способ выявления антигена вируса бешенства в формалинизированных пробах головного мозга животных

Формула изобретения

Способ выявления антигена вируса бешенства в формалинизированных пробах головного мозга животных путем постановки реакции иммуфлюоресценции с испытуемым антигеном, включающий приготовление суспензии антигенного материала из формалинизированной пробы, отмывание антигенного материала от формалина, трипсинизацию антигенного материала, отмывание антигенного материала от трипсина, получение препарата специфического комплекса "антиген-антитело", отмывание препарата специфического комплекса "антиген-антитело" от непрореагировавших компонентов, исследование препарата специфического комплекса "антиген-антитело" под люминесцентным микроскопом и учет результатов реакции, отличающийся тем, что препарат специфического комплекса "антиген-антитело" получают в жидкой фазе путем соединения суспензии антигенного материала с антителами флюоресцирующего глобулина и после отмывания от непрореагировавших компонентов наносят на твердую подложку.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано для диагностики бешенства животных, а также для дифференциальной диагностики бешенства и губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота ("коровьего бешенства").

Бешенство животных относится к заболеваниям, неизбежно приводящим к гибели и, безусловно, является одной из самых опасных болезней, передаваемых человеку от животных. Поэтому борьба с ним представляется не только экономической, но и социальной проблемой, успешное решение которой в значительной мере зависит от используемых методов лабораторной диагностики этого заболевания.

Выявление антигена вируса бешенства в пробах патматериала проводят с помощью гистологического и иммуногистохимического методов. Выполнение этих методов предполагает использование стандартной гистологической процедуры, включающей пропитку блоков тканей головного мозга парафином, приготовление гистосрезов и их дальнейшую обработку. Такие методы позволяют лучше интепретировать анатомическую локализацию вирусного антигена и полезны в изучении патологических процессов, протекающих при бешенстве (1, 2, 3).

Недостатками этих методов является то, что они довольно трудоемки, требуют много времени и использования специального оборудования, дорогостоящих материалов и реактивов, в том числе довольно токсичных. Указанные недостатки делают невозможным широкомасштабное применение этих методов.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ выявления антигена вируса бешенства в формалинизированных пробах головного мозга животных путем постановки прямого твердофазного варианта реакции иммунофлюоресценции (ПТ РИФ) с испытуемым антигеном, включающий подготовку из формалинизированного патматериала суспензии, содержащей антиген, отмывание антигенного материала от формалина и его трипсинизацию, отмывание антигенного материала от трипсина и нанесение его на твердую подложку (предметное стекло), фиксацию полученного препарата в ацетоне, отмывание фиксированного препарата от ацетона, получение специфического комплекса "антиген-антитело" на твердой подложке путем соединения фиксированного антигенного препарата с антителами флюоресцирующего глобулина (ФИТЦ-глобулина), отмывание полученного комплекса от непрореагировавших компонентов, исследование препарата под люминесцентным микроскопом и учет результатов реакции (4).

Недостатками способа-прототипа является низкая чувствительность, длительность выполнения, необходимость использования токсических веществ и высокая себестоимость анализа.

Чувствительность способа-прототипа существенно снижается с увеличением срока хранения формалинизированных проб головного мозга. Так при консервировании проб в 10% растворе формалина 100% чувствительность отмечается только на 2 сутки, далее она постепенно снижается и к 20 суткам становиться равной не более 90%. Кроме того, в результате фиксации препаратов пробы в ацетоне при 20°С в течение 45-60 минут часть препаратов отслаивается во время отмывания, а интенсивность флюоресценции заметно снижается с увеличением срока хранения проб патматериала в формалине (5). Эти недостатки существенно затрудняют проведение исследований.

В задачу создания изобретения входила разработка способа выявления антигена вируса бешенства в формалинизированных пробах головного мозга животных путем постановки реакции иммунофлюоресценции (РИФ) с испытуемым антигеном, обеспечивающего повышение чувствительности, снижение затрат времени и себестоимости анализа, уменьшение опасности за счет исключения применения токсических веществ.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении чувствительности, уменьшении затрат времени, уменьшения опасности за счет исключения применения токсических веществ и снижении себестоимости анализа.

Указанный технический результат достигается созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:

1. Способ выявления антигена вируса бешенства в формалинизированных пробах головного мозга животных путем постановки прямого жидкофазного варианта реакции иммунофлюоресценции (ПЖ РИФ) с испытуемым антигеном.

2. Приготовление суспензии антигенного материала из формалинизированной пробы.

3. Отмывание антигенного материала от формалина.

3.1. Центрифугирование суспензии антигенного материала при 1000 g в течение 5 минут.

3.2. Удаление надосадочной жидкости.

3.3. Получение осадка антигенного материала. 4. Трипсинизация антигенного материала.

4.1. Ресуспендирование осадка антигенного материала в растворе, содержащем 5 см³ 0,25% раствора трипсина с 0,3% цитрата натрия и 0,6% хлорида натрия.

4.2. Инкубирование антигенного материал в трипсинсодержащем растворе при температуре 37°С в течение 30 минут и рН 7,8.

5. Отмывание антигенного материала от трипсина.

5.1. Центрифугирование суспензии антигенного материала при 1000 g в течение 5 минут.

5.2. Удаление надосадочной жидкости.

5.3. Получение осадка антигенного материала.

5.4. Ресуспендирование осадка антигенного материала в 5 см³ забуференного физиологического раствора (ЗБФР).

5.5. Центрифугирование суспензии антигенного материала при 1000 g в течение 5 минут.

5.6. Удаление надосадочной жидкости.

5.7. Получение осадка антигенного материала.

6. Получение препарата специфического комплекса "антиген-антитело" в жидкой фазе путем соединения суспензии антигенного материала с антителами ФИТЦ-глобулина.

6.1. Ресуспендирование осадка антигенного материала в 0,5 см³ ЗБФР.

6.2. Смешивание 0,1 см³ суспензии антигенного материала с 0,1 см ³ ФИТЦ-глобулина.

6.3. Инкубирование смеси при 37°С в течение 10 минут.

7. Отмывание препарата специфического комплекса "антиген-антитело" от непрореагировавших компонентов.

7.1. Ресуспендирование специфического комплекса в 3 см³ ЗБФР.

7.2. Центрифугирование специфического комплекса при 1000 g в течение 5 минут.

7.3. Удаление надосадочной жидкости.

7.4. Получение осадка специфического комплекса.

7.5. Ресуспендирование специфического комплекса в 3 см ³ ЗБФР.

7.6. Центрифугирование суспензии специфического комплекса при 1000 g в течение 5 минут.

7.7. Удаление надосадочной жидкости.

7.8. Получение осадка специфического комплекса.

7.9. Ресуспендирование осадка специфического комплекса в 3 см³ дистиллированной воды.

7.10. Центрифугирование суспензии специфического комплекса при 1000 g в течение 5 минут.

7.11. Удаление надосадочной жидкости.

7.12. Получение осадка специфического комплекса.

8. Нанесение препарата специфического комплекса на твердую подложку (предметное стекло).

8.1. Ресуспендирование осадка специфического комплекса в 0,05-0,1 см³ дистиллированной воды.

8.2. Нанесение водной суспензии специфического комплекса на предметное стекло.

8.3. Высушивание препарата специфического комплекса при комнатной температуре.

9. Исследование препарата специфического комплекса под люминесцентным микроскопом.

10. Учет результатов реакции.

10.1. Наличие вируса бешенства в препарате регистрируют по специфической флюоресценции в виде ярких зеленоватых включений в поле зрения микроскопа.

10.2. Отсутствие вируса бешенства в препарате определяют по равномерно светящемуся фону без ярких включений.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана.

1. Способ выявления антигена вируса бешенства в формалинизированных пробах головного мозга животных путем постановки ПЖ РИФ с испытуемым антигеном.

2. Приготовление суспензии антигенного материала из формалинизированной пробы.

3. Отмывание антигенного материала от формалина.

4. Трипсинизация антигенного материала.

5. Отмывание антигенного материала от трипсина.

6. Получение препарата специфического комплекса "антиген-антитело" в жидкофазной фазе путем соединения суспензии антигенного материала с антителами ФИТЦ-глобулина.

7. Отмывание препарата специфического комплекса "антиген-антитело" от непрореагировавших компонентов.

8. Нанесение препарата специфического комплекса на твердую подложку (предметное стекло).

9. Исследование препарата специфического комплекса под люминесцентным микроскопом.

10. Учет результатов реакции.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Способ выявления антигена вируса бешенства в формалинизированных пробах головного мозга животных путем постановки РИФ с испытуемым антигеном.

2. Приготовление суспензии антигенного материала из формалинизированной пробы.

3. Отмывание антигенного материала от формалина.

4. Трипсинизация антигенного материала.

5. Отмывание антигенного материала от трипсина.

6. Получение препарата специфического комплекса "антиген-антитело".

7. Отмывание препарата специфического комплекса "антиген-антитело" от непрореагировавших компонентов.

8. Исследования препарата специфического комплекса "антиген-антитело" под люминесцентным микроскопом.

9. Учет результатов реакции.

По сравнению со способом-прототипом существенными отличительными признаками предлагаемого способа являются:

1. Препарат специфического комплекса "антиген-антитело" получают в жидкой фазе путем соединения суспензии антигенного материала с антителами ФИТЦ-глобулина.

2. Препарат специфического комплекса "антиген-антитело" наносят на твердую подложку (предметное стекло) после отмывания от непрореагировавших компонентов.

Предлагаемый способ обеспечивает повышение чувствительности, снижение затрат времени и себестоимости анализа, уменьшения опасности за счет исключения применения токсических веществ.

Достижение технического результата от использования предлагаемого способа объясняется тем, что получение препарата специфического комплекса "антиген-антитело" проводят в жидкой фазе и на твердую подложку (предметное стекло) наносят полученный препарат специфического комплекса после его отмывания от непрореагировавших компонентов, при этом исключается стадия фиксации препарата в ацетоне.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источников, характеризующихся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого способа, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого способа условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания предлагаемого изобретения (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого способа преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения иллюстрируется примером его исполнения и использования, который не ограничивает объема изобретения.

Пример.

От павших или убитых животных, инфицированных вирусом бешенства в естественных и лабораторных условиях, вырезают ножницами или скальпелем кусочки коры мозга больших полушарий, аммонова рога, мозжечка и продолговатого мозга общей массой 2-3 г. Пробы антигенного материала помещают в 10% раствор формалина. В течение 90 суток их исследуют в РИФ предлагаемым способом и способом-прототипом.

Для выполнения предлагаемого способа на подготовительном этапе проводят отмывание антигенного материала от формалина. Для этого кусочки коры больших полушарий, аммонова рога, мозжечка и продолговатого мозга массой 1-2 г растирают в ступке с 5 см³ 0,01 М забуференного раствора (ЗБФР), рН 7,4. Полученную суспензию антигенного материала центрифугируют при 1000 g в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляют, а полученный в осадке антигенный материал подвергают трипсинизации. Для этого осадок ресуспендируют в 5 см³ раствора, содержащего 0,25% раствор трипсина с 0,3% цитрата натрия и 0,6% хлорида натрия, рН 7,8. Полученную суспензию антигенного материала инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 минут. По окончании трипсинизации суспензию антигенного материала подвергают отмыванию от трипсина. Для этого суспензию антигенного материала центрифугируют при 1000 g в течение 5 минут, надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 5 см³ ЗБФР и процесс отмывания антигенного материала повторяют в том же порядке и режиме.

Отмытый от трипсина антигенный материал используют для получения специфического комплекса "антиген-антитело" в жидкой фазе путем соединения суспензии антигенного материала с антителами ФИТЦ-глобулина. Для этого отмытый от трипсина осадок антигенного материала ресуспендируют в 0,5 см³ ЗБФР.

Полученную суспензию в объеме 0,1 см³ переносят в другую центрифужную пробирку, добавляют в нее 0,1 см³ ФИТЦ-глобулина, смесь перемешивают путем пипетирования и инкубируют 10 минут при 37°С.

По окончании инкубирования полученный специфический комплекс "антиген-антитело" отмывают от непрореагировавших компонентов.

Для этого в пробирку добавляют 3 см³ ЗБФР, дают смеси отстояться 5 минут, а затем содержимое пробирки центрифугируют при 1000 g в течение 5 минут, супернатант удаляют. Операцию отмывания осадка специфического комплекса с помощью ЗБФР повторяют.

Затем осадок специфического комплекса отмывают в том же порядке и режиме дистиллированной водой. Отмытый осадок используют для приготовления препарата специфического комплекса "антиген-антитело" на твердой подложке (предметном стекле). Для этого осадок специфического комплекса ресуспендируют в 0,05-0,1 см³ дистиллированной воды. Водную суспензию специфического компонента наносят на твердую подложку (предметное стекло), равномерно распределяя препарат на 1/3 поверхности подложки. Полученный препарат высушивают в горизонтальном положении при комнатной температуре. Затем его исследуют под люминесцентным микроскопом в иммерсионной системе. Специфическую флюоресценцию регистрируют в виде ярких зеленоватых включений в нейронах, их отростках, а также за пределами нейронов.

За отрицательный результат принимают равномерно светящийся зеленоватый фон без ярких включений.

Результаты исследований с использованием патологического материала, полученного от мышей, зараженных бешенством в лабораторных условиях, а также патматериала от больных бешенством животных, представлены в таблицах 1, 2, 3 и 4.

Приведенные в таблице 1 данные показывают, что при использовании ПЖ РИФ интенсивность флюоресценции практически не изменялась в течении 60 суток, тогда как в ПТ РИФ она снижалась уже на 10 сутки.

Сравнение чувствительности изучаемых вариантов РИФ при выявлении антигена вируса бешенства в консервированных 10% формалином образцах представлено в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, ПТ РИФ показал 100% чувствительность только в течение 5 и 10 суток после консервирования, тогда как при использовании предлагаемого способа 100% чувствительность сохранялась в течение 60 суток.

Результаты исследования в ПТ РИФ и ПЖ РИФ патматериала, полученного от животных, заболевших бешенством в естественных условиях, представлены в таблице 3. Результаты показывают, что при использовании ПТ РИФ интенсивность флюоресценции начинает снижаться уже на 10 сутки консервирования, а на 30 сутки появляются ложноотрицательные результаты. При использовании ПЖ РИФ интенсивность флюоресценции остается стабильной в течение 60-90 суток консервирования. Сравнение чувствительности ПТ РИФ и ПЖ РИФ в зависимости от сроков консервирования патматериала в формалине представлены в таблице 4.

Результаты таблицы 4 свидетельствуют, что ПТ РИФ показал 100% чувствительность в течение 5 и 10 суток после консервирования, затем она начала резко снижаться. При использовании ПЖ РИФ 100% чувствительность сохранялась в течение всего срока наблюдения (90 суток).

Как уже отмечалось, данный способ имеет более высокую чувствительность и на его выполнение требуется меньше времени. Расчет затрат времени на проведение исследования одной пробы консервированного формалином головного мозга в ПТ РИФ и ПЖ РИФ представлен в таблице 5. Из таблицы 5 видно, что затраты времени на реализацию ПЖ РИФ примерно в 2 раза меньше, чем при использовании ПТ РИФ. Кроме того, в ПТ РИФ фиксация препаратов в ацетоне в течение 60 минут оказалась недостаточной и приводила к их отслаиванию во время промывки. Поэтому фиксацию приходилось поводить в течение 6-8 часов, что значительно увеличивало затраты времени, указанные в таблице 5.

В результате проведенных экспериментов установлено, что при исследовании консервированных 10% раствором формалина проб головного мозга мышей, при консервировании в течение 5-60 суток, чувствительность ПЖ РИФ составляла 100%, при консервировании в течение 90 суток - 80%. При исследовании патматериала от животных, больных бешенством в естественных условиях, 100%-ная чувствительность ПЖ РИФ сохранялась в течение 90 суток консервирования, тогда как с помощью ПТ РИФ спустя 90 суток консервирования диагноз на бешенство поставить не удавалось. Для исследования в ПТ РИФ 1 пробы необходимо затратить 29,6 руб., а в предлагаемом ПЖ РИФ в 1,6 раза меньше (18,6 руб). Кроме того, при реализации ПЖ РИФ значительно сокращается расход рабочего времени (см. таблицу 5) и исключается использование такого токсичного вещества, как ацетон.

Таким образом, приведенная информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- способ выявления антигена вируса бешенства в формалинизированных пробах головного мозга животных, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования ветеринарными вирусологами для диагностики бешенства животных, а также для дифференциальной диагностики бешенства и губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- при использовании предлагаемого способа достигается технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения.

Источники информации

1. Palmer D.G., Ossent P., Suter M.M. and al. Demonstration of rabies viral antigen in paraffin tissue sections: Comparison of immunofluorescence technique with the unlabeled antibody enzyme method. Am.J.Vet.Res., 1985, V.46, N1, 283-286.

2. Zimmer К., Wiegand D., Manz D. and al. Evaluation of five different methods for routine diagnosis of rabies. J.Vet.Med.-Berlin, 1990, V.37, N5, 392-400.

3. Sinchisri Т., Nagata Т., Yoshikawa Y. and al. Immunohistochemical and histopathology study of experimental rabies in mice. J.Vet.Med.Sci., 1992, V.54, N3, 409-416.

4. Barnard B.J.H., Voges S.F. A simple technique for the rapid diagnosis of rabies in formalin-preserved brain. Onderstepoort J.Vet.Res., 1982. RSA, V.49, N4, 193-194 (прототип).

5. Meslin F.-X., Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies. Geneva: WHO, 1996, 477 р.