способ определения активности лакказы базидиальных грибов

Формула изобретения

Способ определения активности лакказы базидиальных грибов, включающий инокуляцию мицелия базидиальных грибов на питательную среду, содержащую растительный источник углерода, агар и -нафтол, инкубирование, оценку результатов, отличающийся тем, что в качестве растительного источника углерода используют целлюлозу, питательная среда дополнительно содержит минеральные соли, количество -нафтола составляет 0,08-0,12 г/л, инкубирование проводят в течение трех суток и оценку активности проводят по линейным размерам появившихся на питательной среде окрашенных зон и интенсивности их окраски денситометрически.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способам исследования грибов, и может быть использовано для определения активности фермента лакказы мицелия базидиальных грибов при селекционном процессе.

Известен способ определения активности лакказы гриба Pleurotus ostreatus, включающий инокуляцию мицелиальной культуры гриба на жидкую питательную среду, культивирование на качалке глубинным методом в течение 14 суток, отфильтровывание культуральной жидкости, смешивание ее с дихлорфенолиндофенолом и спектрофотометрирование на 605 нм (Васильченко Л.Г., Карапетян К.Н., Ячкова С.Н. и др. Разложение лигноуглеводного субстрата почвенными грибами - продуцентами лакказы и целлобиозодегидрогеназы //Прикладная биохимия и микробиология, 2004, том 40, №1. с.51-56).

Недостатками данного способа являются его значительная трудоемкость и технологическая сложность выполнения данного способа, большой период культивирования мицелиальной культуры и большие объемы сред для культивирования, что увеличивает продолжительность выполнения анализа и материальные затраты.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ определения активности лакказы базидиальных грибов, включающий инокуляцию мицелия базидиальных грибов, на агар - солодовую питательную среду, содержащую -нафтол, инкубирование инокулированных чашек до образования окрашенных цветных пятен (Методы экспериментальной микологии. Справочник / под ред. В.И.Билай/ - Киев: Наукова думка, 1982. с.176).

Однако указанный способ не предусматривает возможности изучения динамики образования фермента мицелием базидиальных грибов в процессе роста.

Техническим результатом заявленного изобретения является упрощение технологического процесса определения активности лакказы базидиальных грибов, изучение свойств грибов на питательной среде с естественным источником углерода, сокращение продолжительности анализа и материальных затрат на реактивы и труд.

Поставленная задача достигается тем, что в способе определения активности лакказы базидиальных грибов, включающем инокуляцию мицелия базидиальных грибов на питательную среду, содержащую растительный источник углерода, агар и -нафтол, инкубирование, оценку результатов, питательная среда дополнительно содержит минеральные соли, количество -нафтол составляет 0,08-0,12 г/л, инкубирование проводят в течение трех суток и оценку активности проводят по линейным размерам, появившихся на питательной среде окрашенных зон и интенсивности их окраски денситометрически.

Новизна заявленного изобретения обусловлена введением в питательную среду целлюлозы в качестве источника углерода, что дает возможность исследовать активность лакказы базидиальных грибов на естественном источнике углерода, установлением оптимальной концентрации -нафтола, определение активности лакказы путем измерения линейных размеров и интенсивности окрашенных зон питательной среды денситометрически, инкубация проводится в течение 3 суток, а не 14 как в известных способах.

Сущность изобретения поясняется фотографией, где представлены окрашенные зоны в зависимости от активности лакказы.

Пример конкретного осуществления способа определения активности лакказы базидиальных грибов.

Мицелий изучаемого штамма гриба Pleurotus ostreatus инокулируют на агаризованную питательную среду следующего состава: в качестве источника углерода целлюлоза (измельченная фильтровальная бумага) - 5 г/л, минеральные соли, например (NH₄ )₂SO₄ - 4 г/л, КН ₂PO₄ - 0,5 г/л, MgSO ₄·7Н₂O - 0.3 г/л и -нафтол в концентрации 0,08-0,12 г/л. Данная концентрация -нафтола является оптимальной, что было установлено экспериментально. При увеличении концентрации происходит гибель мицелия, а при уменьшении концентрации образования цветных пятен на питательной среде не происходит. Также в питательную среду входит затвердитель - агар - 15 г/л. рН среды 5,5-6,0.

Инкубацию проводили в темноте в термостате при 25°С в течение трех суток. Оценку проводили на четвертые сутки, измеряя диаметр образовавшихся окрашенных зон на питательной среде и определяя интенсивность их окрашивания денситометрически. В течение трех суток мицелиальная колония разрасталась в радиальном направлении, образовывая окрашенные радиальные зоны. Среда под воздействием фермента лакказы, выделяемой грибом Pleurotus ostreatus, окрашивается в фиолетовый цвет (фото). Определение интенсивности окраски образующихся зон на питательной среде проводили денситометрически: получение изображения реверзума чашки Петри сканирующим цифровым устройством с последующей обработкой в программе Сорбфил Денситометр 1.4 на компьютере.

Использование предлагаемого изобретения позволяет снизить затраты труда и времени на проведение анализов по определению активности лакказы у базидиальных грибов, уменьшить расход реактивов, не требуется использования дорогостоящего оборудования, возможно проведение массового анализа. Но при этом сохраняется эффективность способа как и у известных способов определения лакказной активности базидиальных грибов: выявляются четкие различия в активности мицелиальных изолятов, сохраняется высокая воспроизводимость опыт, результаты представляются в численном выражении, кроме того, изучение возможно проводить в условиях, максимально приближенных к естественным. Эффективность способа иллюстрируется результатами исследований, представленными в таблице определения активности лакказы мицелия штаммов вешенки обыкновенной НК-35 и Львовский, а также монокариотических изолятов, полученных из них (см. таблицу)

Таблица. Зависимость активности лакказы от генотипа монокариотических изолятов гриба Pleurotus ostreatus (Вешенка обыкновенная)
№ изолята	Диаметр окрашенной зоны, мм	Результат денситомет рирования	№ изолята	Диаметр окрашенной зоны, мм	Результат денситомет рирования
Дикариотический НК-35 (St)	20,7	4370543	Дикариотический Львовский (St)	30	5270763
НК-2	15,7 +	2310056	Л1	25+	4453264
НК-5	13,3+	2290861	Л2	24,3 +	4207093
НК-6	22,3×	4500879	Л3	18,3	3179526
НК-7	16,7+	2468478	Л4	24,3 +	4329865
НК-8	16,3+	2156869	Л7	19,7 +	3432568
НК-9	22,3×	4370849	Л8	22,3+	4423568
НК-10	10 +	1115235	Л11	30×	5354367
НК-15	20,7×	4345274	Л12	5+	1013256
НК-16	21×	4263487	Л14	25,7 +	4586954
НК-17	25	4643254	Л19	27×	5234876
НК-18	6,7+	1145897	Л20	16+	2514446
НК-21	13+	2547823	Л25	13,3+	2265387
НК-23	20×	4210005	Л26	28,7 ×	5620788
НК-24	24,7	4573256	Л27	9,3+	1130650
НК-25	13,3+	2410574	Л28	17+	2795684
НК-26	23,3×	4519058	Л30	20 +	4035698
НК-27	10,5+	1253678	Л34	16,7 +	2510364
НК-28	27,7	5348421	Л35	21,3+	4270567
НК-29	18,7×	3156354	Л36	22+	4328697
НК-30	9+	1232265	Л38	10 +	1352468
НК-31	17+	2970345	Л39	19,7 +	4132564
НК-32	24,7	4310250	Л49	17+	2863547
НСР05	3,6		-	3,6
Обозначения: × - на уровне стандарта; - достоверно превышает стандарт; + - достоверно меньше стандарта.

В качестве стандарта (St) для осуществления способа определения активности фермента лакказы базидиальных грибов можно использовать любой ди- или монокариотический мицелий, сравнение с которым проводят. В нашем примере в качестве стандарта использовали два дикариотических мицелия штаммов НК-35 и Львовский, которые являются родительскими для исследуемых в примере монокариотических изолятов.

Использование данного способа определения активности лакказы базидиальных грибов на твердой агаризованной среде, содержащей целлюлозу, позволяет определять активность фермента лакказы живой мицелиальной культуры гриба в процессе роста и развития на питательной среде с естественным источником углерода. Сокращает продолжительность процесса, снижает материальные затраты и затраты труда.