способ морфометрической классификации ядрышек при предопухолевых и опухолевых гинекологических заболеваниях

Формула изобретения

Способ определения метрических параметров площадей ядрышек для различных классов «плоидности», отличающийся тем, что осуществляют компьютерную морфометрию препаратов, окрашенных для выявления ядрышковых организаторов азотнокислым серебром, причем анализу подвергают значения площадей ядрышек, расположенные в интервале 25 и 75% квартилей, при этом среднее значение наименьшего интервала площади ядрышек нормального эпителия принимается за величину, соответствующую диплоидному набору ДНК, на основе которого все другие средние значения интервалов пересчитываются в соответствующие классы «плоидности» ядрышек.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к гистологии, патогистологии, гинекологии и онкологии.

В последние годы в онкоморфологии широкую популярность приобрела аргирофильная реакция выявления активности ядрышковых организаторов рибосом (ЯОР). Это объясняется ее относительной простотой, высокой информативностью и возможностью последующего компьютерного анализа [Погорелов В.М., Байдурин С.А., Капланская И.Б. и др. // Морфометрические параметры злокачественных клеток при нелейкемических гемобластозах с первичным поражением лимфатических узлов // Гематология и трансфузиология. - 1992. - №3. - С.5-10].

Интенсивность аргирофилии прямо пропорциональна потенциальной активности ядрышка. Показателем активности ЯОР служит количество гранул AgNO₃, которое соответствует количеству функционирующих в клетке РНК-полимераз. Изменение состояния ядрышка и количества аргирофильных ЯОР является своеобразным маркером активности зон ядрышка и степени активности клетки в целом [McNicol A.M., Colgan J., McMeekin W., Teasdale G.M. Nucleolar organizer regions in pituitary adenomas // Acta Neuropfthol. - 1989. - Vol.77. - N 5. - P.547-549].

Количество аргирофильных белков, которые ассоциированы с рибосомальной ДНК, значительно варьирует в пределах клеточного цикла. Так, содержание нуклеолина минимально в G₁ фазе, а после вступления в S фазу оно возрастает в 1,6 раза, что приводит к увеличению геометрических параметров ядрышка [Sirri V, Roussel P, Hernandez-Verdun D. // Micron, 2000. Apr.; 31(2): 121-126.]. Другие авторы описывают удвоение размеров ядрышка между G₁ и G ₂ периодами, при этом их число увеличивается на 47% [De Angelis РМ, Stokke Т, Clausen OP. // Mol. Pathol. 1997. Aug; 50(4): 201-208].

Проведя визуальный морфометрический анализ, были показаны достоверные различия количества гранул серебра на 1 ядро между нормальным эктоцервикальным эпителием, с одной стороны, и дисплазией II-III степени и раком шейки матки с другой. Обнаружено также достоверное различие между средним количеством гранул серебра при дисплазиях II-III и раке in situ и инвазивным плоскоклеточным неороговевающим раком шейки матки. [Дядык Е.А., Василенко И.В., Смирнова Е.А. и др. Изучение аргирофильных белков ядрышкового организатора при дифференциальной диагностике дисплазий и рака шейки матки // Архив патологии. - 1993. - №5. - С.23-27].

Описательный характер морфологических исследований не во всех случаях достаточен для углубленного анализа сущности явлений, обобщений изучаемых процессов, оценки наблюдаемых изменений. В этой связи традиционные методы регистрации морфологических изменений, оставаясь базовыми, должны дополняться количественным анализом. Выявление ведущих диагностических признаков, меняющейся их величины и частоты их проявления и динамического характера связей между ними - основная задача количественной патологической морфологии [Автандилов Г.Г. Перспективы компьютерной гистоцитопатологии // Архив патологии. - 1993. - №2. - С.4-7].

В настоящее время известно довольно большое число научных публикаций, в которых процессы онкогенеза рассматриваются и анализируются с плоидометрических позиций - характеристики и классификации изменений содержания ДНК в ядрах при дисплазиях и озлокачествлении тканей [Автандилов Г.Г. Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистоцитопатологии. М.: РМАПО - 1996. - 256 с.].

Наиболее близким прототипом нашему предложению является работа А.А.Анисимовой и А.П.Анисимова [Основные результаты научных исследований в области естественных, гуманитарных и общественных наук. Клеточная биология. Распространение и свойства полиплоидных клеток в тканях моллюсков. [он-лайн]. Интернет:lemoi-www/dvgu/ru/unir/statistic/2004/Fo_2_Biolog/doc.], в которой авторы, используя последовательное окрашивание по Фельгену и азотнокислым серебром провели плоидометрические измерения ядер и морфометрические - ядрышек. Сопоставление результатов проводились путем совмещения изображений ядер и ядрышек. Авторами установлена зависимость параметров ядрышек от уровня плоидности ядер в ряду 2с-128с.

Однако недостатком данного подхода является его трудоемкость и то, что он требует двойного последовательного окрашивания и то, что не приводятся данные о морфометрических параметрах ядрышек с промежуточными (дробными) классами плоидности ядер.

Также следует отметить и то, что в доступной литературе нам не встретились морфометрические классификации ядрышек, отражающие динамику их изменений в процессе онкогенеза.

Задачей изобретения является разработка способа морфометрической классификации ядрышек связанной с плоидностью ядер.

Указанная задача решалась следующим образом. Гистологические препараты биопсий шейки матки 43 пациенток окрашивали для выявления ядрышковых организаторов 50%-ным раствором азотнокислого серебра. После этого препараты исследовали в компьютерном анализаторе изображений «Мекос» с определением морфометрических параметров ядерно-ядрышкового аппарата. В каждом случае измеряли от 40 до 50 клеток. Для сравнительной оценки динамики суммарной площади ядрышек в базальном слое многослойного плоского эпителия шейки матки использовали квартальный подход. Суть его состоит в том, анализу подвергаются значения площадей ядрышек, расположенные в интервале 25 и 75%% квартилей. Для 419 клеток нормального эпителия при среднем значении в 3,04 мкм ², нижняя граница квартиля составляла 2,37, а верхняя - 3,70 мкм². Для 382 клеток при дисплазии легкой степени эти величины составляли 3,84 мкм ² и 2,97-4,80 мкм² соответственно.

Как видно, нижние границы квартилей (2,37 и 2,97 мкм ²) у нормального эпителия и при легкой дисплазии очень близки. Поэтому они и были выбраны как точки отсчета для последующего анализа. Метрические параметры площадей ядрышек были преобразованы в условные единицы площадей (средние значения интервала площади относились к среднему значению наименьшего интервала для нормального эпителия, который был условно принят соответствующим диплоидному набору ДНК ядра). Подобная процедура была применена и в отношении других клинико-морфологических форм. В этом случае дополнительно использовались частотные характеристики интервалов, не дотягивающих до нижней границы квартиля этого эпителия. На основе частотных характеристик каждого интервала, преобразованного в условные единицы площади, были выстроены гистограммы, из которых видно качественное своеобразие распределения площади ядрышек для каждой клинико-морфологической формы.

ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Пример 1. Проанализировано распределение по классам «плоидности» ядрышек 1982 ядер ростковых зон нормального многослойного эпителия, при дисплазиях, раке in situ и инвазивном раке шейки матки. В нормальном эпителии доля ядрышек, имеющих «диплоидную» площадь, составляет около 60%. При легкой дисплазии (D I) площадь ядрышек в пределах 75% квартиля не превышает величину 4s. При тяжелой дисплазии (D II) в ростковой зоне многослойного эпителия шейки матки появляются ядрышки, превышающие величину «тетраплоидных» ядрышек. Доля таких ядрышек возрастает при раке in situ и особенно инвазивном (табл.1).

Пример 2. Проанализировано распределение по классам «плоидности» ядрышек 4142 ядер в цитологических препаратах нормального пролиферирующего эпителия эндометрия (НПЭ), при железистой гиперплазии (ЖГЭ), полипозе, аденоматозе и раке эндометрия (73 пациентки). Так в случаях НПЭ и ЖГЭ не определялись гипертетраплоидные ядрышки. При полипозе их число достигало 15,8%, при аденоматозе - 33,2%, а при раке эндометрия значительное число ядрышек соответствовало классам «плоидности» 4,3-7,1s (табл.2).

Преимущества предлагаемого по изобретению способа:

- дифференцированная оценка состояния ядрышкового аппарата при опухолевых заболеваниях органов репродуктивной системы женщин;

- оценка классов «плоидности» ядрышек ведется на основе геометрических показателей, а не яркостных, что позволяет с большей надежностью предполагать развитие онкопатологии эндометрия и шейки матки;

- простота в технике окрашивания гистологических срезов и мазков, не требует больших трудозатрат и дорогих реактивов.

Таблица 1. Распределение ядрышек (%) по классам «плоидности» в норме и опухолевых заболеваниях шейки матки.
Диагноз	Классы «плоидности» ядрышек
	2,0s	2,4s	3,6s	4,4s	5,2s	6,0s	6,8s	7,6s	8,4s
НМПЭ	59,9	40,1
Дисплазия л/ст.	24,1	35,7	40,2
Дисплазия т/ст.	5,9	17,8	40,7	35,6
Cr in situ	1,7	4,2	19,6	24,2	29,1	21,2
Cr invas	1,9	6,5	9,4	10,3	16,5	14,1	15,8	16,8	8,7
Примечание: НМПЭ - нормальный многослойный плоский эпителий.

Таблица 2. Распределение ядрышек (%) по классам «плоидности» в норме и опухолевых заболеваниях эндометрия.
Диагноз	Классы «плоидности» ядрышек
	2,0s	2,6s	3,1s	3,7s	4,3s	4,5s	5,4s	6,0s	6,5s	7,1s
НПЭ	46,2	23,1	30,5
ЖГЭ	41,3	36,1	22,5
Полипоз	23,2	22,4	21,2	17,4	15,8
Аденоматоз	33,7	15,5	17,8	19,8	18	15,2
Рак	3,7	5,2	10,4	9,6	11,5	14,8	18,1	7,8	10,3	8,5
Примечание: НПЭ - нормальный пролиферирующий эпителий; ЖГЭ - железистая гиперплазия эндометрия.