером с добавлением ацетата кальция, а концентрирование и обессоливание ведут ультрафильтрацией.

Гомогенизацию обычно проводят в ацетат-аммонийном буфере, содержащем ацетат кальция при рН 6,4-6,2, осаждение - путем добавления сульфата аммония 60-70% насыщения, сорбцию ведут в присутствии ацетат-аммонийного буфера, а элюцию - трисовым буфером с добавлением ацетата кальция при рН 8,0-8,5.

Предпочтительно ультрафильтрацию вести на установке с мембраной, задерживающей белки с М.М. выше 10 кДа.

Наиболее перспективным для избирательной очистки коллагеназы при ее получении является метод аффинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфическим аналогам субстрата или ингибиторам, ковалентно связанным с нерастворимым носителем, позволяющей разделять ферменты на основе их биологической специфичности, а поэтому достигать более высоких результатов при выделении ферментов.

Известно, что антибиотики-полипептиды, например бацитрацин и грамицидин С, успешно используемые в качестве лигандов аффинной хроматографии, не специфичны по отношению к протеиназам гепатопанкреаса камчатского краба. Для этих ферментов групповой специфичностью обладают аффинные сорбенты с антибиотиком полимиксином М в качестве лиганда. Полимиксин М представляет собой природный циклопептид. Характерные для циклопептидов особенности пространственной структуры и оригинальный набор природных и неприродных аминокислот способствуют узнаванию лиганда коллагеназами. При этом происходит избирательное связывание коллагеназы с нерастворимым носителем. Элюция коллагеназы 0,05 мМ трисовым буфером рН 8,0-8,5 является, в отличии от элюции солевым и спиртовыми растворами, очень мягкой и способствует полному сохранению активности ферментов.

Сущность способа заключается в следующем.

В качестве источника коллагеназы используют гепатопанкреас промысловых видов краба, который гомогенизируют в 0,1 мМ ацетате аммония рН 6,4, содержащем 0,1-1,0 мМ ацетата кальция, отделяют экстракт центрифугированием, добавляют сульфат аммония 60-70% насыщения. Осадок, содержащий коллагеназу, отделяют центрифугированием, растворяют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,0-6,5 с добавлением 0,1-1,0 мМ ацетата кальция.

В качестве хроматографического метода очистки используют аффинную хроматографию с использованием в качестве аффинного сорбента макропористого кремнезема, содержащего ковалентно присоединенный антибиотик - полимиксин М.

Сорбцию ферментов проводят в динамической или статическом режиме. При этом происходит избирательное связывание коллагеназ с нерастворимым носителем. Затем носитель со связанным белком промывают соответствующим буферным раствором. При этом происходит отделение примесей в том числе и окрашенных.

Носитель со связанным белком промывают тем же ацетатаммонийным буфером рН 6,0-6,5, а десорбцию проводят 0,05 М трисовым буфером рН 8,0-8,5 с 1 мМ ацетата кальция. Для концентрации и обессоливания элюат подвергают ультрафильтрации на установке с мембраной, задерживающей белки с молекулярной массой выше 10 кДа. Элюат концентрируют и промывают 10-кратным объемом дистиллированной воды и затем лиофильно высушивают.

Очищенный фермент можно использовать в случае необходимости в виде раствора, но в основном высушивают лиофильно после обессоливания ультрафильтрацией.

В результате получают очищенный ферментный препарат коллагеназы, обладающий коллагенолитической активностью, определяемую известными методами. Выход по активности 75-100%. Удельная активность коллагеназы повышается в 2-3 раза и составляет 0,6-0,9 ед/А₂₈₀.

Пример 1.

20 г гепатопанкреаса крабов предварительно гомогенизируют и экстрагируют фермент буфером рН 6,4 (0,1 М ацетата аммония), затем осадок отделяют центрифугированием при частоте вращения 10000 об/мин, к супернатанту добавляют сульфат аммония 60% насыщения и через 20 часов снова центрифугируют при тех же условиях. Полученный осадок растворяют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,1-6,4 и наносят на колонку (15 см) с полимиксин-силохромом, уравновешенным тем же буфером. Элюцию активных ферментов проводят 0,05 М трисовым буфером рН 8,0.

Элюат подвергают ультрафильтрации на мембране YM 10 Millipor, концентрируют до небольшого объема (не более 2 мл), промывают 10-кратным количеством дистиллированной воды, высушивают лиофильно.

Выход по активности 100%, очистка в 120 раз, удельная активность 0,6 ед/А₂₈₀.

Пример 2.

Процесс экстракции и осаждения белков сульфатом аммония производится аналогично примеру 1.

Раствор сульфат-пасты, полученной из 20 г гепатопанкреаса краба добавляют к 3 г. полимиксин-силохрома, уравновешенного 0,1 М ацетатом аммония рН 6,1, осторожно перемешивают 20 мин, раствор декантируют, сорбент промывают тем же буфером. Элюцию проводят добавлением 3-кратного количества 0,05 М трисового буфера рН 8,5. Элюат подвергают ультрафильтрации. Концентрируют, промывают, высушивают лиофильно.

Выход по активности 75%, удельная активность 0,6 ед/A₂₈₀, очистка в 60 раз.

Предлагаемый способ является более экономичным за счет применения аффинного сорбента. Метод аффинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфическим аналогам субстрата или ингибиторам, ковалентно связанным с нерастворимым носителем, позволяет выделять ферменты на основе их биологической специфичности, исключать потери в процессе выделения ценных ферментов, а поэтому достигать более высокой степени очистки по сравнению с ионообменной и другими видами хроматографической техники. Применение трисового буфера без добавления высоких концентраций соли и спирта полностью сохраняет активность коллагенолитических ферментов.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить до 75-100% выход целевого продукта, повысить удельную активность в 2-3 раза, сократить время процесса и потери фермента за счет замены диализа в диализных мешках диализом с помощью ультрафильтрации. Обессоливание элюата методом ультрафильтрации вместо диализа значительно сокращает время процесса обессоливания, сохраняет активность фермента, а также приводит к получению концентрированных растворов, время высушивания которых также сокращается.