способ и устройство для изготовления биополимерных матриц

Формула изобретения

1. Способ изготовления биополимерных матриц путем микродозирования на поверхность (18) предметного носителя (9) минимальных количеств жидкости с помощью аппликатора, включающего в себя капиллярное пространство (23), приводной капилляр (2) и пипеточный кончик (1), при котором в приводной капилляр (2) подают буферный раствор (24) из питающей емкости (11), пипеточный кончик может перемещаться в трехмерном пространстве, между аппликатором и буферной емкостью (14) приложено электрическое напряжение с изменяемой полярностью для получения электроосмотического потока в приводном капилляре (2), причем путем приложения к приводному капилляру (2) электрического напряжения соответствующей полярности обеспечивается всасывание дозируемого биополимера из емкости (8), а после изменения полярности - нанесение дозируемого биополимера на поверхность (18) предметного носителя (9).

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что изменение полярности электрического напряжения, способствующее выходу жидкости из капиллярного пространства (23) аппликатора, осуществляют после того, как пипеточный кончик (1) достигнет заданной позиции над поверхностью (18) предметного носителя (9).

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что в приводной капилляр (2) и пипеточный кончик (1) через клапан (5) подают буферный раствор (24), имеющий необходимое для создания электроосмотического давления значение рН, а также соответствующую концентрацию ионов.

4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что с помощью электропроводящего слоя на поверхности (18) предметного носителя (9) осуществляют электрофоретическое осаждение заряженных частиц биополимера на предметный носитель.

5. Устройство для изготовления биополимерных матриц путем микродозирования на поверхность (18) предметного носителя (9) минимальных количеств жидкости, включающее аппликатор с капиллярным пространством (23), приводным капилляром (2) и пипеточным кончиком (1), подсоединенные к аппликатору питающая емкость (11) и буферная емкость (14) с буферным раствором (24), устройство позиционирования по осям Х и Y для установки пипеточного кончика (1) в желаемую позицию у поверхности (18) предметного носителя (9), подсоединенный к приводному капилляру (2) питающий электрический провод (3) и ведущий к буферной емкости (14) электрический контакт (4) для подачи напряжения на участок между аппликатором и буферной емкостью (14), между которыми помещены переключающие элементы (10) с переменной полярностью, к которым подсоединены источники электрического напряжения (12а, 12б).

6. Устройство по п.5, отличающееся тем, что приводной капилляр (2) имеет ответвление (16), в котором размещено гидродинамическое сопротивление (13).

7. Устройство по п.5 или 6, отличающееся тем, что приводной капилляр изготовлен из стекла или кварца.

8. Устройство по пп.5-7, отличающееся тем, что пипеточный кончик (1) вытянут из стеклянного капилляра до получения кончика малого диаметра, причем кончик имеет диаметр в интервале от 10 мкм до 1000 мкм.

9. Устройство по п.8, отличающееся тем, что пипеточный кончик (1) вытянут из стеклянного капилляра до получения кончика малого диаметра, причем кончик имеет диаметр в интервале от 50 мкм до 300 мкм.

10. Устройство по пп.5-9, отличающееся тем, что между пипеточным кончиком (1) и приводным капилляром (2) предусмотрено электрическое заземление.

11. Устройство по пп.5-10, отличающееся тем, что между пипеточным кончиком (1) и приводным капилляром (2) предусмотрено электрическое соединение для создания электроосмотического потока, причем в находящуюся в аппликаторе головку капилляра (21) вставлен платиновый электрод, а электрический контакт (4) опущен в буферную емкость (14) с буферным раствором.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается способа и устройства для изготовления биополимерных матриц путем микродозирования минимальных количеств жидкости.

Для суперпараллельной аналитики таких биополимеров, как например нуклеиновые кислоты, протеины или полисахариды, применяются микрополимерные поля, называемые также микроматрицами. Для создания таких матриц необходимо равномерно наносить на поверхность субстрата, например предметного носителя, очень малые, измеряемые в пиколитрах или нанолитрах пробы полимеров в виде водного раствора или водной суспензии. Существующие в настоящее время методы пипетирования не пригодны для работы с такими малыми количествами жидкости.

Так как точное дозирование передаваемого количества до сих пор является очень трудной задачей, то от точного дозирования отказываются и количества жидкости передаются с помощью механически контактирующих предметов, например, писчего пера. Однако используемые писчие перья могут брать ограниченное количество жидкости, что не дает возможность загружать большое число несущих субстрат поверхностей с помощью одной заправки писчего пера. Для увеличения емкости используемых перьев была предпринята попытка наносить на перья насечки или борозды для того, чтобы они могли брать большие количества загружаемого субстрата пробы. Хотя это и позволило увеличить емкость писчих перьев таким образом, что с помощью одной заправки на предметный носитель могло наноситься большее число капель биополимера, однако очень затруднило чистку подобных перьев с нанесенными на них бороздками и насечками. При нанесении новых проб биополимера на предметный носитель необходимо удалять остатки предыдущих проб также и из бороздок и насечек, увеличивающих емкость писчих перьев.

Для свода до приемлемого минимума погрешностей измерения при анализе, осуществляемом с помощью подобных биополимерных матриц, обычно применяются внутренние стандарты.

Настоящее изобретение ставит перед собой задачу осуществления нанесения минимальных количеств жидкости на биополимерную матрицу простым и надежным способом.

В соответствии с изобретением эта задача решается способом изготовления биополимерных матриц путем микродозирования на поверхность предметного носителя минимальных количеств жидкости с помощью аппликатора, включающего в себя капиллярное пространство, приводной капилляр и пипеточный кончик, при котором в приводной капилляр подают буферный раствор из питающей емкости, пипеточный кончик может перемещаться в трехмерном пространстве, между аппликатором и буферной емкостью приложено электрическое напряжение с изменяемой полярностью для получения электроосмотического потока в приводном капилляре, причем путем приложения к приводному капилляру электрического напряжения соответствующей полярности обеспечивается всасывание дозируемого биополимера из емкости, а после изменения полярности - нанесение дозируемого полимера на поверхность предметного носителя.

Преимущества, достигаемые с помощью предлагаемого способа, следует видеть, прежде всего, в том, что с помощью напряжения, прилагаемого к пипеточному кончику содержащей пробный субстрат капиллярной трубочки, может осуществляться максимально точная дозировка минимальных количеств жидкости в тот момент, когда пипеточный кончик приставлен к поверхности соответствующего предметного носителя. Если при подаче необходимого для транспортировки исследуемой жидкости напряжения применяются несколько параллельно работающих пипеточных наконечников капиллярных трубочек, то можно недорого и быстро точнейшим образом и на в высшей степени равном расстоянии друг от друга расположить на поверхности предметного носителя биополимеры.

При следующей форме выполнения способа согласно изобретению изменение полярности электрического напряжения, способствующее выходу жидкости из капиллярного пространства аппликатора, осуществляют после того, как пипеточный кончик достигнет позиции над поверхностью предметного носителя.

При еще одной предпочтительной форме выполнения способа согласно изобретению в приводной капилляр и пипеточный кончик через клапан подают буферный раствор, имеющий необходимое для создания электроосмотического давления значение рН, а также соответствующую концентрацию ионов.

В соответствии с еще одной формой выполнения способа согласно изобретению электрофоретическое осаждение заряженных частиц биополимеров на поверхность предметного носителя осуществляют с помощью электропроводящего слоя на поверхности предметного носителя.

В соответствии с предлагаемым далее устройством для изготовления биополимерных матриц оно включает аппликатор с капиллярным пространством, приводным капилляром и пипеточным кончиком, подсоединенные к аппликатору питающую емкость и буферную емкость с буферным раствором, устройство позиционирования по осям Х и Y для установки пипеточного кончика в желаемую позицию у поверхности предметного носителя, подсоединенный к приводному капилляру питающий электрический провод и ведущий к буферной емкости электрический контакт для подачи напряжения на участок между аппликатором и буферной емкостью, между которыми помещены переключающие элементы с переменной полярностью, к которым подсоединены источники электрического напряжения.

С помощью предлагаемого в соответствии с изобретением устройства путем простого изменения полярности напряжения в результате возникновения электроосмотического потока в субстрате пробы происходит нанесение мельчайших количеств жидкости на поверхность предметного носителя через опущенный пипеточный кончик.

Для обеспечения непрерывной подачи буферного раствора в приводной капилляр предусмотрено гидродинамическое сопротивление, установленное над емкостью с буферным раствором в ответвлении приводного капилляра. С помощью имеющего соответствующий размер гидродинамического сопротивления обеспечивается подача буферного раствора в приводной капилляр без образования пузырьков и полостей.

Наиболее пригодным материалом для приводного капилляра и пипеточного кончика является стекло или кварц.

Пипеточный кончик приводного капилляра изготавливается методом вытяжения для получения малого диаметра, при этом диаметр кончика преимущественно лежит в диапазоне от 10 мкм до 1000 мкм. Особенно предпочтительным является диаметр пипеточного кончика в диапазоне от 50 до 300 мкм.

Для создания замыкания на массу между пипеточным кончиком и приводным капилляром предусмотрено электрическое заземление.

Между пипеточным кончиком и приводным капилляром предусмотрено электрическое соединение для создания электроосмотического потока, причем в находящуюся в аппликаторе головку капилляра вставлен платиновый электрод, а электрический контакт опущен в буферную емкость с буферным раствором.

Далее изобретение представлено на чертеже.

Чертеж схематически показывает конструкцию предлагаемого в соответствии с изобретением устройства для изготовления биополимерных матриц.

В качестве пипеточного кончика 1 для нанесения жидкой пробы на поверхность 18 предметного носителя 9 используется получаемый очень недорогим способом стеклянный капилляр с кончиком, вытянутым до диаметра, например, 200 мкм. Кончик капилляра с помощью микрошланга подсоединен к приводному капилляру 2 из стекла или кварца, обычно применяемому в газовой хроматографии. В соединение микрошланга вставлен питающий электрический провод 3, необходимый для создания электрического контакта. На противоположном кончике приводного капилляра 2 находится электрический контакт 4, погруженный в находящийся в буферной емкости 14 буферный раствор. Находящаяся в буферной емкости 14 жидкость может непрерывно подаваться по ответвлению 16, в котором установлено гидродинамическое сопротивление 13, в результате чего электрический контакт 4 постоянно находится в контакте с жидкостью в приводном капилляре 2.

В начале процесса пипетирования пипеточный кончик 1 стеклянного капилляра с помощью устройства для позиционирования по осям X-Y, например обычного графического плоттера или иного устройства позиционирования по осям X-Y, перемещается в положение над емкостью для отходов 7. В заключение на короткий период времени открывается клапан 5, расположенный перед приводным капилляром 2, и в приводной капилляр 2 с пипеточным кончиком 1, расположенный над емкостью для отходов 7, из питающей емкости 11 с соединением 6 для подачи газа в целях создания давления подается свежий буферный раствор, значение рН и концентрация ионов которого достаточны для получения электроосмотического потока в приводном капилляре 2 и, одновременно, продувается пипеточный кончик, расположенный над емкостью для отходов 7. Находящееся в упомянутом ответвлении 16 гидродинамическое сопротивление 13, например, в виде пористого стеклянного фильтра, способствует поступлению небольшого количества буферной жидкости в буферную емкость 14, что обеспечивает подачу буферного раствора в приводной капилляр 2, оканчивающийся пипеточным кончиком.

Между питающим электрическим проводом 3 и электрическим контактом 4, ведущим к буферной емкости 14, помещен переключающий элемент 10, изображенный на чертеже схематически. К контактам переключающего элемента 10 подсоединены два источника электрического напряжения, обозначенные 12а и 12b, которые соединены с массой через заземление 17.

Для всасывания подготовленного к пипетированию и находящегося в емкости 8 раствора биополимера через выключатель 10 на питающий электрический провод 3 и электрический контакт 4 подается имеющее соответствующую полярность электрическое напряжение для создания в приводном капилляре 2 электроосмотического потока обратной направленности. К этому моменту пипеточный кончик 1 опускается по оси Z в емкость с жидкой пробой 8 так, что соответственно приложенному напряжению через отверстие в пипеточном кончике 1 может поступать субстрат. После того как из емкости с биополимером всосано достаточное количество жидкости для пипетирования, в данном случае, например, содержимое чашечки пластины для микротитрирования, автомат для микропипетирования, т.е. устройство позиционирования по осям X-Y, помещает пипеточный кончик 1 над субстратом для нанесения проб. Субстратом может быть, например, предметное стекло 9, какое часто применяется в микроскопии. На предметном носителе 9 имеется поверхность 18, на которую последовательно наносятся поступающие из пипеточного кончика 1 капли биополимера. Поверхность 18 может представлять собой также поверхность, связывающую биополимер химически или взаимодействующую с ним физико-химически. С помощью устройства позиционирования по осям X-Y, которое, к тому же, дает возможность опускать пипеточный кончик 1 в направлении поверхности 18, осуществляется нанесение капель биополимера на поверхность 18 предметного носителя. Для этого с помощью переключателя 10 электрическое напряжение с измененной полярностью в течение предварительно установленного времени подается на приводной капилляр 2, в результате чего наносимая пипеткой жидкость выдавливается из пипеточного кончика 1 движущимся в обратном направлении электроосмотическим потоком и попадает на поверхность 18 предметного носителя 9. В результате жидкая проба может наноситься как на поверхность 18, так и в любую иную емкость. Альтернативно применению двух источников напряжения может использоваться также один единственный источник напряжения с соответствующим переключающим элементом. Возможны и другие варианты, например соединение с массой.

Путем соответствующей установки влияющих на электроосмотический поток параметров, в основном таких, как концентрация ионов и значение рН буферного раствора, а также величины прикладываемого электрического напряжения, можно дозировать количество наносимой жидкости и поддерживать его постоянным при нанесении отдельных проб биополимера на поверхность 18 предметного носителя. За счет этого можно создать на анализируемой поверхности 18 носителя 9 образец биополимера 19, содержащий пятна биополимера, расположенные друг от друга на одинаковом расстоянии 20 как по оси X, так и по оси Y.

Для ускорения и электрохимической активации процесса нанесения проб биополимера на соответствующую, взаимодействующую с биополимером химически и физико-химически поверхность 18 предметного носителя 9, после контакта пипеточного кончика 1 дополнительно на участке между питающим электрическим проводом 3 пипеточного кончика 1 и электропроводящей поверхностью предметного носителя 9 может быть приложено электрическое напряжение соответствующей полярности. В результате электрофоретическое отделение электрически заряженных проб биополимера может происходить уже на предметном носителе сразу после их нанесения, что очень благоприятно для последующего анализа и оценки.

Как следует из чертежа головная часть приводного капилляра 2 заключена в капиллярной головке 21, которая, в свою очередь, находится в оправе 22, представляющей собой, например, короткий отрезок шланга. В оправу 22 соответствующим образом опущен стеклянный или кварцевый пипеточный кончик 1 с полостью 23, в которую наносимая пипеткой жидкость засасывается или из которой (из полости 23) она, при изменении направления электроосмотического потока, исторгается. Пипеточный наконечник 1, изготовленный преимущественно из стекла, может иметь отверстие диаметром от 10 мкм до 1000 мкм, при этом диаметр образующегося в пипеточном кончике отверстия 1 преимущественно составляет от 50 до 300 мкм.

Перечень цифровых обозначений на чертеже

1. Пипеточный кончик

2. Приводной капилляр

3. Питающий электрический провод

4. Электрический контакт

5. Клапан

6. Подсоединение для подачи газа

7. Емкость для отходов

8. Емкость для биополимера

9. Предметный носитель

10. Переключатель полярности

11. Бутыль с жидкостью

12а Источник электрического напряжения +

12b Источник электрического напряжения -

13. Гидродинамическое сопротивление

14. Буферная емкость

15. Напорная линия

16. Ответвление

17. Соединение на массу

18. Поверхность предметного носителя

19. Проба биополимера

20. Расстояние между пятнами биополимера

21. Головка капилляра

22. Оправа

23. Полость капилляра

24. Буферный раствор