штамм вируса гриппа, гиск № 147, используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей

Формула изобретения

Штамм вируса гриппа, ГИСК №147, используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди взрослых и детей живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма А/17/Малайзия/04/11 (H3N2).

Известный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Панама/99/242 (H3N2) - прототип [Патент РФ №2248395 от 11.07.2003. - Опубл. БИ 2005. - №8] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, аналогичным вирусу А/Малайзия/01/04 (H3N2).

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма для производства живой гриппозной вакцины для взрослых и детей актуальной антигенной разновидности на основе современного эпидемического вируса А/Малайзия/01/04 (H3N2).

Целью изобретения было получение промышленно значимого актуального вакцинного штамма для производства живой гриппозной вакцины. Для его получения выбраны два родительских штамма вируса гриппа (influenza, orthomyxoviridae): штамм А/Малайзия/01/04 (H3N2), характеризующийся актуальной антигенной структурой, и штамм А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), безвредный для человека донор аттенуации. Актуальный эпидемический вирус А/Малайзия/01/04 (H3N2) является аналогом широко циркулировавшего во всем мире штамма А/Веллингтон/01/04 (H3N2) [Материалы ВОЗ, 2004-2005 гг.], что определило целесообразность получения вакцинного штамма на его основе. Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), характеризующийся устаревшей антигенной структурой, был ранее получен из эпидемического вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2) методом холодовой адаптации [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994, - 151 с.], в результате чего он стал безвредным для человека, т.е. приобрел способность бессимптомно размножаться в верхних дыхательных путях привитых лиц, вызывая выработку противовирусного иммунитета.

Методом получения вакцинного штамма А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) являлся метод генетической реассортации двух родительских вирусов [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол. - 1977. - №4, - с.387-395]. Для этого на первом этапе было осуществлено совместное заражение развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) родительскими вирусами, и после инкубации при 32°С в течение 48 часов в аллантоисной жидкости РКЭ содержалась смесь реассортантов, содержащих разные комбинации генов, унаследованных от исходных штаммов. Для селекции искомого реассортанта, содержащего два гена, кодирующих поверхностные антигены гемагглютинин и нейраминидазу - от актуального эпидемического вируса А/Малайзия/01/04 (H3N2), а шесть генов, кодирующих внутренние белки вириона, - от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), смесь вирусов после скрещивания обрабатывалась крысиной сывороткой к донору аттенуации, чтобы нейтрализовать реассортанты, содержащие поверхностные антигены от донора аттенуации, после чего вирусной смесью заражали РКЭ и инкубацию проводили при пониженной до 25°С температуре. При таких селектирующих условиях репродуцируются реассортанты, содержащие поверхностные антигены от эпидемического вируса, но близкие по биологическим свойствам холодоадаптированному донору аттенуации, т.е. содержащие его внутренние гены. После двух селективных пассажей вирусную смесь дважды клонировали в РКЭ методом предельных разведений, в результате чего были получены реассортанты, однородные по своей генетической структуре.

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали следующие методы:

а) Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), позволяющую определить принадлежность поверхностного антигена - гемагглютинина (НА) одному из родительских вирусов, для чего исследуемый вирус обрабатывается крысиными гипериммунными сыворотками против этих родительских вирусов. Подавление явления гемагглютинации при обработке одной из сывороток и будет говорить о том, от какого вируса унаследован ген гемагглютинина.

б) Метод рестрикционного анализа ДНК копий генов [Klimov A.I., Cox N.J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines // J.Virol. Methods, - 1995. - Vol.52. - №1-2. - P.41-49], основанный на амплификации относительно коротких участков РНК длиной около 150-300 нуклеотидов, включающих уникальные нуклеотидные последовательности, характерные только для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), но не для современных эпидемических вирусов гриппа. Обработку амплифицированных фрагментов ДНК производят специфическими рестриктазами с их последующим электрофорезом в 1,7%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидиума бромида. Это позволяет четко дифференцировать принадлежность генов исследуемых реассортантных штаммов к эпидемическому вирусу или донору аттенуации.

На чертеже в качестве примера представлена рестрикция ДНК-копии фрагмента гена РА эндонуклеазой Vsp I. 1-я дорожка - ДНК маркер молекулярного веса; 2-я и 6-я дорожки - кандидат в вакцинные штаммы А/17/Малайзия/04/11 (H3N2); 3-я и 5-я дорожки - эпидемический вирус А/Малайзия/01/04 (H3N2); 4-я дорожка - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). В РА гене донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) по сравнению с современными эпидемическими штаммами в позиции нуклеотида 107 имеется замена Т С, приведшая к аминокислотной замене лейцина эпидемических вирусов на пролин у донора аттенуации, который имеет на этом участке сайт рестрикции для экзогенной рестриктазы Vsp I. У эпидемических вирусов этот рестрикционный сайт отсутствует. Таким образом, обработка исследуемых фрагментов ДНК данным ферментом приводит к разрезанию амплифицированного участка гена РВ2 на два более мелких фрагмента, если он происходит от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). В случае РА гена от эпидемического вируса - расщепления не происходит.

Результаты рестрикционного анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) представлены в табл.1.

Полученный нами вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) в РТГА идентичен эпидемическому вирусу А/Малайзия/01/04 (H3N2), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Рестрикционным методом установлено, что вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) унаследовал как гены актуального штамма, так и гены донора аттенуации: все шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, M, NS) - от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); второй из двух генов, кодирующих поверхностные белки, - нейраминидазу (NA) - от эпидемического вируса А/Малайзия/01/04 (H3N2).

Оценку биологических свойств вакцинного штамма А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) проводили путем параллельного титрования вируса в РКЭ при разных температурах. Таким образом было показано, что вакцинный вирус является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 40°С составляет 7,5 lg ЭИД₅₀ /0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 25°С равна 3,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл), что свидетельствует о его безвредности, поскольку по этим показателям он аналогичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Оценку токсичности вакцинного штамма А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) определяли путем подкожного и внутрибрюшинного введения вирусного материала мышам. Для этого группе из 10 мышей (самцов линии СВА весом 18-20 грамм) вводили соответствующим способом 0,5 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости с титром 10⁶ lg ЭИД ₅₀/мл и оценивали патогенность вируса по проценту выживших мышей в течение 7 дней после введения вируса. Вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) в эксперименте на мышах оказался полностью безвредным - 100% мышей выжили в течение всего периода наблюдения.

В результате эксперимента получен штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2), депонированный в коллекции ГИСК им. Л.А Тарасовича под №147 и который имеет характеристики, представленные в паспорте штамма.

Характеристика штамма

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34°С в течение 48 часов - 8,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:1024.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Паспорт штамма

1. Название штамма - А/17/Малайзия/04/11 (H3N2)

2. Серия - серия 1

3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:

а). эпидемический вирус - А/Малайзия/01/04 (H3N2)

б). донор аттенуации - А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)

4. Количество пассажей - 5 в процессе реассортации

5. Характеристика штамма:

а). оптимальные условия репродукции - 33°С, 48 часов;

б). гемагглютинирующая активность-1:1024;

в). инфекционная активность - 8.5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

г). чувствительность к ингибиторам - ингибиторочувствительный в РТГА с нормальной лошадиной сывороткой;

д). разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 40°С - 7.5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

е). разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 25°С - 3.5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл.

ж). структура генома реассортанта:

- гены от эпидемического вируса - НА, NA

- гены от донора аттенуации - РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS

6. Характеристика штамма после лиофилизации:

а). дата лиофилизации - 03 февраля 2005 года;

б). объем материала в ампуле - 1.0 мл;

в). количество доз в серии - 4;

г). инфекционная активность - 7.5 lg ЭИД ₅₀/0.2 мл;

д). гемагглютинирующая активность - 1:256.

7. Рекомендуемое разведение при вакцинации - 1:2.

8. Антигенная специфичность

а). гемагглютинина - идентичен вирусу А/Малайзия/01/04 (H3N2) по данным РТГА с иммунной крысиной антисывороткой;

б). нейраминидазы - идентична вирусу А/Малайзия/01/04 (H3N2) по данным ПЦР-рестрикционного анализа ДНК-копий генов.

9. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении - безвреден.

10. Бактериологический контроль:

дата проведения - 03 февраля 2005 года

результат - стерилен.

11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют.

ШТАММ А/17/МАЛАЙЗИЯ/04/11 (H3N2) АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ДЕТЕЙ 3-14 ЛЕТ

До 2004 года реассортантные вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для детей и для взрослых готовили на двух разных донорах аттенуации. Вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для взрослых - на доноре аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994, - 151 с.], а вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для детей - на гиператтенуированном доноре А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994, - 151 с.]. В 2003 году Комитет медицинских иммунобиологических препаратов счел целесообразным рекомендовать «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую для взрослых» для иммунизации детей в возрасте 3-6 лет с внесением соответствующих изменений в «Инструкцию по применению» препарата [Инструкция по применению вакцины гриппозной аллантоисной интраназальной живой сухой. Утверждена Главным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 16.06.2004].

В этой связи нами была изучена реактогенность вакцинного штамма А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) на детях в возрасте 3-14 лет.

Пример 1. Группу из 21 ребенка в возрасте 3-14 лет вакцинировали интраназально в объеме 0,5 мл реассортантным вакцинным штаммом А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД₅₀/мл в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 16 человек получила плацебо. Результаты исследований приведены в табл. 2.

В группе вакцинированных детей сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С не наблюдались. Средние реакции в диапазоне 37,6-38,5°С наблюдались у одного ребенка (4,8% случаев). Слабые температурные реакции с кратковременным повышением температуры до 37,5°С были отмечены также в 4,8% случаев.

В группе детей, получивших плацебо, сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С и слабые температурные реакции (37,1-37,5°С) не наблюдались. Средние температурные реакции в диапазоне 37,6-38,5°С отмечены у одного ребенка (6,3% случаев).

Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%.

Таким образом, испытания на детях подтвердили, что вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 от 26.03.2003 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.

На основе вышесказанного предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа может быть использован в производстве живой гриппозной вакцины для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста, что подтверждают результаты изучения его реактогенности для детей в возрасте 3-14 лет.

Таблица 1
Перечень праймеров и рестриктаз, использованных для изучения состава генома реассортантного вакцинного штамма А/17/Малайзия/04/11 (H3N2), полученного на основе эпидемического вируса А/Малайзия/01/04(Н3М2) и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)
Ген	Нуклеотид	Название и нуклеотидная последовательность праймеров (F - прямой праймер; R - обратный праймер)		Рестриктаза	Рестрикция
					ЭВ	ДО	ВШ
РВ2	1459	PB2F-1374	5'GGGAATTGAACATATCGA	Mse I	НЕТ	ДА	ДА
		PB2R-1614	5'TATTGTCAGTTTCTCTGT
РВ1	819	PB1F-740	5'GAGCAATTGCAACACCCG	Hind III	ДА	НЕТ	НЕТ
		PB1R-1044	5'TGCGATGCTCAGGACGTT
PA	1045	PAF-900	5'TGAGGACCCAAGTCACGA	Vsp I	НЕТ	ДА	ДА
		PAR-1077а	5'CTCATTCTCAATGTCCTGCAGTTCTGCCATTA
NP	1066	NPF-886	5'TATGGACCTGCCGTAGCC	EcoR I	НЕТ	ДА	ДА
		NPR-1200	5'GTACCTGCTTCTCAGTTC
NA	77	NAF-14	5'AAGATGAATCCAAATCAA	Mse I	НЕТ	ДА	НЕТ
		NAR-775	5'AGTATCGGCTCTTCCTGATGC
M	969	MF-785	5'CCCTCTTGTTGTTGCCGC	Tsp 509 I	НЕТ	ДА	ДА
		MR-1001	5'CAGCTCTATGCTGACAAA
NS	798	NSF-673	5'CAAAACAGAAACGGAAAA	Cac 8 I	ДА	НЕТ	НЕТ
		NSR-890	5'AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTATCATTAA
ОБОЗНАЧЕНИЯ: ЭВ -эпидемический вирус А/Малайзия/01/04 (H3N2), ДО - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), ВШ - вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2); «ДА» - амплифицированная ДНК копия фрагмента РНК эпидемического вируса или донора аттенуации рестрицируется соответствующим ферментом; «НЕТ» - амплифицированная ДНК копия фрагмента РНК эпидемического вируса или донора аттенуации не рестрицируется соответствующим ферментом

Таблица 2
Реактогенность вакцинного штамма А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) для детей 3-14 лет
Препарат	Число обследуемых	Показатель	Температурные реакции(в °С)			Показатель реактогенности, %
			Слабые (37,1-37,5°С)	Средние (37,6-38,4°С)	Сильные ( 38,5°С)
Вакцина	21	абс.ч.	1	1	0	0
		%	4,8%	4,8%	0
Плацебо	16	абс.ч	0	1	0
		%	0	6,3%	0