способ получения l-треонина с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia

Формула изобретения

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент треонина, отличающаяся тем, что такая бактерия модифицирована таким образом, что активность аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы увеличена.

2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что активность аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы увеличена за счет увеличения экспрессии гена аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы.

3. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что активность аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы увеличена за счет увеличения числа копий гена аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы или модификации последовательности, осуществляющей контроль экспрессии гена, таким образом, что экспрессия указанного гена увеличивается.

4. Бактерия по п.3, отличающаяся тем, что число копий гена увеличено за счет трансформации бактерии с помощью низкокопийного вектора, содержащего указанный ген.

5. Бактерия по любому из пп.2-4, отличающаяся тем, что ген аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы получен из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.

6. Бактерия по п.5, отличающаяся тем, что ген аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы кодирует белки (А) или (В):

(А) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2;

(В) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащую делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и обладающий активностью аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы.

7. Бактерия по п.5, отличающаяся тем, что ген аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы содержит следующую ДНК (а) или (b):

(a) ДНК, состоящую из последовательности нуклеотидов с 1 по 1104, приведенной в списке последовательностей под номером 1;

(b) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностью нуклеотидов с 1 по 1104, приведенной в списке последовательностей под номером 1, или с зондом, приготовленным из указанной последовательности нуклеотидов, и кодирует белок, обладающий активностью аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы.

8. Бактерия по п.7, отличающаяся тем, что жесткими условиями являются условия, при которых отмывка осуществляется при 60°С, а концентрация соли соответствует 1×SSC и 0,1% SDS, продолжительность отмывки составляет 15 мин.

9. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что указанной бактерии повышена экспрессия одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из:

мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;

гена rhtA, кодирующего предполагаемый трансмембранный белок.

10. Бактерия по п.9, отличающаяся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия мутантного гена thrA, гена thrB, гена thrC и гена rhtA повышена.

11. Способ получения L-треонина, включающий стадии выращивания бактерии, принадлежащей к роду Escherichia - продуцента треонина в питательной среде; и выделения L-треонина из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве бактерии - продуцента треонина используют бактерию по любому из пп.1-10.

Описание изобретения к патенту

Область техники.

Настоящее изобретение относится к способу получения L-аминокислот методом ферментации, более конкретно, к гену, полученному из Escherichia coli, который положительно влияет на результаты ферментации. Указанный ген вызывает увеличение продукции L-аминокислот, и в частности, например, продукции L-треонина.

Предшествующий уровень техники

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (см., например, выложенную патентную заявку Японии №56-18596 (1981), WO 95/16042 или патенты США 5661012 и 6040160).

Известны различные штаммы, использующиеся для производства L-треонина методом ферментации. Это штаммы с увеличенными активностями ферментов, вовлеченных в биосинтез L-треонина (патенты США 5175107; 5661012; 5705371; 5939307; европейский патент 219027), штаммы, устойчивые к некоторым химических реагентам, таким как L-треонин и его аналоги (заявка РСТ 0114525 А1, европейская заявка 301572 А2, патент США 5661012), штаммы, в которых устранена чувствительность целевого фермента к ингибированию продуцируемой аминокислотой или ее побочными продуктами по типу обратной связи (патенты США 5175107 и 5661012), штаммы с инактивированными ферментами системы деградации треонина (патенты США 5939307 и 6297031).

Для создания штамма ВКПМ В-3996 несколько мутаций и плазмида, описанная ниже, были введены в родительский штамм Е.coli К-12 (ВКПМ В-7). Мутантный ген thrA (мутация thrA442) кодирует белок аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, который устойчив к ингибированию треонином по типу обратной связи. Мутантный ген ilvA (мутация ilvA442) кодирует белок треониндеаминазу, обладающую пониженной активностью, которая выражается в пониженном уровне биосинтеза изолейцина и в фенотипе с недостатком по изолейцину типа "leaky". В бактерии с мутацией ilvA442 транскрипция оперона thrABC не репрессируется изолейцином, что является очень эффективным при продукции треонина. Инактивация гена tdh приводит к предотвращению деградации треонина. В указанный штамм была введена генетическая детерминанта ассимиляции сахарозы (гены scrKYABR). Для увеличения экспрессии генов, контролирующих биосинтез треонина, в промежуточный штамм TDH6 была введена плазмида pVIC40, содержащая мутантный треониновый оперон thrA442BC. Количество треонина, накопленного в ходе ферментации этого штамма, достигало 85 г/л.

Ранее авторы настоящего изобретения получили исходя из Е.coli K12 мутант, содержащий мутацию thrR (упоминаемый здесь и далее как rhtA23), придающую устойчивость к высокой концентрации треонина и гомосерина на минимальной питательной среде (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 21, 611-616 (1985)). Фенотипически мутация выражается в повышении продукции L-треонина (патент СССР №974817), гомосерина, и глутамата (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 27, 556-561, 1991, Европейская патентная заявка 1013765А) соответствующим штаммом-продуцентом Е.coli, таким как штамм ВКПМ-3996. Более того, авторы настоящего изобретения показали, что ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е.coli, рядом с опероном glnHPQ, кодирующим компоненты транспортной системы глутамина, и что ген rhtA идентичен открытой рамке считывания ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА2218541 в GenBank, gi:440181), расположенной между генами рехВ и ompX. Участок, экспрессирующий белок, кодируемый ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine - устойчивость к гомосерину и треонину). Кроме того, было установлено, что мутация rhtA23 является заменой А на G положении - 1 относительно старт кодона ATG (ABSTRACTS of 17 ^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457; Европейская патентная заявка 1013765).

В условиях, когда главный путь биосинтеза треонина изучен и в значительной степени оптимизирован, дальнейшее улучшение штамма - продуцента треонина может быть постигнуто путем повышения в бактерии количества дальних предшественников треонина, таких как аспартат.

Известно, что аспартат является донором углерода для синтеза аминокислот семейства аспартата (треонин, метионин, лизин) и диаминопимелата - одного из составляющих элементов клеточной стенки бактерий. Эти синтезы осуществляются в сложных метаболических путях с несколькими точками разветвления и чрезвычайно чувствительными схемами регуляции.

В точке ветвления аспартата, полуальдегида аспартата, гомосерина столько изозимов, сколько и аминокислот, получающихся из этого биосинтетического этапа. Аспартокиназа-гомосериндегидрогеназа I, кодируемая частью оперона thrABC, осуществляет первую и третью реакции биосинтеза треонина. Треонин и изолейцин регулируют экспрессию аспартокиназа-гомосериндегидрогеназы I, а треонин ингибирует обе активности, катализирующие вышеупомянутые реакции (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

Ген asd кодирует аспартат- -полуальдегиддегидрогеназу (Asd; EC 1.2.1.11), являющуюся ключевым ферментом путей биосинтеза лизина, метионина, треонина и диаминопимелата. Аспартат- -полуальдегиддегидрогеназа обратимо превращает L-аспартил-4-Р в L-аспартатполуальдегид, восстанавливая при этом НАДФ. Показан эффект влияния амплификации гена asd на продукцию L-лизина, аминокислот семейства аспартата, в штамме Е.coli (патент США 6040160). Также показано, что аспартат- -полуальдегиддегидрогеназа может положительно влиять на продукцию L-лизина, L-треонина и L-изолейцина у коринеформных бактерий (Европейская патентная заявка 0219027).

Однако к настоящему времени нет сообщений об использовании бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, с увеличенной активностью аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы для производства L-треонина.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов продуцентов L-треонина и предоставление способа получения L-треонина с использованием указанных штаммов.

Данная цель была достигнута путем установления того факта, что ген asd, кодирующий аспартат- -полуальдегиддегидрогеназу, клонированный в низкокопийный вектор, может увеличивать продукцию треонина. Таким образом, было совершено настоящее изобретение.

Целью настоящего изобретения является создание бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, продуцента L-треонина, при этом указанная бактерия модифицирована с целью повышения активности аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, в которой активность аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы повышена за счет увеличения экспрессии гена, кодирующего аспартат- -полуальдегиддегидрогеназу.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, в которой активность аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы повышена за счет увеличения числа копий гена аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы или модификации последовательности, осуществляющей контроль экспрессии гена таким образом, что экспрессия указанного гена увеличивается.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, в которой число копий гена увеличено за счет трансформации бактерии с помощью низкокопийного вектора, содержащего указанный ген,

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, в которой ген аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы получен из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, в которой указанный ген аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы кодирует один из белков группы, включающей в себя:

(A) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 2; и

(B) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, в которой ген аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы содержит следующую ДНК (а) или (b):

(a) ДНК, которая представлена последовательностью нуклеотидов с 1 по 1104, приведенной в списке последовательностей под номером 1; и

(b) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностью нуклеотидов с 1 по 1104, приведенной в списке последовательностей под номером 1, или с зондом, приготовленным на основании указанной последовательности нуклеотидов, и кодирует белок, обладающий активностью аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, где жесткими условиями являются условия, при которых отмывка осуществляется при 60°С в течение 15 минут, а концентрация соли соответствует 1×SSC и 0,1% SDS.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, где указанная бактерия модифицирована с целью повышения экспрессии одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу; и

- гена rhtA, кодирующего предполагаемый трансмембранный белок.

Также целью настоящего изобретения является создание описанной выше бактерии, где указанная бактерия модифицирована с целью повышения экспрессии указанного мутантного гена thrA, указанного гена thrB, указанного гена thrC и указанного гена rhtA.

Также целью настоящего изобретения является создание способа получения L-треонина, включающего описанные выше стадии выращивания бактерии в питательной среде с целью продукции и накопления L-треонина в питательной среде; и выделения L-треонина из культуральной жидкости.

Наилучший способ осуществления изобретения.

Согласно настоящему изобретению «бактерия - продуцент треонина» означает бактерию, обладающую способностью к накоплению L-треонина в питательной среде в условиях, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Способность к продукции L-треонина может быть придана или улучшена путем селекции. Используемый здесь термин «бактерия - продуцент L-треонина» также означает бактерию, которая способна к продукции L-треонина и вызывает накопление L-треонина в ферментационной среде в больших количествах по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким как штамм Е.coli К-12.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в их число согласно настоящему изобретению.

Термин «активность аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы» означает активность по катализу реакции обратимого субстрат-зависимого восстановления НАДФ в присутствии фосфата или арсената. Активность аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы может быть измерена с помощью метода, описанного, например, у Preiss, J. et al. (Curr. Microbiol., 7: 263-268 (1982)).

Термин «модифицирована с целью увеличения активности аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы» означает то, что удельная активность становится выше, чем у немодифицированного штамма, например природного штамма. Например, в случае, когда количество молекул аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы в клетке увеличено, когда специфическая активность у молекулы аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы увеличена и так далее. Кроме того, в качестве природного штамма, который может служить объектом для сравнения, может быть упомянут штамм Escherichia coli К-12. В результате увеличения внутриклеточной активности аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы наблюдается эффект увеличения количества накопленного L-треонина.

Увеличение активности аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы в клетке бактерии может быть достигнуто путем увеличения экспрессируемого количества гена, кодирующего аспартат- -полуальдегиддегидрогеназу. В качестве гена, кодирующего аспартат- -полуальдегиддегидрогеназу, может быть использован любой такой ген, выделенный из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, а также гены, выделенные из бактерий других видов, таких как коринеформные бактерии. Наиболее предпочтительными из них являются гены, выделенные из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia.

В качестве гена, кодирующего аспартат- -полуальдегиддегидрогеназу из Escherichia coli, известен ген asd (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi: 16131307). Следовательно, ген asd может быть получен методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; White, T.J. et al. Trends Genet, 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, приготовленных на основании последовательности нуклеотидов указанного гена. Гены, кодирующие аспартат- -полуальдегиддегидрогеназу, из других микроорганизмов могут быть получены подобным способом.

Примером гена asd из Escherichia coli является ДНК, кодирующая следующие белки (А) и (В):

(A) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 2; или

(B) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы.

Количество «нескольких» аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Оно может быть от 2 до 30, предпочтительно от 2 до 15 и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А). Это происходит из-за того, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу и различия в таких аминокислотах не вызывают значительных изменений в трехмерной структуре белка и его активности. Поэтому белком (В) может быть белок, имеющий гомологию не меньше, чем 30-50%, предпочтительно 50-70% по отношению ко всем аминокислотным остаткам, составляющим аспартат- -полуальдегиддегидрогеназу, и обладающий активностью аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы.

ДНК, кодирующая практически такой же белок, как описанная выше аспартат- -полуальдегиддегидрогеназа, может быть получена, например, путем модификации нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей аспартат- -полуальдегиддегидрогеназу (SEQ ID NO: 1), например, с помощью метода сайт-направленного мутагенеза, таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков в определенных местах содержат делеции, замены, вставки или добавки. ДНК, модифицированная, как описано выше, может быть получена традиционными известными методами обработками с целью получения мутаций. Такие методы включают обработку ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, гидроксиламином или обработку бактерии, содержащей указанную ДНК, с помощью УФ излучения или реагентом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота.

ДНК, кодирующая практически такой же белок, как аспартат- -полуальдегиддегидрогеназа, может быть получена путем экспрессии ДНК, содержащей описанные выше мутации, в подходящей клетке, и изучения активности любого экспрессируемого продукта. ДНК, кодирующая практически такой же белок, как аспартат- -полуальдегиддегидрогеназа, также может быть получена путем выделения ДНК из геномной ДНК, кодирующей аспартат- -полуальдегиддегидрогеназу, содержащую мутации, или из клетки, содержащей ее, и которая гибридизуется с зондом с нуклеотидной последовательностью, включающей, например, нуклеотидную последовательность, приведенную в Списке последовательностей как последовательность 1 (SEQ ID NO: 1), в жестких условиях, и которая кодирует белок, обладающий активностью аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы. Термин «жесткие условия», упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Трудно четко описать такие условия в каких-либо численных выражениях. Однако, например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру, ДНК, обладающие гомологией не менее 50% друг относительно друга, а ДНК, обладающие меньшей гомологией, не гибридизуются друг с другом. С другой стороны, примером жестких условий являются условия, при которых ДНК гибридизуются друг с другом, при концентрации солей, соответствующей стандартным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 1×SSC, 0,1% SDS, предпочтительно 0,1×SSC, 0,1% SDS при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от вида фильтра, используемого для блоттинга и, как правило, от рекомендаций изготовителя. Например, рекомендованная продолжительность отмывки нейлонового фильтра Hybond N+(Amersham) в жестких условиях составляет 15 минут.

В качестве зонда может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером 1. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером 1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером 1, в качестве матрицы. В случае когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50°С, 2×SSC и 0,1% SDS.

Делеции, замены, вставки или добавки нуклеотидов, описанные выше, также включают мутации, которые существуют в природе (мутанты или варианты), например, ввиду индивидуальной разницы или видовых и родовых различий в бактериях, содержащих аспартат- -полуальдегиддегидрогеназу.

«Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок», означает введение указанной ДНК в клетку бактерии, например, традиционными методами. Трансформация указанной ДНК приводит к увеличению экспрессии указанного гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и увеличения активности указанного белка в клетке бактерии.

К методам увеличения экспрессии гена относятся методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, увеличивает число копий этого гена. Для этой цели предпочтительно использовать низкокопийные векторы. Примерами низкокопийных векторов являются векторы pSC101, pMW118, pMW119 и подобные им. Используемый здесь термин «низкокопийный вектор» используется для векторов, количество которых не превышает 5 копий на клетку. В качестве метода трансформации может быть использован любой описанный к настоящему времени метод. Например, может быть использован метод обработки клеток-реципиентов с помощью хлорида кальция для увеличения проницаемости ДНК через клеточную мембрану, описанный для Escherichia coli К-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).

Кроме того, увеличение экспрессии гена может быть достигнуто путем введения множественного числа копий указанного гена в хромосомы бактерии, например, методом гомологичной рекомбинации, Mu интеграции и подобными им методами. Например, один раунд Mu интеграции позволяет встроить в бактериальную хромосому до трех копий интегрируемого гена.

Также увеличение экспрессии гена может быть достигнуто путем помещения ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора. В качестве сильных промоторов известны, например, lac промотор, trp промотор, trc промотор, P_R или P _L промоторы фага лямбда. Использование сильного промотора может комбинироваться с увеличением числа копий гена.

Кроме того, промотор может быть усилен, например, путем введения мутации в указанный промотор с целью повышения уровня транскрипции гена, расположенного после промотора. Далее, известно, что замена нескольких нуклеотидов в участке между местом связывания рибосомы (RBS) и старт-кодоном, а в особенности, в последовательности непосредственно перед старт-кодоном, в значительной степени влияет на транслируемость мРНК. Например, было обнаружено 20-кратное изменение уровня экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих старт кодону (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984). Как описано выше, авторы настоящего изобретения установили, что мутация rhtA23 является заменой А на G положении -1 относительно старт кодона ATG (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457). Поэтому было высказано предположение, что мутация rhtA23 усиливает экспрессию гена rhtA и, как следствие, увеличивает уровень устойчивости к треонину, гомосерину и некоторым другим субстратам, транспортируемым из клетки.

Более того, возможно ввести нуклеотидные замены в промоторный участок гена аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы в хромосоме бактерии таким образом, что указанный промотор станет более сильным. Изменение последовательности, контролирующей экспрессию, может быт осуществлено, например, таким же методом, как замена гена с использованием плазмиды, чувствительной к температуре, как это описано в международной патентной заявке WO00/18935 или патентной заявке Японии №1-215280.

Увеличение числа копий гена аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы может быть достигнуто путем введения множественного числа копий гена аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы в хромосомную ДНК бактерии. Для введения множественного числа копий гена аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы в хромосомную ДНК бактерии применяется гомологичная рекомбинация с использованием последовательностей, присутствующих в хромосомной ДНК, в качестве мишеней. В качестве последовательностей, присутствующих в хромосомной ДНК в нескольких копиях, могут использоваться повторяющиеся фрагменты ДНК, а также инвертированные повторы, присутствующие на концах мобильных элементов. Также, как это описано в патентной заявке Японии №1-109985, возможно ввести ген аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы в транспозон для последующей трансформации с введением множества копий указанного гена в хромосомную ДНК.

Методами получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве затравок и подобные им могут быть обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-треонина. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-треонина.

В качестве родительского штамма, в которым активность аспартат- -полуальдегиддегидрогеназы, кодируемой геном asd, будет повышена, могут быть использованы штаммы - продуценты треонина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штамм Е.coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM ВР-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и FERM BP-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобные им.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать глюкозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 113105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована для того, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих геном в дополнение к гену asd:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу.

Также предпочтительно, чтобы в дополнение к увеличению экспрессии гена asd указанная бактерия была модифицирована путем увеличения экспрессии гена rhtA, кодирующего, как предполагается, трансмембранный белок. Наиболее предпочтительное выражение настоящего изобретения заключается в бактерии с увеличенной экспрессией гена asd, мутантного гена thrA, генов thrB, thrC и rhtA.

Способ получения L-треонина согласно настоящему изобретению включает стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-треонина в питательной среде и выделения L-треонина из культуральной жидкости. Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-треонина из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием микроорганизма.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин и дрожжевой экстракт.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6,5 до 7,2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-треонин может быть выделен и очищен методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

Примеры

Более детально настоящее изобретение будет разъяснено ниже со ссылкой на следующие Примеры, не ограничивающие область применения настоящего изобретения.

Пример 1: Клонирование гена asd из Е.coli в вектор рМ.

Ген asd был клонирован из хромосомной ДНК штамма Е.coli (K12 Mu cts62 Mud5005) (ВКПМ В-6804). Сначала в штамме Е.coli (K12 Mu cts62 Mud5005) (ВКПМ В-6804) был индуцирован фаг мини-Mu. Далее, библиотеку полученных производных плазмиды pMud5005, содержащих части хромосомы вышеупомянутого штамма, использовали для трансформации asd штамма SH 309. Штамм SH 309 (ВКПМ В-3899) имеет следующий фенотип: F^- araD139 rpsL150 deoC1 ptsF25 relA1 feb5301 rbsR ugpA704::Tn10 Del (argF - lac) U169 Del (mal - asd) Tet^R Str^R. asd штамм SH 309 не способен расти на L-среде, для роста ему требуется добавка диаминопимелиновой кислоты (DAPA). Клоны SH 309 asd⁺, содержащие плазмиду pMud5005-asd, были отобраны на L-среде. Была выделена плазмида pMud5005-asd, и BamHI-PstI ДНК фрагмент этой плазмиды (1646 п.о.), содержащий ген asd, был переклонирован на плазмиду pMW119, предварительно модифицированную путем замены промотора Р_lac на промотор P_R . Таким образом, была сконструирована плазмида pMW-asd, содержащая ген asd под контролем промотора P_R. Полученная плазмида pMW-asd совместима с плазмидой pVIC40 (репликон pRSF1010), поэтому обе плазмиды, pVIC40 и pMW-asd, могут одновременно экспрессироваться в бактериальной клетке.

Стрептомицин-устойчивый штамм Е.coli strain B-3996, продуцент треонина, был трансформирован полученной плазмидой pMW-asd. Таким образом, был получен штамм В-3996(pMW-asd).

Пример 2.Влияние амплификации гена asd на продукцию треонина.

Два штамма Е.coli B-3996 и B-3996(pMW-asd) выращивались в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром, содержащих стрептомицин (100 мкг/мл) и ампициллин (100 мкг/мл). Для получения посевной культуры каждый из штаммов выращивался в ферментационных пробирках 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозой на роторной качалке (250 об/мин) при температуре 32°С в течение 18 часов. Затем в ферментационную среду внесли 0,1 мл (5%) посевной культуры. Ферментацию проводили в пробирках 20×200 мм с 2 мл минимальной ферментационной среды. Клетки выращивались в течение 24 часов при температуре 32°С на роторной качалке при 250 об/мин.

После окончания ферментации количество накопленного в среде L-треонина определяли с помощью тонкослойной хроматографии (TLC). Пластинки Sorbfil (Акционерное Общество Сорбополимер, Краснодар, Россия) прогонялись в жидкой фазе следующего состава: изопропанол : ацетон : вода : 25% аммиак = 25:25:7:6 (соотношения объема). В качестве визуализирующего реагента использовался раствор (2%) нингидрина в ацетоне. Результаты представлены в Таблице 1.

Использовали следующий состав среды для ферментации (г/л):

Сахароза	40.0
(NH4) 2SO4	10.0
KH2PO 4	1.0
MgSO 4×7H2O	0.4
FeSO4×7H 2O	0.02
MnSO4×5H2O	0.02
Тиамин HCl	0.0002
Дрожжевой экстракт	1.0
СаСО3	20.0
L-изолейцин	0.05

Сахарозу и сульфат магния стерилизовали раздельно. СаСО₃ стерилизовали сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. Значение рН соответствовало 7.0. Антибиотик добавляли в среду после стерилизации.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на конкретные Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.

Штамм	OD 560	Треонин, г/л
B3996/pMW-asd	8.6	18.5
	8.4	18.3
	9.1	19.8
	9.5	19.2
	9.3	20.0
	8.9	18.6
	9.4	19.3
	9.0	19.3
	9.0±0.4	19.1±0.6
В-3996 (контроль)	9.3	18.6
	9.6	17.9
	10.5	17.9
	10.6	17.6
	9.8	17.8
	9.9	18.1
	10.2	18.0
	10.0	17.9
	10.0±0.4	18.0±0.3