способ исследования рельефа поверхности гистологических препаратов

Формула изобретения

1. Способ исследования рельефа поверхности гистологических препаратов микроскопами плоского поля, отличающийся тем, что поверхности препарата придают светоотражательную способность путем импрегнации серебра, а микроскопию препарата осуществляют в отраженном свете при одностороннем падающем тенеобразующем освещении, причем импрегнацию серебра осуществляют выдерживанием препарата в 10%-ном растворе азотно-кислого серебра в течение 10 мин и последующим восстановлением его 1%-ным раствором аскорбиновой кислоты в течение 1 мин.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что устанавливают угол падения светового луча на поверхность препарата 75-85° относительно оси объектива.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в процессе исследования меняют азимут светового луча поворотом предметного столика микроскопа на ±180° относительно южного нулевого азимута.

Описание изобретения к патенту

Способ относится к биологии и медицине, а именно к методам гистологических исследований оболочек с естественной поверхностью, таких как брюшина, плевра, синовиальная мембрана с помощью светооптических микроскопов.

Известен способ изучения поверхности биологических объектов светооптическими бинарными стереомикроскопами с объективами 0,6-4 кратного увеличения. Они дают небольшие увеличения на макромикроскопическом дотканевом уровне исследований.

Традиционная микроскопия гистологических препаратов на тканевом уровне исследований осуществляется микроскопами плоского поля (современная классификация традиционных биолого-медицинских микроскопов - Егоров О.В. С микроскопом на "ты". СПб., 2000, с.42) при освещении на просвет. При этом изучаются контуры и внутреннее строение селективно окрашенных деталей в толще просвечиваемого препарата. Однако, микроскопия на просвет не дает картину поверхности препарата. Имеет место очевидное методологическое противоречие в самой идеологии микроскопии поверхности различных структур на просвет. То есть невозможно изучать на просвет форму поверхности препарата, представляющую собой некую границу раздела сред.

Для изучения рельефа поверхности объекта необходимо визуализировать структурные формы этой поверхности в объемном изображении. Для получения объемного изображения рельефа поверхности гистологических препаратов на тканевом уровне исследований с помощью светооптических микроскопов необходимо создание двух условий:

1. Освещение поверхности гистологического препарата со стороны наблюдателя - объектива.

2. Придание поверхности гистологического препарата светоотражательной способности.

Задачей изобретения является повышение качества исследования рельефа поверхности естественных оболочек за счет визуализации объемного изображения их поверхности на тканевом уровне.

Поставленная задача достигается способом исследования рельефа поверхности гистологических препаратов микроскопами плоского поля, в котором в отличие от прототипа поверхности препарата придают светоотражательную способность путем импрегнации серебра, а микроскопию проводят в отраженном свете при одностороннем падающем тенеобразующем освещении. При этом импрегнацию серебра осуществляют выдерживанием препарата в 10% растворе азотнокислого серебра в течение 10 минут и последующим восстановлением его в металлическое состояние 1% раствором аскорбиновой кислоты в течение 1 минуты.

Целесообразно устанавливать угол падения светового луча на поверхность препарата 75-85° относительно оси объектива, и в процессе исследования менять азимут светового луча поворотом предметного столика микроскопа на ±180° относительно южного нулевого азимута.

Для микроскопии гистологических препаратов в отраженном свете исследуемая поверхность препарата должна обладать светоотражательной способностью. Хорошей светоотражательной способностью обладают металлы, а наилучшей среди них - серебро, коэффициент светоотражения которого достигает 95% (Оленин С.С., Фадеев Г.Н. Неорганическая химия. М., 1979).

Общеизвестны способы напыления металлов на поверхность биологических тканей. Эти способы неоправданно высокозатратны и трудоемки для исследования больших площадей на световом уровне микроскопии.

Известна "реакции серебряного зеркала" - добавление к аммиачному раствору азотнокислого серебра нескольких капель формальдегида или раствора глюкозы приводит к восстановлению ионов серебра в растворе в металлическое серебро (Глинка Н.Л. Общая химия. Л., 1977. - С.579). В морфологии общеприняты способы импрегнации - внедрения серебра в ткани в виде растворов аммиачных солей с последующим восстановлением его на отдельных структурах растворами формалина или глюкозы (Ромейс Б. Микроскопическая техника. М., 1954)

Однако все известные способы импрегнации гистологических препаратов серебром, разработанные для светооптической микроскопии на просвет, использующие высокую светопоглощающую способность восстановленного серебра и промежуточных продуктов его восстановления, непригодны для микроскопии в отраженном свете рельефа поверхности препарата.

Во-первых, восстановление серебра проводится только на отдельных структурах, а фоновый остаток его из матрикса отмывается, то есть промежуточное вещество, участвующее в формировании поверхности препарата не визуализируется.

Во-вторых, восстановление серебра не доводится до металлического состояния, останавливаясь на промежуточных этапах реакции его восстановления до желто-коричневого цвета препарата - цвета не отражающих свет окислов серебра.

В третьих, эти способы импрегнации включают межэтапное отмывание серебра с поверхности препарата (проводка препаратов через несколько порций дистиллированной воды как после этапа сенсибилизации азотнокислым серебром, так и после этапа экспозиции в аммиачном растворе серебра). Тем самым исключается осаждение серебра на поверхности препарата и снижается импрегнация поверхностно лежащих его структур. В противном случае препарат становится непрозрачным и непригодным для микроскопии на просвет из-за осаждения серебра на поверхности препарата с обеих его сторон и переимпрегнации поверхностных его структур за время диффундирования растворов в глубину препарата. Особенно сказанное относится к импрегнации сравнительно большой толщины пленочных препаратов биологических оболочек, когда межэтапное отмывание серебра проводится более длительно и проявление его производится в восстанавливающих растворах (формалина) очень низкой концентрации, обладающих также отмывающим эффектом.

Таким образом, известные способы импрегнации серебра обеспечивают селективное выявление отдельных элементов тканей (сосуды, нервы, коллагеновые волокна), которые обычно не участвуют в формировании люминальной поверхности оболочек. При этом восстановление серебра не доводится до придания им светоотражательной способности, не импрегнируются поверхностные структуры, что, в совокупности, не позволяет получить достоверную картину рельефа поверхности препаратов в отраженном свете.

Предложенный способ обеспечивает серебрение поверхности препарата на основе тотальной (неселективной) импрегнации всех структур, участвующих в формировании этой поверхности. Для этого импрегнация серебра в препарат проводится в виде 10% раствора азотнокислой его соли, не обладающей избирательным осаждением на отдельных структурах. Обычно применяемые аммиачные растворы азотнокислого серебра осаждаются избирательно на аргентофильных структурах, кроме того, они неустойчивы и легко диссоциируют на стойкие окислы, образующие в последующем не отражающие свет темно-коричневые артефакты на поверхности препарата. Восстановление серебра проводится 1% водным раствором аскорбиновой кислоты (исключая межэтапную промывку). Обычно применяемые формалин и глюкоза не восстанавливают серебро из азотнокислой его соли в металлическое состояние. Известно, что сильными восстанавливающими свойствами обладает аскорбиновая кислота (Э.Пирс. Гистохимия. М., 1962, с.210). Изготовленные предложенным способом препараты приобретают матово-зеркальный вид с серо-голубым цветовым оттенком, свидетельствующим о качественном и полноценном восстановлении импрегнированного серебра, и обладают хорошей светоотражательной способностью.

Рельеф поверхности такого препарата исследуется с помощью микроскопов плоского поля в отраженном свете при одностороннем падающем освещении. При таком освещении поверхности препарата со стороны наблюдателя (объектива) рельеф поверхности визуализируется в объемном изображении. Микроскопы плоского поля способны формировать объемное изображение в пределах глубины резкого изображения объективов порядка 100-200 мкм (Егорова О.В. С микроскопом на "ты". СПб., 2000, с.40). Источник света устанавливается сбоку и выше уровня столика микроскопа. Оптимальным тенеобразующим является угол падения светового луча на препарат в пределах 75-85° относительно оси объектива. Величина угла падения луча зависит от нескольких факторов: от длины фокусного расстояния и диаметра применяемого объектива, от величины деталей и от характера пересеченности рельефа поверхности препарата, от необходимости освещения дна глубоких и узких ям, мощности источника, светоотражательной способности поверхности препарата и др. Такое одностороннее падающее освещение создает градиент освещенности отдельных элементов рельефа поверхности препарата в зависимости от угла падения на них световых лучей, то есть склоны возвышений и углублений, обращенные к источнику света, освещены больше чем противоположные склоны. При больших углах падения света противоположные к источнику света склоны отдельных возвышений и углублений с углом наклона, большим угла падения света, становятся не освещенными прямыми лучами света. Такое повышение светотеневого эффекта освещения (тенеобразование) как контраста освещенности элементов рельефа поверхности позволяет выявить контуры структур с пологими склонами, отдельные волокна и клетки. Изменение азимута освещения поворотом столика микроскопа позволяет уточнить особенности строения деталей поверхности, имеющих сложные асимметричные формы. К примеру, освещение борозд и валиков перпендикулярно или вдоль к их направлению выявляет различные детали их строения. Изменение азимута освещения позволяет избежать последствий "азимутального эффекта" (Скворцов Г.Е. с соавт. Микроскопы. Л. 1969, с.72). Азимутальный угол освещения измеряется с южного нулевого азимута как положительный по направлению движения часовой стрелки и как отрицательный против движения часовой стрелки.

Способ осуществляется следующим образом.

Перед микроскопией поверхность препарата подвергают серебрению для придания ей светоотражательной способности.

Для этого фиксированные в формалине пленочные препараты оболочек с естественной поверхностью (брюшина, плевра, слизистые, синовиальная мембрана и др.), расправленные кусочки диафрагмы, кишечной стенки, капсулы суставов, участок суставного хряща и др. промываются в водопроводной воде в течение суток и споласкиваются в дистиллированной воде. Толщина препарата для микроскопии в отраженном свете не имеет принципиального значения.

Затем осуществляют экспозицию кусочков в 10% растворе азотнокислого серебра в течение 10 минут, восстановление серебра 1% раствором аскорбиновой кислоты в течение 1 минуты.

Далее как обычно: остановка проявления в аммиачной воде, промывание в дистиллированной воде, заключение в бальзам.

Подготовленные таким образом препараты исследуют посредством микроскопа плоского поля с объективами до 50-кратного увеличения (общее увеличение до 350-500 раз), позволяющего визуализировать объемную картину рельефа поверхности на тканевом уровне исследований. Микроскопию препарата проводят в отраженном свете при одностороннем падающем тенеобразующем освещении. Источник света устанавливается сбоку и выше уровня столика микроскопа. Оптимальным тенеобразующим является угол падения светового луча на препарат в пределах 75-85°. Для выявления особенностей строения отдельных структур рельефа изменяется угол падения и азимут светового луча.

На фотографиях показаны примеры полученных с помощью предложенного способа изображений, где четко визуализирован рисунок и рельеф поверхности препарата.

Фиг.1 - поверхность плевры человека с рельефом складок и контурами клеток мезотелия. Объектив 50, окуляр 6,3; освещение справа - угол падения светового луча 80°, азимутальный угол составляет - 90°.

Фиг.2 - поверхность базальной мембраны брюшины человека с подлежащими жировыми дольками, формирующими округлые возвышения с крутыми склонами 1. Объектив 12, окуляр 12,5; освещение справа - угол падения светового луча 80°, азимутальный угол освещения - 90°.

Фиг.3 - поверхность базальной мембраны диафрагмальной брюшины человека с параллельными и относительно регулярными (длиной волны 15-20 мкм) узкими складками Объектив 25, окуляр 12,5; освещение слева - угол падения светового луча 75°, азимутальный угол освещения +70°.

Фиг.4 - поверхность синовиальной мембраны наднадколенниковой синовиальной сумки человека (образована наряду с синовиоцитами и межклеточным веществом). Через отверстия визуализируется наличие дополнительной полости. Длина тени от краев больших отверстий на дно полости детерменирована глубиной полости и углом падения светового потока. Объектив 6,3; окуляр 12,5; освещение слева - угол падения светового луча 75°, азимутальный угол освещения +120°.

Полученные изображения обладают высоким качеством визуализации объемного рельефа поверхности вплоть до детализации клеточных структур.

Таким образом, предложенный способ позволяет повысить качество исследования рельефа поверхности гистологических препаратов, наблюдая их в объемном изображении на тканевом уровне, что обеспечивает получение дополнительной достоверной информации о состоянии биологического объекта.