ассоциированная культуральная сухая вирусвакцина против ньюкаслской болезни и оспы птиц

Формула изобретения

Ассоциированная культуральная сухая вирусвакцина против ньюкаслской болезни и оспы птиц, включающая вируссодержащий материал и стабилизатор для внутрикожного применения, отличающаяся тем, что вируссодержащий материал, полученный при совместном культивировании на культуре клеток куриных фибробластов, содержит вирус оспы птиц штамм «ВГНКИ-3» и вирус ньюкаслской болезни штамм «М-ВНИИВВиМ», при этом содержание вируса в культуре клеток составляет 0,02-0,04 и 0,02-0,08 ТЦД ₅₀/кл соответственно.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к получению ассоциированной культуральной вакцины при совместном культивировании штамма "М-ВНИИВВиМ" вируса ньюкаслской болезни (НБ) и штамма «ВГНКИ-3» вируса оспы птиц (ОП).

Для профилактики инфекционных болезней птиц нарабатывается большое количество как живых, так и инактивированных вакцин, в т.ч. против НБ и ОП, которые применяются в виде монопрепаратов, что увеличивает трудозатраты. В связи с этим, для сокращения числа прививок и трудозатрат, а также снижения стрессов в процессе вакцинации, отрицательно влияющих на здоровье и продуктивность птицы, актуален вопрос о целесообразности применения ассоциированных вакцин.

Эффективность комплексной иммунизации эмбрион-вакцинами против ньюкаслской болезни и оспы птиц показана рядом исследователей как в экспериментальных, так и полевых условиях при внутрикожной аппликации [2, 3, 5, 6].

Известны комбинированные генно-инженерные вакцины против гриппа А птиц и оспы, НБ и оспы, созданные на основе вектора вируса оспы птиц (США). Живых ассоциированных культуральных вакцин против оспы птиц и ньюкаслской болезни до настоящего времени не создано.

Ассоциированный метод вакцинации, например, против НБ и ларинготрахеита [1], болезни Марека и Гамборо заключается в одновременном введении препаратов в организм птиц [4]. Однако положительных результатов одновременного накопления (репродукции) вирусов НБ и ларинготрахеита при совместном культивировании в одной биосистеме и даже в куриных эмбрионах (КЭ) не получено.

Профилактику ньюкаслской болезни птиц в основном проводят путем вакцинации препаратами, изготовленными на КЭ из лентогенных штаммов - Ла Сота, Бор-74 ВГНКИ и мезогенных штаммов парамиксовируса 1 - "Н", ГАМ-61. Эти штаммы при различных способах введения вызывают образование вирусспецифических антител (более 3 log₂) и защищают от заболевания более 80% птицы.

Вакцины из лентогенных штаммов обладают хорошей иммуногенностью, не реактогенны, вакцинацию можно проводить различными методами, но иммунитет формируется через 14-21 сутки после иммунизации.

Отличительной особенностью вакцин из мезогенных штаммов является то, что они защищают птицу на 3-8 сутки, но при этом обладают остаточной реактогенностью.

Вирусным сырьем для изготовления вакцин из лентогенных и мезогенных штаммов является экстраэмбриональная жидкость зараженных вирусом развивающихся КЭ, причем для получения вакцин необходимо использовать только СПФ эмбрионы, стоимость которых в несколько раз дороже обычных, а их производство в России не налажено.

Исходя из вышеизложенного, для изготовления ассоциированной вакцины использована культура клеток КФ и мезогенный штамм «М-ВНИИВВиМ», хорошо накапливающийся в этой клеточной системе.

Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения является «Вакцина против оспы птиц и способ ее изготовления» [7]. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и касается культуральной вакцины из аттенуированного штамма вируса оспы кур и способа ее изготовления. Вакцина имеет следующий состав, %: вируссодержащий материал из штамма "К" вируса оспы кур с биологической активностью вируса 7,0-7,5 lg ТЦД _50/мл или 4,0-4,5 lg ИД для птиц - 65,0-70,0; пептон - 5,7-7,0, лактоза - 5,7-7,0, буфер фосфатный - остальное. В вакцину добавляют антибиотики: пенициллин - 100-200 ЕД/мл и стрептомицин - 100-200 мкг/мл.

Способ изготовления этой вакцины заключается в следующем: суспензию трипсинизированных клеток кожи эмбрионов кур (КЭК) заражают вирусом оспы кур (штамм "К") и культивируют в течение 72-96 ч, после чего подвергают замораживанию - оттаиванию. Полученный вируссодержащий материал смешивают со стабилизатором, расфасовывают в ампулы и лиофилизируют.

Однако совместное культивирование вирусов ОП и НБ не получено, а соответственно и не разработана ассоциированная вакцина.

Целью настоящего изобретения является получение ассоциированной культуральной вирусвакцины против ньюкаслской болезни и оспы птиц, обладающей высокой иммуногенностью против этих заболеваний.

Указанная цель достигается тем, что вируссодержащий материал, полученный при совместном культивировании на культуре клеток куриных фибробластов, содержит вирус оспы птиц штамм «ВГНКИ-3» и вирус ньюкаслской болезни штамм «М-ВНИИИВВиМ», при этом содержание вируса в культуре клеток составляет 0,02-0,04 и 0,02-0,08 ТЦД/кл соответственно.

Используемый штамм "М-ВНИИВВиМ" вируса НБ не патогенен для цыплят. Инокуляция 20%-ной суспензии селезенки от павших цыплят в разведении 1·10^-3 вызывала гибель куриных эмбрионов через 60-84 часа. Штамм был идентифицирован как мезогенный. Инфекционный титр его составляет 8,5-9,0 lg ЭЛД _50/см³, а гемагглютинирующий титр - 1:256-1:512 (8,0-9,0 log₂).

После первых 6 пассажей вируса в клетках КФ наблюдается четко выраженное цитопатическое действие, вирус накапливается в титрах 6,5-7,0 lg ТЦД _50/см³ , а гемагглютинирующий титр увеличился с 1:4 в первом пассаже до 1:32 в шестом пассаже. Начиная с пятого пассажа, накопление вируса в клетках стабилизируется и составляет 6,5-7,0 lg ТЦД _50/см³, при гемагглютинирующем титре 1:16-1:32.

Используемый штамм «ВГИКИ-3» вируса ОП безвреден и ареактогенен для цыплят суточного возраста и старше. Инфекционная активность этого штамма колеблется в пределах 6,5-7,5 lg ТЦД ₅₀/см³, а на птице - 5,0-6,0 lg ИД ₅₀/см ³ или 3,0-4,0 lg ИД ₅₀/0,015 см ³ при заражении методом прокола перепонки крыла (Гуненков В.В. Чистова З.Я. и др. 1991, 1998 гг.).

Для адаптации штамма «ВГНКИ-3» вируса оспы кур к культуре клеток КФ проводят в ней несколько пассажей, применяя суспензионный вариант заражения. В чашки Карреля вносили суспензию культуры клеток КФ с последующим внесением вируссодержащего материала в разведении 1:10 (0,02 ТЦД₅₀/кл). Срок культивирования вируссодержащего материала составляет 6-7 суток. Ежедневно производится микроскопический контроль культуры клеток и контроль уровня рН среды (7,2-7,4). Вируссодержащий материал 3-го пассажа используют для совместного культивирования.

Одновременное культивирование вирусов ньюкаслской болезни и оспы птиц в культуре клеток КФ предполагает внесение вначале штамма «ВГНКИ-3» вируса ОП в дозе 0,02-0,04 ТЦД/кл., а затем штамма «М-ВНИИВВиМ» вируса НБ в дозе 0,02-0,08 ТЦД/кл., при ежедневном визуальном контроле. Использована питательная среда Игла с 10% сыворотки КРС и поддерживающая среда Игла с 2% сыворотки КРС. Когда поражение клеток монослоя достигает примерно 80% от общей площади, культивирование прекращают, а матрасы подвергают замораживанию при -20°С.

В качестве стабилизирующей среды использовали защитную среду на основе пептона, которую готовили согласно технологическому регламенту «Среда защитная (СПЛФ-жидкая)». Лиофильную сушку проводили по методике для культуральных вакцинных препаратов. Иммунизацию цыплят ассоциированной вакциной проводили внутрикожно (в перепонку крыла) по 0,015 см ³ стерильным двухигольным инъектором. Проверку напряженности иммунитета против НБ и ОП проводили путем контрольного заражения цыплят вирулентными штаммами этих вирусов на 21 сутки после вакцинации.

Пример 1. Для получения вакцины в качестве посевного вируса ньюкаслской болезни используют мезогенный штамм «М-ВНИИВВиМ», полученный на уровне 5-15 пассажей с инфекционным титром - 7,75 lg ТЦЦ ₅₀/см³ и гемагглютинирующим титром - 1:32, вирус оспы птиц штамм "ВГНКИ-3" третьего пассажа с инфекционным титром - 6,5 lg ТЦЦ ₅₀ /см.

При одновременном культивировании вирусов ньюкаслской болезни и оспы птиц в культуру клеток КФ вносят сначала штамм "ВГНКИ-3" в дозе 0,02 ТЦД/кл, а затем штамм «М-ВНИИВВиМ» в дозе 0,08 ТЦД/кл. При наступлении 80% ЦПД инфицированную культуру в матрасах замораживают и хранят при - 20°С до сушки.

В качестве стабилизатора используют защитную среду на основе пептона, которую готовили согласно технологическому регламенту «Среда защитная (СПЛФ-жидкая)».

Вируссодержащий материал смешивают с защитной средой в соотношении 1/1, разливают в ампулы по 1,0 см³ и проводят сушку на сублимационном аппарате, предварительно заморозив смесь до температуры минус 50°С. Камеру сублиматора предварительно обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом и готовят сублиматор по следующим параметрам:

- температура полок не выше минус 40°С;

- температура конденсатора не выше минус 70°С.

После загрузки камеры подключают датчик контроля температуры материала, камеру герметизируют и вакуумируют до остаточного давления 80-100 мм рт. столба. Затем включают циркуляционный насос, и в течение первых 10-14 часов сушки нагрев полок проводится за счет естественного нагрева до минус 20°С. Температура материала в течение первых 9-12 часов не должна превышать минус 30°С. Далее нагрев полок ступенчато (по 2-3 часа) повышают до минус 15, 10, 5 и плюс 5, 10 и 30°С. Конечная температура полок (+30°С) поддерживается в течение 3 часов, при этом температура материала не должна превышать 20°С.

Досушивание вакцины проводят при температуре материала плюс 15-20°С в течение 5 часов. Продолжительность сушки составляла 32 часа, при влажности готового продукта 2-3%.

Лиофилизированный препарат оценивают визуально, определяют влажность, стерильность, безвредность и иммуногенность для цыплят.

Контроль стерильности культуральной вакцины проводят на бактериальных средах: МПА, МПБ при 37°С и средах Сабуро при комнатной температуре в течение 10 суток. Материал считают стерильным и пригодным для дальнейшего применения, если видимых изменений в средах не выявлено

Контроль вакцины на безвредность проводят на 10 интактных цыплятах 60-суточного возраста. Для испытания используют 3 ампулы вакцины, из которых в стерильных условиях стерильным шприцем отбирают по 0,5 см препарата и объединяют их в одну пробу. Инъекцию проводят внутрикожно (в перепонку крыла) по 0,015 см³ двухигольным инъектором троекратно. За привитой птицей наблюдают в течение 10 суток.

Вакцина признана безвредной, т.к. все 10 цыплят в течение указанного времени остались живы, без клинических признаков переболевания и на месте введения вакцины выявлены оспины.

Для проверки иммуногенной активности вакцины используют 10 цыплят 60-суточного возраста, свободных от антител к вирусам НБ и ОП (после проверки их сывороток крови в РЗГА и РДП соответственно). Иммунизацию цыплят ассоциированной вакциной проводят внутрикожно (в перепонку крыла) по 0,015 см³ стерильным двухигольным инъектором, место введения вакцины дезинфицируют 70%-ным этиловым спиртом.

Эффективность антигена вируса НБ в ассоциированной вакцине определяют по титру антигемагглютинирующих антител к вирусу НБ в реакции задержки гемагглютинации (РЗГА). Титр антител у 90% вакцинированных цыплят через 21 сутки после вакцинации был выше, чем 1:16, а эффективность вируса определяли по наличию местной реакции на введение вакцины, которая была выявлена в месте введения вакцины на 5-7 сутки после вакцинации у 80% птицы.

Для проверки напряженности иммунитета против НБ провели контрольное заражение цыплят на 21 сутки после вакцинации вирулентным штаммом Т-53 вируса НБ. Всех цыплят, включая контрольную группу, заражали внутримышечно по 0,5 см³ в дозе 10 ⁵ ЭЛД 50. Наблюдение за птицей проводили в течение 10 дней. Цыплята контрольной группы погибли, а выживаемость среди вакцинированных составила 90%.

Проверку напряженности иммунитета против ОП также проводили путем контрольного заражения цыплят вирулентным штаммом на 21 сутки после вакцинации. Всех цыплят, включая контрольную группу, заражали штаммом «Кучинский» вируса ОП внутрикожно по 0,015 см³ в дозе 1000 ИД ₅₀. Наблюдение за птицей проводили в течение 15 дней. У цыплят контрольной группы выявлены клинические признаки, характерные для оспы птиц (оспины), а у вакцинированных в 80% случаев клиника не проявилась.

Литература

1. Дутко Ю.С. Аэрозольная вакцинация птиц одновременно против инфекционного ларинготрахеита, болезни Ньюкасла и оспы // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Покров, ВНИИВиМ, 1977.

2. Кадымов Р.А., Сафаров Ю.Б. / Ассоциированная и комплексная вакцинация птиц. // М.: «Колос», 1974, с.183-203.

3. Качахидзе А.В., и др. / Ассоциированная иммунизация против оспы и псевдочумы птиц. // Болезни птиц. Труды ВНИИБП, 118-125.

4. Сирии В.Н. Псевдочума птиц (ньюкаслская болезнь). - М.: 304 с.

5. Saini S.S., Sodhi S.S., Maiti N.K. and Sharma. Jmmume pesponse of chicks to oral vaccination against Neucastle disease and Foul pox. Comp. Jmmun. Microbiol. Infect. Dis. Vol.13, ¹1, рр.1-6, 1990.

6. Tripathy D.W., Cunningam C.H. /Avian Pox/ B кн. Diseaes of Poultry, 1984, p.524-534.

7. Гуненков В.В., Чистова З.Я., Кузнецова Г.Д., Яременко Л.И. Опыт создания противооспенных вакцин для овец кроликов и домашних птиц. Мат.международной н-п конференции поев. 40-летию ВНИИВВиМ, 1998, с.297-299.

8. Гуненков В.В., Чистова З.Я., Кузнецова Г.Д., Ходосевич Н.Ф. // Свойства сухой культуральной вакцины ВГНКИ против оспы птиц. // Ветеринария, №6, 1991, с.22-24.