медицинская повязка, содержащая комплекс протеолитических ферментов, включая коллагенолитические протеазы, из гепатопанкреаса краба

Формула изобретения

1. Раневое покрытие, состоящее из основы, содержащей комплекс протеолитических ферментов из гепатопанкреаса краба, обладающих коллагенолитической активностью, отличающееся тем, что в качестве основы выбрана целлюлоза, модифицированная химическим путем.

2. Раневое покрытие по п.1, отличающееся тем, что в качестве химически модифицированной целлюлозы выбрана частично окисленная целлюлоза, содержащая альдегидные группы.

3. Раневое покрытие по п.1, отличающееся тем, что в качестве химически модифицированной целлюлозы выбрана химически модифицированная марля, содержащая остатки фосфорной кислоты.

4. Способ получения раневого покрытия по любому из пп.1-3, включающий взаимодействие целлюлозы, модифицированной химическим путем, с коллагенолитическими ферментами в водном буферном растворе, отличающийся тем, что в качестве названных ферментов используют комплекс ферментов из гепатопанкреаса краба, реакцию ведут при рН 6,0-8,5, температуре 15-25°С в течение 1-3 ч при начальной концентрации комплекса 0,4-1,5 мг/мл и модуле ванны 5-10.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, конкретно к медицинским повязкам, содержащим ферменты, в частности обладающих коллагенолитическим действием.

Медицинские повязки, содержащие ферменты, широко известны. Можно сослаться, например, на заявку Великобритании №2240040, речь в которой идет о медицинской повязке из частично окисленного целлюлозосодержащего материала в форме марли, к которому за счет образования химических связей присоединены ферменты, обладающие протеолитической, коллагенолитической и/или бактериолитической активностью.

В патенте Российской Федерации №2127128 описан способ получения раневого покрытия, который заключается в смешении раствора коллагена с комплексом протеолитических ферментов, выделяемых из гепатопанкреаса камчатского краба и обладающих коллагенолитической активностью, с последующим структурированием, в ряде случаев, в парах формальдегида. К недостаткам способа можно отнести то обстоятельство, что смешение фермента с его субстратом (т.е. коллагенолитик с коллагеном) вынуждает очень строго контролировать рН и температуру; кроме того, формальдегид, следы которого неизбежно присутствуют в покрытии, обладает канцерогенным действием в отношении слизистых оболочек (носа и, возможно, раны).

Целью изобретения является создание раневого покрытия, лишенного перечисленных выше недостатков и сохраняющего высокую терапевтическую активность.

Поставленная цель достигнута благодаря тому, что в раневом покрытии, состоящем из основы, содержащей комплекс протеолитических ферментов из гепатопанкреаса краба, обладающих коллагенолитической активностью, в качестве основы выбрана целлюлоза, модифицированная химическим путем.

Заявлен также способ получения такой повязки, включающий следующие этапы:

- частичное окисление целлюлозы в виде медицинской марли до содержания альдегидных групп 0,13÷0,25 мМоль/г;

- приготовление раствора ферментов гепатопанкреаса концентрации 0,4÷1,5 мг/мл;

- введение полученного раствора ферментов при модуле ванны 5-10 во взаимодействие с частично окисленной целлюлозой в течение 1-3 часов при температуре 15÷25°С и рН 6,8÷8,5;

- отделение модифицированным белком материала, промывка буферным раствором для удаления физически адсорбированных белка и сушка до постоянной массы или, альтернативно, взаимодействие раствора ферментов, полученного выше, с фосфорным эфиром целлюлозы, в указанных выше условиях.

Коллагеназы, т.е. ферменты, способные при физиологических условиях расщеплять молекулы нативного коллагена, хорошо известны и широко используются. Сказанное в особенности касается микробных коллагеназы из Clostridium his. ("Biochemistry", 1984, vol.23, р.3085-3091) и коллагеназы из тканей млекопитающих (Extracellular Matrix Biochemistry, N.Y., Elsevier Publishers, 1984). Сравнительно недавно были открыты коллагенолитические протеиназы из краба Uca pugilator (Biochemistry, 1973, vol.12, р.1814-1822), камчатского краба Paralithodes camchatica (Biochem. Biophys. Res. Communs., 1990, vol.166, No 3, p.1411-1420) и краба-стригуна Chionoecetes opilio ("Доклады Акад. Наук СССР", 1991, том 317, №2, стр.482-484).

Отмечается, что коллагенолитические ферменты различного происхождения значительно отличаются друг от друга по субстратной специфичности, причем коллагенолитические протеазы принадлежат к суперсемейству трипсинов.

Для выделения коллагенолитических протеаз гепатопанкреас краба экстрагировали водными буферными растворами, содержавшими NaCl и Са²⁺-ион, с последующими ультра- и микрофильтрацией и гель-фильтрацией на колонке с Sephadex G-50 и получением смеси 9 белков, имеющих молекулярную массу от 23 до 36 кДа и проявляющих коллагенолитическую активность. Для ферментов из гепатопанкреаса краба характерна широкая специфичность: они способны гидролизовать как нативный коллаген и эластин, так и стандартные белковые субстраты (желатин, казеин) в широком диапазоне температур (4-40°С) и рН (4,5-10,5).

Благодаря тому, что выделенные белки действуют "ансамблем", появляется возможность их совместного применения для лечения ран с различной и изменяющейся раневой средой.

Для иммобилизации нами был использован раствор протеолитического комплекса с рН от 6,0 до 8,5, т.к. использование растворов, имеющих рН ниже 6,0 и выше 8,5, приводит к полной и необратимой инактивации комплекса в процессе иммобилизации, высушивания и хранения иммобилизованного препарата; увеличение времени иммобилизации выше 3-х часов не ведет к иммобилизации дополнительного количества активного белка, а при иммобилизации менее 0,5 часа основная масса активного комплекса остается в растворе, что ведет к технологическим потерям; при использовании при иммобилизации раствора комплекса с концентрацией менее 0,4 мг/мл образующийся материал имеет ферментативную активность меньше требуемого лечебного значения, особенно в конце срока хранения препарата, а при увеличении концентрации комплекса в растворе для иммобилизации более 1,5 мг/мл большая часть препарата остается в растворе, что ведет к значительному перерасходу ферментного препарата; проведение процесса при температуре выше 25°С ведет к инактивации ферментного комплекса, а понижение температуры ниже 15°С требует дополнительных энергозатрат.

Изобретение детально поясняется следующими примерами своего практического осуществления.

ПРИМЕР 1. Готовят 1 л раствора комплекса гепатопанкреаса краба (производство ЗАО " Биопрогресс" п.Биокомбинат, Моск. обл.), содержащего 1,0 г вещества, которым заливают 100 г марли, частично окисленной периодатионом до содержания альдегидных групп 0,18 мМоль/г. Через 2 часа материал отжимают от избытка раствора и сушат с получением готового продукта, имеющего следующие характеристики:

- протеолитическая активность по казеину 0,5 ПЕ/г (метод Кунитца);

- триптическая активность по гидролизу этилового эфира бензоиларгинина паранитроанилида 0,50 мкМоль/г;

- химотриптическая активность по гидролизу этилового эфира ацетилтирозина 0,08 мкМ/г;

- активность в отношении гидролиза коллагена 30 ЕД/г (по методу Мандейла).

ПРИМЕР 2. В 1 л 1/15 М фосфатно-калий-натриевого буфера (рН 7,8) растворяют 1,0 г комплекса из гепатопанкреаса краба, которым заливают 100 г фосфорнокислого эфира целлюлозы (2,2 мг-экв/г фосфатных групп); через 3 часа продукт отжимают на вальцах и сушат. Полученный продукт обладает следующими характеристиками:

- протеолитическая активность по казеину 0,62 ЕД/г;

- триптическая активность по гидролизу этилового эфира бензоиларгинина паранитроанилида 0,65 мкМоль/г;

- химотриптическая активность по гидролизу этилового эфира ацетилтирозина 0,10 мкМоль/г;

- активность в отношении гидролиза коллагена 35 ЕД/г (по методу Мандейла).

ПРИМЕР 3. Из материала, полученного согласно примеру 1, нарезаны салфетки размером 7×10 см, которые были использованы в экспериментальных условиях для лечения гнойных ран. Результаты лечения (на 40 больных) отражены в таблице, в которой для сравнения приведены данные по лечению ран традиционным способом.

Таблица 1.
Время наступления заживления, дни.
№п/п	Изучаемые образцы	Очищение ран	Заживление ран
1.	Традиционные методы лечения	13,2±0,7	24,5±0,7
2.	Салфетки по примеру 3	2,7±0,2	13,2±0,1