способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) при микоплазмозе крупного рогатого скота

Формула изобретения

Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемаглютинации (РНГА) при микоплазмозе крупного рогатого скота, состоящий из дробной формалинизации эритроцитов барана и сенсибилизации их микоплазмозным антигеном при 70°С в течение 30 мин, отличающийся тем, что для сенсибилизации используют эритроциты без предварительной их танизации, которые нагружают сенситином, полученным из смеси в равных пропорциях культур микоплазм М. bovoculi, М. argenini и Ureaplasma sp., прогретым на водяной бане при 70°С в течение 30 мин, затем трехкратно отмывают полученный диагностикум без добавления к нему на последнем этапе приготовления 0,4%-ной нормальной кроличьей сыворотки.

Описание изобретения к патенту

Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) относится к методам лабораторной диагностики микоплазмозов и может быть использован в ветеринарной медицине.

Известны способы получения эритроцитарных диагностикумов, ранее используемые для РНГА при сальмонеллезе, пастереллезе животных, описанные в рефератах российских патентных документов за 1994-2007 г.г. (№№2257581, 2005.07.27, 95117746, 1997.10.10) и микоплазмоза свиней (Андросик, Н.Н. // Ветеринария, 2000 №3).

Однако известные способы обладают следующими недостатками:

1. проводится танизация,

2. сложные и неэкономичные методы фиксации и сенсибилизации эритроцитов сенситином.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является бруцеллезный эритроцитарный диагностикум (Красиков, А.П. Новые механизмы искусственной регуляции паразито-хозяинных отношений: дис... доктора вет.наук.: 16.00.03. / А.П.Красиков; - Новосибирск - 1996. - С.97-101), который готовится по следующей схеме:

1. В качестве клеточной основы для приготовления диагностикума применяются эритроциты барана. При формалинизации эритроцитов используется свежая дефибринированная кровь барана-донора, которую разводят 1:1 буферным физиологическим раствором рН 7,2 (0,137 М хлористый натрий и 0,001М двузамещенный фосфорнокислый калий на 1 литр дистиллированной воды).

Фиксацию эритроцитов проводят по методу Фили в модификации Красикова А.П., которая заключается в более щадящем способе воздействия р-ра формальдегида на эритроциты и одновременно обеспечивающая хорошую их фиксацию. Для чего к 100 мл разведенной крови р-р формальдегида добавлялся не сразу, а порциями в возрастающих объемах через определенный промежуток времени.

Так, к 100 мл 50% взвеси эритроцитов барана добавляют 20%-ный р-р формальдегида порциями в возрастающих объемах через каждые 15 минут: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. После каждого внесения смесь перемешивают на водяной бане при 70°С до получения темно-коричневого цвета. Взвесь эритроцитов 4-кратно отмывают фосфатно-буферным раствором рН 7,2 путем центрифугирования при 3000 об/мин 2-5 мин и ресуспендируют в 400 мл того же буфера. Из осадка готовят 10% рабочую взвесь на буферном физиологическом растворе, содержащем 0,3% 20%-ного формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты сохраняют свои сорбционные свойства в течение 5 лет.

2. Вторым этапом конструирования эритроцитарного диагностикума является необходимость получения антигена, который бы обладал способностью адсорбироваться на эритроцитах. С этой целью используется глубокодиссоциированный вакцинный штамм В. abortus 16/4. Антиген готовят по методике ВНИИБТЖ - ИЭВСиДВ (Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных - Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока) (Науч. техн. бюлл./ ИЭВСиДВ, 1981, вып.33. С.6-13). Для этого девитализированную бактериальную массу центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20-30 минут, надосадочную жидкость сливают, а на сырую бактериальную массу воздействуют расплавленным концентрированным фенолом (ХЧ) в соотношении 1:1.

Бактериальную массу с фенолом выдерживают 30-40 мин при Т 80-85°С на водяной бане. Затем добавляют дистиллированную воду, нагретую до 70°С, в таком количестве, чтобы остаточная концентрация фенола в растворе составила 5%. После фильтрации смеси проводят ее диализ при комнатной температуре в целлофановых мешочках против десяти объемов дистиллированной воды в течение 48 часов. Диализатат используют в качестве антигена.

3. Танизацию эритроцитов исключают из цикла приготовления эритроцитарного диагностикум в связи с низким содержанием белка в полученном антигене.

Для нагрузки формалинизированных эритроцитов бруцеллезный антиген разводят 1:10 буферным раствором с рН 6,4. Данной дозой антигена сенсибилизируют эритроциты в соотношении 2:1 (2 объема антигена, 1 объем эритроцитов). Сенсибилизация проводится на водяной бане при температуре 70°С в течение 30 мин при перемешивании взвеси через каждые 5 мин. За 10 мин до конца сенсибилизации для закрепления сенситина на эритроцитах добавляют 1%-40% р-ра формальдегида. Полученный эритроцитарный диагностикум трехкратно отмывают буферным раствором с рН 7,2 с добавлением отрицательной на бруцеллез нормальной кроличьей сыворотки в соотношении 1:250 путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 минут и доводят тем же буфером до 3%-ной концентрации эритроцитов с добавлением 1% формалина с целью закрепления антигена на эритроцитах.

Целью нашего изобретения является получение микоплазмозного эритроцитарного диагностикума для выявления антител в сыворотке крови исследуемых животных.

Поставленная цель достигается при соблюдении ряда приемов:

1. дробная формалинизация эритроцитов барана,

2. получение антигена из трех культур микоплазм (М. bovoculi, M. argenini и Ureaplasma sp.) путем прогревания их на водяной бане при Т 70°С в течение 30 мин, механического смешивания в равных пропорциях и концентрации центрифугированием,

3. сенсибилизация формалинизированных эритроцитов барана без предварительной танизации смесью трех микоплазмозных антигенов при 70°С в течение 30 мин с последующим трехкратным отмыванием эритроцитарного диагностикума буферным раствором с рН 7,2 без добавления нормальной кроличьей сыворотки.

Описание метода:

1. При формалинизации (фиксации) эритроцитов используют свежую дефибринированную кровь барана-донора, которую разводят 1:1 буферным физиологическим раствором рН 7,2 (0,137 М NaCl и 0,001 М двузамещенный фосфорнокислый калий на 1 л дистиллированной воды). Фиксацию эритроцитов проводят по методу Фили в модификации Красикова А.П.

К 100 мл 50% взвеси эритроцитов барана добавляют 20%-ный раствор формальдегида порциями в возрастающих объемах, через каждые 15 минут: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. После каждого внесения смесь перемешивают на водяной бане при 70°С до получения темно-коричневого цвета. Взвесь эритроцитов 4-кратно отмывают фосфатно-буферным раствором рН 7,2, путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 2-5 мин и ресуспензируют в 400 мл того же буфера. Из осадка готовят 10% рабочую взвесь на буферном физиологическом растворе, содержащем 0,3%-20%-ного р-ра формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты сохраняют свои сорбционные свойства в течение 5 лет.

2. В качестве сенситинов используются корпускулярные антигены микоплазм (М. bovoculi, M. argenini и Ureaplasma sp.). Микоплазмы выращивают на трех жидких питательных средах: глюкозоферментирующих, аргенинферментирующих и уреаплазмозных, разработанных Омским НИИ природно-очаговых инфекций совместно с ИВМ ОмГАУ, описанных Новиковой Н.Н. (Н.Н.Новикова. Экспресс-методы диагностики ассоциативного микоплазмоза плотоядных: дис. канд. вет. наук, Новосибирск - 2002. С.37-55).

Культуры микоплазм освобождают от питательных сред путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение одного часа. Осадки трех культур после трехкратного ресуспензирования и последующего центрифугирования смешивают в равных количествах и разводят 1:10 физиологическим р-ром. Полученный антигенный препарат прогревают на водяной бане при 70°С в течение 30 мин и используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов

3. Для нагрузки формалинизированных 3% эритроцитов их сенсибилизируют в соотношении 2:1 (2V антигена: IV эритроцитов). Сенсибилизацию проводят на водяной бане при температуре 70°С в течение 30 мин при перемешивании взвеси через каждые 5 минут. За 10 минут до конца сенсибилизации для закрепления сенситина на эритроцитах добавляют 1% - 40% р-ра формальдегида.

Эритроциты, нагруженные антигеном, трехкратно отмывают от несвязавшихся сенситинов фосфатно-буферным солевым раствором с рН 7,2 путем центрифугирования при 3000 об/мин, ресуспендируют в этом же р-ре, доводя до первоначальной 3% концентрации и используют для постановки РНГА макрометодом в объеме 0,5 мл на полистироловых планшетах.

Испытуемые сыворотки после освобождения от неспецифических гемагглютининов после инактивации в течение 20 мин при 56°С разводят в двукратной последовательности фосфатно-буферным раствором (рН 6,4), начиная с 1:10. К каждому разведению добавляют по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, тщательно перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 1,5-2 часа. Реакция оценивается по четырехкрестной системе. Конечным титром считают последнее разведение сыворотки, дающее гемагглютинацию на три креста.

Определены специфичность и активность трех серий (С-1 - С-3) микоплазмозного эритроцитарного диагностикума (МЭД) в РНГА (табл.1, 2).

Преимущество данного эритроцитарного диагностикума в специфичности и активности в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при микоплазмозе крупного рогатого скота.

Контроль на специфичность МЭД в РНГА

Для контроля специфичности полученных серий микоплазмозных эритроцитарных диагностикумов ставят РНГА с гетерологичными сыворотками. В титре 1:10 МЭД в РНГА вызывает перекрестные реакции с бруцеллезной, лептоспирозной, сальмонеллезной, и хламидиозной гетерологичными сыворотками, тогда как в последующих разведениях РНГА отрицательная при четко выраженных положительных реакциях с гомологичными микоплазмозными сыворотками. Поэтому за диагностический (патологический) титр принимается разведение сыворотки 1:20 и выше (табл.1).

Таблица. 1.
Специфичность МЭД в РНГА.
МЭД	Стандартные диагностические сыворотки						Микоплазмозные сыворотки
							Г	А	У
	бруц.	лепт.	лист.	ПВ	сальм.	хлам.	1/20	1/20	1/20
С-1	-	-	-	-	-	-	++++	++++	++++
С-2	-	-	-	-	-	-	++++	++++	++++
С-3	-	-	-	-	-	-	++++	++++	++++
Примечание: бруц. - бруцеллезная; лепт.- лептоспирозная; лист.- листериозная; ПВ -против пустулезного вульвовагинита; сальм. - сальмонеллезная; хлам. - хламидиозная; Г - глюкозоферментирующая - M.bovoculi, А - аргининферментирующая - M.argmini, - Ureaplasma sp.

Контроль на активность МЭД в РНГА.

Для контроля активности полученного эитроцитарного диагностикума проводят постановку РНГА. Реакцию ставят макрометодом в объеме 0,5 мл в полистироловых пластинках с микоплазмозными (Г, А, У - сыворотками) и смешанной (Г+А+У) микоплазмозными сыворотками в разведениях 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320. В качестве разбавителя применяют фосфатный буфер с рН 6,4, так как при разведении исследуемой сыворотки этим буфером результаты реакции более демонстративны, чем при применении физиологического раствора. В качестве контроля используют фосфатный буферный раствор (ФБР) рН 6,4 и заведомо отрицательную на микоплазмоз сыворотку крупного рогатого скота в разведении 1:10.

С микоплазмозными сыворотками по отдельности и со смешенной сывороткой против трех видов микоплазм полученный диагностикум реагирует на три креста до разведения 1:80, на два креста 1:160. С отрицательной сывороткой сомнительная реакция на два креста отмечается в первом разведении. В контроле с буферным раствором отрицательная реакция наблюдается во всех разведениях (табл.2.).

Таблица 2.
Активность (МЭД) в РИГА.
Титр сывор	Микоплазмозные сыворотки			Г+А+У-сыворотка	Негативная сыворотка	ФБР
	Г	А	У
1:10	++++	++++	++++	++++	++	-
1:20	++++	++++	++++	++++	-	-
1:40	++++	++++	++++	++++	-	-
1:80	++	++	++	+++	-	-
1:160	+	-	-	++	-	-
1:320	-	-	-	-	-	-