устройство многоразового использования для гибридизации нуклеиновых кислот и его применение

Формула изобретения

1. Устройство многоразового использования, предназначенное для проведения реакции гибридизации нуклеиновых кислот (НК), отличающееся тем, что оно содержит:

компартмент для однонитчатой НК, состоящей из повторяющейся последовательности нуклеотидов, которая способна присоединять к себе однонитчатую НК-пробу с образованием двунитчатой структуры - НК-носитель;

компартмент для НК-мишени;

НК-носитель, заключенный в компартмент для НК-носителей, при этом указанный компартмент содержит жидкость, которая контактирует с жидкостью, находящейся в компартменте для НК-мишеней;

перегородку, проницаемую для однонитчатых НК-проб и непроницаемую для НК-носителей и НК-мишеней, при этом указанная перегородка отделяет компартмент для НК-носителей от компартмента для НК-мишеней;

устройство, пригодное для перемещения указанных НК-проб из указанного компартмента для НК-носителей в указанный компартмент для НК-мишеней и обратно.

2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что, по крайней мере, один из указанных компартментов для НК-носителей и для НК-мишеней содержит гель.

3. Устройство по п.1, отличающееся тем, что указанный НК-носитель находится в компартменте для НК-носителей в одном из следующих видов: иммобилизован на поверхности геля, погружен внутрь геля, комбинация двух предыдущих состояний.

4. Устройство по п.1, отличающееся тем, что указанный компартмент для НК-носителей и указанный компартмент для НК-мишеней содержат электроды, которые создают электрическое поле между этими компартментами.

5. Устройство по п.4, отличающееся тем, что компартмент для НК-носителей и указанный компартмент для НК-мишеней содержат дополнительные электроды, создающие электрическое поле внутри указанного компартмента.

6. Устройство по п.1, отличающееся тем, что указанное устройство для перемещения НК-проб представляет собой насос, перемещающий жидкость между указанными компартментами для НК-носителей и НК-мишеней.

7. Устройство по п.1, отличающееся тем, что содержит множество пар, соединенных друг с другом указанных компартментов для НК-носителей и НК-мишеней, расположенных в виде плоского тела.

8. Устройство по п.1, отличающееся тем, что содержит множество пар, соединенных друг с другом указанных компартментов для НК-носителей и НК-мишеней, расположенных в виде трехмерного тела.

9. Способ сравнения двух последовательностей нуклеиновых кислот (НК), определяемых как НК-проба, НК-мишень и однонитчатая НК, которая состоит из повторяющейся последовательности нуклеотидов и которая способна присоединять к себе однонитчатую НК-пробу с образованием двунитчатой структуры - НК-носитель, методом гибридизации, характеризующийся тем, что проводится при наличии двух компартментов № 1 и № 2, которые разделены перегородкой и содержат жидкость, позволяющую перемещать НК-пробу сквозь перегородку, и включает следующие этапы:

гибридизацию НК-пробы комплементарной НК-мишени с таким НК-носителем, которому НК-проба комплементарна, и получение таким образом двунитчатого комплекса НК-пробы с НК-носителем;

помещение двунитчатого комплекса НК-пробы с НК-носителем в компартмент № 1, ограниченный стороной 1 перегородки, которая имеет сторону 1 и сторону 2, ограничивающую компартмент № 2, и является проницаемой для указанной НК-пробы и непроницаемой для указанного НК-носителя и указанного комплекса НК-пробы с НК-носителем;

помещение однонитчатой НК-мишени в компартмент № 2, ограниченный стороной 2 перегородки, имеющей сторону 1 и сторону 2, и проницаемой для указанной НК-пробы и непроницаемой для указанной НК-мишени;

денатурацию указанного комплекса НК-пробы с НК-носителем и возвращение всех копий указанной НК-пробы в компартмент № 1;

обеспечение возможности прохождения указанной НК-пробы сквозь указанную перегородку со стороны 1 на сторону 2 указанной перегородки;

обеспечение контакта комплементарной НК-мишени с указанной НК-пробой в компартменте № 2;

обеспечение таких условий гибридизации, при которых указанная НК-проба будет иметь возможность гибридизоваться с комплементарной НК-мишенью с образованием комплекса НК-пробы с НК-мишенью;

обеспечение возможности перемещения НК-проб, негибридизованных с НК-мишенью на сторону 1 перегородки в компартмент № 1 после обеспечения условий для гибридизации указанных проб с комплементарной НК-мишенью;

обеспечение возможности гибридизации указанной НК-пробы с указанным НК-носителем в компартменте № 1 после возвращения указанной пробы из компартмента № 2 сквозь указанную перегородку;

определение комплементарности указанной НК-пробы и указанной НК-мишени путем определения, является ли указанная НК-проба частью комплекса НК-пробы с НК-мишенью в компартменте № 2 или НК-пробы с НК-носителем в компартменте № 1.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что проводят денатурацию указанного комплекса НК-пробы с НК-мишенью и возвращение всех копий указанной НК-пробы на сторону 1 указанной перегородки и образование комплекса НК-пробы с НК-носителем.

11. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанная НК-проба мигрирует сквозь указанную перегородку со стороны 1 на сторону 2 и обратно вместе с потоком жидкости.

12. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанная НК-проба мигрирует сквозь указанную перегородку со стороны 1 на сторону 2 и обратно, используя электрическое поле, которое проходит сквозь указанную перегородку за счет разности электрических потенциалов по обе стороны указанной перегородки.

13. Способ по п.9, отличающийся тем, что комплекс НК-носителя с НК-пробой детектируют флуоресцентными методами после того, как обеспечивают условия для гибридизации и образования комплекса НК-пробы с НК-мишенью.

14. Способ по п.9, отличающийся тем, что комплементарная НК-мишень иммобилизована на парамагнитной частице.

15. Способ по п.9, отличающийся тем, что комплементарная НК-мишень погружена внутрь гелеобразной среды.

16. Способ по п.9, отличающийся тем, что комплементарная НК-мишень несет на себе какую-либо метку, которую можно обнаружить внешним детектором.

17. Способ по п.9, отличающийся тем, что все шаги, описанные в п.9, происходят одновременно во множестве изолированных друг от друга компартментах, каждый из которых содержит один вид НК-пробы, отличающийся от НК-проб в остальных компартментах.

18. Способ копирования множества изолированных друг от друга камер, содержащих электрод для электрофореза, гель и копии однонитчатой нуклеиновой кислоты, состоящей из повторяющейся последовательности нуклеотидов, которая способна присоединять к себе однонитчатую НК-пробу с образованием двунитчатой структуры, включающий:

копирование нуклеиновой кислоты с образованием множества копий в компартменте, содержащем гель и электрод;

контактирование указанного компартмента с другим компартментом, содержащим гель и электрод;

обеспечение электрофоретического перемещения части копий указанной НК из одного указанного компартмента в другой указанный компартмент;

разъединение указанных компартментов.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанная нуклеиновая кислота является однонитчатой нуклеиновой кислотой, состоящей из повторяющейся последовательности нуклеотидов, которая способна присоединить к себе однонитчатую НК-пробу с образованием двунитчатой структуры.

20. Способ по п.18, отличающийся тем, что во втором указанном компартменте после разделения устройств осуществляют амплификацию тех копий НК, которые были перемещены из первого указанного компартмента.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что амплификацию НК выполняют с помощью полимеразной цепной реакции.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к процессам и аппаратам для сепарации, изоляции или обнаружения нуклеиновых кислот и в особенности имеет отношение к процессам и аппаратам, пригодным для регенерации устройств многоразового использования для гибридизации нуклеиновых кислот, далее биочипов или ДНК-чипов.

Гибридизационные ДНК-чипы представляют собой твердый носитель, например стекло, полимерный материал, кремний, на поверхности которого упорядоченно расположены зоны, в каждой из которых иммобилизовано множество копий определенных последовательностей ДНК.

Наиболее важной особенностью технологии ДНК-чипов или биочипов с точки зрения практической пользы является возможность анализа большого количества молекул ДНК или РНК в смеси на наличие уникальных последовательностей.

Современное развитие техники биочипов позволяет определять, какие гены работают в данной клетке на какой-либо стадии развития, а какие находятся в неактивном состоянии. Например, с помощью экспрессионных микрочипов установлены гены, принимающие участие в регуляции цикла деления клеток дрожжей, а также процессов метаболизма в бактерии Escherichia coli.

В разработанных экспрессионных микрочипах используют иммобилизованную ДНК двух типов: во-первых, относительно короткие ген-специфичные фрагменты ДНК длиной 20-25 нуклеотидов, например, олигонуклеотидные микрочипы фирмы Affymetrix; во-вторых, крупные фрагменты кодирующей ДНК длиной 300-500 нуклеотидов, получаемые в результате клонирования, ПЦР (полимеразная цепная реакция) - амплификации и очистки ДНК.

При использовании ДНК-чипов можно одновременно следить за изменением десятков тысяч генов в процессе развития клеток и тканей при различных физиологических и патологических ситуациях, при воздействии терапевтических средств и токсинов. Выявление четких маркеров патологии на уровне экспрессии генов и разработка диагностических ДНК-чипов - одна из приоритетнейших задач медико-биологических исследований. Работа над ней может способствовать решению ряда важнейших проблем здравоохранения.

К сожалению, дороговизна и сложность затрудняют использование этой техники.

Изобретение решает задачу разработки простых, недорогих и более доступных методов работы с ДНК-пробами, характеризующими определенные гены, чем работа с современными ДНК-микрочипами.

Предложен процесс идентифицикации нуклеиновой кислоты (НК), комплементарной другой НК. Процесс включает гибридизацию НК-пробы с носителем НК-пробы для того, чтобы сформировать единый комплекс НК-пробы с носителем НК-пробы.

Указанный комплекс помещают в компартмент (отсек, камеру), ограниченный с одной стороны перегородкой, выполненной из материала, проницаемого для НК-пробы и непроницаемого для указанного носителя НК-пробы и указанного комплекса.

Затем указанный комплекс денатурируют и НК-пробу транспортируют сквозь перегородку и приводят в контакт с НК-мишенью. В условиях гибридизации НК-проба гибридизуется с комплементарной НК-мишенью, в результате чего получается двунитчатый комплекс НК-проба - НК-мишень. НК-пробы, которые некомплементарны НК-мишени и по этой причине с ней не связаны, возвращают обратно в исходный компартмент, где обеспечивают условия, в которых указанные НК-пробы гибридизуются обратно на носитель НК-пробы.

Обнаружение комплексов НК-пробы как с НК-мишенью, так и с носителем НК-пробы используют для того, чтобы определить комплементарность НК-пробы к НК-мишени.

Предложенный НК-гибридизационный чип (устройство) многоразового использования содержит канал. Указанный канал имеет компартмент, в котором находится носитель НК-пробы. Канал обеспечивает контакт жидкостей, которые находятся в отсеке для НК-мишени и в отсеке для носителя НК-пробы. Указанные отсеки отделены от канала перегородками, проницаемыми для НК-пробы и непроницаемыми для НК-мишени и носителя НК-пробы. Носитель НК-пробы не может выйти за пределы компартмента, в котором он находится.

Устройство избирательно перемещает однонитчатую НК-пробу между указанными компартментами, содержащими НК-мишень и носитель НК-пробы.

Предложен также процесс копирования описанных в данном изобретении гибридизационных НК-чипов многоразового использования. Внутри камеры, заполненной гелем и содержащей, по крайней мере, один электрод для электрофореза, создают множество копий молекулы НК. После этого камеру контактируют с другой подобной камерой, содержащей, как минимум, один электрод. Прикладывая электрическое поле, обеспечивают переход части копий НК из указанной первой камеры в указанную вторую камеру. После разделения камер получают две камеры, содержащие копии НК. Изобретение позволяет таким образом одновременно копировать множество изолированных друг от друга камер.

Сущность изобретения далее детализирована с помощью следующих чертежей, которые иллюстрируют конкретные варианты воплощений настоящего изобретения. Они не предназначены для того, чтобы ограничить изобретение, описанное выше, а скорее обеспечить иллюстрацию по существу заявляемых пунктов формулы изобретения.

Краткое описание.

Фиг.1(a)-(p) - схематически и по шагам показывают последовательность работы предложенных НК-чипов с подвижными НК-пробами;

Фиг.2 - схематически изображает многоканальный НК-чип, предложенный в настоящем изобретении;

Фиг.3(a)-(d) - схематически показывают в поперечном сечении различные варианты воплощения НК-чипа, содержащего множество электрофоретических камер, предложенные в настоящем изобретении;

Фиг.4 - показывает схематически ряд камер с разводкой проводов, обеспечивающих электрический контакт с каждой парой электродов;

Фиг.5 - представляет собой разнесенный вид комбинации пластин, которые в совокупности формируют НК-чип, содержащий такие электрофоретические камеры, как показанные на Фиг.4;

Фиг.6(a)-(d) - схематически показывают последовательные шаги процедуры копирования НК-чипов, в результате которой происходит перемещение молекул нуклеиновой кислоты из исходного НК-чипа в его копию;

Фиг.7(a)-(r) - схематически показывают последовательные шаги диагностики с использованием такого электрофоретического варианта НК-чипа, предложенного в настоящем изобретении, в котором камеры, содержащие как НК-носители НК-пробы, так и камеры, содержащие НК-мишени, частично или полностью заполнены гелем.

Детальное описание предпочтительных вариантов изобретения.

Существующие НК-чипы можно подразделить на следующие два вида. ДНК-чипы, на поверхности которых ДНК-пробы организованы в виде пятен. Внутри каждого такого пятна однонитчатые ДНК молекулы иммобилизованы одним концом на поверхности НК-чипа. Второй тип НК-чипов это олигонуклеотидные чипы, на поверхности которых иммобилизованы относительно короткие олигонуклеотиды.

Оба типа НК-чипов используют так, что НК-мишень гибридизуют с НК-пробой непосредственно на поверхности НК-чипа. С точки зрения функциональной роли молекул НК, вовлеченных в процедуру диагностики, современные методы используют только два типа молекул нуклеиновой кислоты: НК-пробы и НК-мишени.

Настоящее изобретение вводит третий тип молекулы нуклеиновой кислоты, а именно такой носитель однонитчатой НК-пробы, что при соответствующих условиях НК-носитель и НК-проба способны образовать полностью комплементарную двунитчатую нуклеиновую кислоту.

Изобретение использует НК-носитель НК-пробы и тем самым позволяет НК-пробам в определенных условиях существовать в виде свободных молекул в растворе. Одновременно с этим использование НК-носителя НК-пробы позволяет использовать НК-мишени не только в виде свободных молекул в растворе, как это необходимо в существующих методах, но и в виде молекул, иммобилизованных на поверхности или находящихся внутри пористой среды, например в геле, в которую свободные молекулы НК-проб могут легко проникнуть.

В результате настоящее изобретение позволяет упростить методы использования и изготовления таких НК-чипов, разработать разнообразные простые варианты управления ими и разработать как одноразовые устройства, так и НК-чипы для многоразового использования.

В соответствии с изобретением можно приготовить комплекс НК-носитель с НК-пробой следующим образом. Вначале изготовить длинную двунитчатую молекулу НК, которая имеет повторенную первичную структуру. В этой структуре повторяющейся единицей в одной из нитей является структура НК-пробы, ограниченная последовательностями-сигналами, которые опознает какая-либо однонитчатая рестриктаза таким образом, что после обработки этой рестриктазой в этих местах появятся однонитчатые разрезы. В результате указанная двунитчатая молекула НК превратится в одну длинную однонитчатую НК, к которой последовательно присоединено множество НК-проб.

Предлагаемые НК-носители обладают способностью специфически и обратимо связывать НК-пробы. В составе НК-чипов (устройств) такие НК-носители НК-проб могут быть локализованы на поверхности или в ограниченном объеме.

Структура предлагаемых НК-носителей НК-проб позволяет использовать следующий метод получения НК-проб. Однонитчатая НК-проба способна присоединять к себе с образованием двунитчатой структуры только комплементарные последовательности НК. Поэтому в случае обработки такого НК-носителя раствором смеси статистически приготовленных олигонуклеотидов (например, имеющих длину от 5 до 50 оснований), только комплементарные последовательности гибридизуются с НК-носителем и образуют комплекс НК-носителя с НК-пробой.

Использованный в изобретении термин "носитель НК-пробы" определен как некое вещество, которое способно специфически и обратимо связываться с НК-пробой и, в частности, включает в себя комплементарные НК-пробе однонитчатые нуклеиновые кислоты, другие органические молекулы и пористые структуры. В настоящем изобретении такой носитель рассматривается как комплексный носитель, который может быть использован как свободные молекулы в растворе, иммобилизованные молекулы и пористые структуры.

Разнообразие молекул другой природы, нежели нуклеиновая кислота, способных присодиняться к НК-носителю НК-проб в соответствии с настоящим изобретением, практически неограничено. Эти молекулы могут нести в своем составе такие группы, которые обеспечивают такие функции, как специфическое опознавание и связывание с различными субстратами и НК-пробами, спектроскопически активные метки и их комбинации.

Расположение носителей НК-пробы не только на плоскости, но и в пространстве предоставляет новые возможности как изготовления, так и функционирования предлагаемых ПК-чипов (устройств).

Например, НК-носители могут быть последовательно соединены конец в конец, образуя длинную нитевидную структуру, в которой многократно повторены одинаковые НК-носители или заранее определенная комбинация разных НК-носителей. Эта структура может включать в себя специальные разграничительные участки, которые, например, устраняют возможные стерические припятствия в работе соседних НК-носителей и позволяют, при необходимости, заменять одни НК-носители на другие без повреждения этих НК-носителей.

Изобретение учитывает, что для НК-носителей НК-проб такими разграничителями могут быть сайты опознавания рестриктаз.

Использование НК-носителей НК-проб, представляющих собой длинные однонитчатые молекулы НК, позволяет исключить проблемы, возникающие при попытках гибридизовать однонитчатые молекулы НК в непосредственной близости к той поверхности, к которой одна из этих молекул иммобилизована. В результате предлагаемые НК-носители НК-проб должны быть полезны при использовании особенно длинных НК-проб, например, при длинах НК-проб более чем 60 оснований.

Предлагаемые НК-носители НК-проб могут быть иммобилизованы на поверхности НК- чипа таким же образом, как на обычных ДНК-чипах (в виде пятен). Использование предлагаемых НК-носителей позволяет осуществить переход от двумерного расположения молекул НК-проб к расположению в пространстве. В настоящее время такой переход происходит при изготовлении гелевых чипов, существенным ограничением для которых является то, что молекулы ДНК-мишеней должны диффундировать внутрь геля, для того чтобы гибридизоваться с ДНК-пробами, иммобилизованными внутри этого геля. Настоящее изобретение учитывает возможность иммобилизации носителей не только на какой-либо поверхности, но и в объеме геля или пористого материала.

Для идентификации предлагаемых НК-носителей НК-проб можно использовать не только их пространственное позиционирование. Например, эти НК-носители НК-проб могут упорядоченно двигаться сквозь детектор, который их опознает. Опознавание может осуществляться по различным признакам, например, размеры и конформация молекул, различные метки и разные комбинации этих признаков. Детектор может также определять время или последовательность прохода носителей сквозь детектор.

Благодаря тому что однонитчатые НК-мишени согласно предлагаемому изобретению взаимодействуют не с иммобилизованными комплементарными им НК, но со свободными НК-пробами, появляется возможность упростить процедуру подготовки НК-мишени к процедуре гибридизации. Например, можно использовать для гибридизации НК-мишени, которые находятся внутри геля или иммобилизованы на поверхности частиц. Например, это могут быть парамагнитные, металлические, полупроводниковые и полимерные частицы. В частности, это могут быть парамагнитные частицы, которые общепринято использовать в процедурах очистки и амплификации НК.

В одном из режимов использования предлагаемых НК-чипов предложено гибридизовать однонитчатые НК-пробы с однонитчатой НК-мишенью в растворе и после этого отделить двунитчатые комплексы мишень-проба от однонитчатых НК-проб. Эти свободные однонитчатые НК-пробы предложено гибридизовать в другом месте с НК-носителями для получения двунитчатых комплексов носитель-проба.

Изобретение учитывает, что в таком режиме работы НК-мишени могут быть иммобилизованы на поверхности другого НК-чипа, например, изготовленного для работы с другими НК-пробами; на поверхности парамагнитных частиц, которые широко используют при сепарации и амплификации НК; а также внутри геля, как это бывает при электрофорезе нуклеиновых кислот.

Результаты гибридизации можно определять, анализируя появление или отсутствие комплексов как НК-мишень с НК-пробой, так и комплексов НК-носитель с НК-пробой. Возможно также обнаружение свободных НК-проб, которые находятся или движутся между НК-мишенью и НК-носителем.

Еще одним режимом работы может быть такой, при котором НК-носитель иммобилизован на открытой поверхности или внутри пор пористого тела и гибридизован с НК-пробой, образуя двунитчатую НК. Предложено денатурировать такой комплекс НК-носитель с НК-пробой и высвобождать НК-пробу для того, чтобы она в свободном состоянии обнаруживала НК-мишень и гибридизовалась с ней. Способами денатурации, например, могут быть нагрев, изменение pH среды и приложение электрического поля.

На Фиг.1 показана последовательность шагов работы одиночного канала НК-чипа (устройства), предложенного в настоящем изобретении.

Изобретение учитывает, что хотя на Фиг.1 показано, что весь раствор перемещается из одного компартмента в другой, существует возможность, приложив к компартментам, заполненным электролитом, электрическое поле, перемещать между компартментами только заряженные молекулы. Аналогично этому возможно использовать электрическое поле для случая, показанного на Фиг.2.

В тех случаях, когда для перемещения молекул используют электрическое поле, возможно обойтись без использования оптических и других методов визуализации молекул, которые требуют специфически модифицировать нуклеиновые кислоты. Вместо этого можно измерять такие параметры, как ионный ток и другие неспецифические характеристики движущихся электрически заряженных полимерных молекул нуклеиновых кислот.

Канал, показанный на Фиг.1, это одноканальное устройство, которое в общем виде обозначено как 10. Устройство 10 имеет канал 2, заполненный жидкостью и имеющий пористую перегородку 14, которая проницаема для НК-проб 28 и непроницаема для НК-носителей 30 и НК-мишеней 32. Одна сторона пористой перегородки 14 обозначена как 16, а вторая 18. Пористая перегородка 14 отделяет содержащий НК-носители компартмент 20 от содержащего НК-мишени компартмента 22. Если необходимо, содержащий НК-носители компартмент 20 отгорожен проницаемой для жидкости пористой перегородкой 24, которая непроницаема для НК-носителей 30, НК-проб 28 и НК-мишеней 32. Подобным образом, если необходимо, содержащий НК-мишени компартмент 22 отгорожен проницаемой для жидкости пористой перегородкой 24', которая непроницаема для НК-носителей, НК-проб и НК-мишеней. Аппарат 26, индуцирующий движение нуклеиновых кислот, необходим для того, чтобы обеспечивать перемещение НК-проб 28 из компартмента 20 в 22 и обратно. Природа аппарата 26 может быть различной в зависимости от того, какова природа сил, выбранных для перемещения нуклеиновых кислот между компартментами. Например, в тех случаях, когда НК-пробы 28 перемещаются между компартментами 20 и 22 вместе с потоком жидкости, аппарат 26 представляет собой насос.

Альтернативно, в тех случаях, когда НК-пробы 28 перемещаются между компартментами 20 и 22 под влиянием электростатического потенциала, аппарат 26 представляет собой источник питания с электродами, которые индуцируют электрическое поле между перегородками 24 и 24'. Для иллюстративных целей аппарат 26 показан, как насос, перемещающий НК-пробы 28 вместе с потоком жидкости.

На Фиг.1(a) показано множество копий НК-пробы 28, которые гибридизованы с НК-носителем 30 и находятся в компартменте 20. Изобретение учитывает, что НК-носитель 30 может находиться в компартменте 20 в виде молекул, свободных в растворе, молекул, иммобилизованных на перегородке 24 или/и перегородке 14 со стороны 16, или находится внутри пористых перегородок 24 или/и 14.

Как показано на Фиг.1(b), комплекс НК-пробы 28 с НК-носителем 30 денатурирован, чтобы освободить НК-пробу 28 в объем раствора компартмента 20. Денатурацию комплексов НК-проб 28 с НК-носителем 30 можно осуществить разными методами, например нагреванием, изменением pH, электрическим полем.

На Фиг.(1c) показано, что НК-пробы 28 перемещены в компартмент 22. Как изображено на этом чертеже, такое перемещение может быть обеспечено за счет накачивания жидкости в компартмент 22 с помощью насоса через канал 2 или за счет отсасывания жидкости из компартмента 22.

Как показано на Фиг.1(d), молекулы НК-мишени 32 вносят в компартмент 22 с помощью диспенсера 34, который, например, может быть микропипеткой, микродиспенсером или другим подобным устройством. Изобретение учитывает, что однонитчатые молекулы НК-мишени 32 могут быть помещены в компартмент 22 до того, как туда помещают НК-пробы 28. В варианте, показанном на Фиг.1, молекулы однонитчатых НК-проб 32 иммобилизованы на парамагнитных частицах 36.

На Фиг.1(e) показано, что молекулы НК-пробы 32, иммобилизованные на парамагнитных частицах 36, взаимодействуют с множеством копий НК-пробы 28. Как это видно на Фиг.1(f), взаимодействие происходит в условиях гибридизации, которые позволяют образование двунитчатых комплексов между комплементарными НК-мишенями и НК-пробами. Методы и условия гибридизации хорошо известны и, например, могут быть обеспечены за счет специальных режимов изменения температуры, pH, ионной силы.

Изобретение учитывает, что на этой стадии содержимое компартмента 22 можно извлечь и исследовать вне описываемого устройства различными хорошо известными методами для того, чтобы определить результаты гибридизации НК-мишени и НК-пробы.

Однако в предпочтительном варианте, как изображено на Фиг.1(g), раствор переводят из компартмента 22 обратно в компартмент 20, ожидая следующий результат. Если НК-проба 28 комплементарна хотя бы части НК-мишени 30, то НК-пробы 28 останутся в компартменте 22 в составе комплекса НК-мишени с НК-пробой, для которого перегородка 14 непроницаема.

Непосредственное обнаружение НК-носителя 30 в условиях гибридизации обычными методами, например, с использованием флуоресцентных красителей, может позволить определить, вернулись ли НК-пробы 28 в компартмент 20. Если окажется, что НК-проба 28 вернулась в компартмент 20 и образовала двунитчатые комплексы с НК-носителем 30, то это будет означать, что НК-пробы 28 некомплементарны НК-мишени 32. В том случае, если НК-пробы 28 некомплементарны НК-мишени 32, удаление этой мишени и в случае необходимости дополнительная промывка компартмента 22 вернут канал 10 к исходному состоянию, показанному на Фиг.1(а). В случае, если НК-проба оказалась комплементарна тестируемой НК-мишени, то перед удалением НК-мишени из компартмента 20 понадобится денатурация комплекса НК-мишени с НК-пробой и перемещение освобожденной НК-пробы в компартмент 22.

Таким образом, в случае, если НК-пробы 28 комплементарны НК-мишени 30, компартмент 22 необходимо вновь заполнить жидкостью, как это показано на Фиг.1(h). Денатурацию двунитчатых комплексов НК-пробы с НК-мишенью, показанную на Фиг.1(i), можно осуществить в тех же условиях, что описаны для Фиг.1(b).

Последующие шаги обеспечивают разделение НК-мишени 32, которая была помещена в компартмент 22 так, как это показано на Фиг.1(d), и НК-проб 28, которые в результате денатурации были освобождены из комплекса с НК-мишенью. Изобретение учитывает, что такое разделение может быть обеспечено вне канала 10 хорошо известными методами, например, такими, как электрофорез и хроматография, а также за счет использования парамагнитных частиц, на которых НК-мишень иммобилизована. Однако в предпочтительном варианте, показанном на Фиг.1(j), освобожденные НК-пробы 28 перемещают из компартмента 22 в компартмент 20. После этого в компартменте 20 обеспечивают гибридизацию НК-пробы 28 с НК-носителем 30, как это показано на Фиг.1(k). После этого компартмент 22 заполняют жидкостью так, чтобы молекулы НК-мишеней 32, иммобилизованные на парамагнитных частицах 36, оказались плавающими в растворе, как это показано на Фиг.1(l).

На Фиг.1(m) показано, что в компартмент 22 введен магнит 40, к поверхности которого прилипли все парамагнитные частицы 36. На следующей Фиг.1(n) показано, что магнит 40, удаленный из компартмента 22, унес на своей поверхности все парамагнитные частицы 36 и иммобилизованные на них НК-мишени 32. Как показано на Фиг.1(o), удаление раствора из компартмента 22 возвращает канал 10 к исходному состоянию, показанному на Фиг.1(a).

Последующая денатурация комплекса НК-носитель 30 с НК-пробой 28 и заполнение компартмента 22 раствором, содержащим НК-пробу 22, подготавливает канал 10 к работе со следующей НК-мишенью 32'. Как показано на Фиг.1(p), следующая НК-мишень 32' может быть, например, иммобилизована на парамагнитных частицах.

На Фиг.2 показан схематически многоканальный НК чип (устройство), в котором отдельные каналы функционируют так, как это было описано для Фиг.1. Номера на Фиг.2. имеют те же объяснения, что и на Фиг.1.

Множество пар компартментов НК-носителей 20 и НК-мишеней 22 образуют двумерный или трехмерный НК-чип (устройство). Преимуществом многоканального НК-чипа (устройства) 50, схематически показанного на Фиг.2, является то, что наличие множества пар компартментов 20 и 22 позволяет автоматизировать устройство и повысить производительность его работы.

Существенной особенностью изобретения является то, что НК-пробы курсируют между компартментами 20 и 22 и не расходуются. Предложенный НК-чип является простым устройством для многоразового использования, пригодным для разработки множественных вариантов недорогой и надежной массовой диагностики.

Множество вариантов многоканального использующего электрофорез НК-чипа (устройства) показано на Фиг.3(a)-3(d). Указанный многоканальный НК-чип (устройство) имеет компартмент для НК-носителя 60, ограниченный торцевым электродом 62. Компартмент 60 предназначен для НК-носителей или НК-мишеней. Пористый материал 64 практически непроницаем для НК-носителей и НК-мишеней, но проницаем для НК-проб. Компартмент 60 может быть полностью или частично заполнен гелем 66, в котором могут быть заключены длинные и по этой причине практически не сдвигаемые в электрическом поле молекулы НК-носителей или НК-мишеней. При неполном заполнении компартмента 60 гелем 66 и при использовании пористого материала 64 компартмент 60 содержит также раствор 63. Компартмент 60 содержит также два (или больше) расположенных по бокам компартмента электрода 68 и 70.

Как показано на Фиг.4, первая пластина, подобная 72, которая представлена на Фиг.3d, содержит набор компартментов, к которым подведены электропроводящие провода 74, обеспечивающие контакт жидкости в компартментах с электродами 68 и 70, которые были показаны также на Фиг.3.

На Фиг.5 представлен разнесенный вид комбинации пластин 72 и 78, которые совместно образуют электрофоретические камеры, описанные на Фиг.3.

На Фиг.6(a)-6(d) схематически показана процедура копирования НК-чипа (устройства), каждый компартмент которого содержит множество копий какого-либо НК-носителя НК-пробы или НК-мишени. Цифровые обозначения совпадают с описанными для Фиг.3-5.

НК 80 амплифицирована с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) внутри компартмента 60 таким образом, что он содержит множество копий этой нуклеиновой кислоты. После этого НК-чип (устройство) 72, который содержит в компартментах 60 множество копий НК, погруженных в гель 66, приводят в соприкосновение с таким же НК-чипом 72' и 78', который имеет концевые электроды 62'. Как показано на Фиг.6(b), в электрическом поле, сформированном между электродами 62 и 62', часть НК 80 будет перемещаться из компартмента 60 в компартмент 60'. После перемещения части НК 80 в компартмент 60' пластины 70 и 72 разъединяют, как это показано на Фиг.6(c). После этого с помощью ПЦР небольшое количество ПК 80, которое было перемещено в компартменты 60', размножают до количеств, соответствующих количеству этих НК 80 в НК-чипе (устройстве), образованном пластинами 72 и 78. Таким образом получают полную копию исходного НК-чипа (устройства).

На Фиг.7(a)-(r) показаны последовательные этапы диагностики для случая, когда НК-носитель НК-проб и НК-мишени погружены каждый в своем компартменте внутрь геля так, что под действием электрического поля НК-пробы могут входить в и выходить из соответствующего компартмента, в то время как НК-носители и НК-мишени практически не будут сдвигаться с места.

Диагностический НК-чип, который состоит из пластин 72 и 78, содержащих концевой электрод 62 и боковые электроды 68 и 70, в соответсвии с описаниями, приведенными для предыдущих чертежей, имеет компартмент 60, содержащий множество копий коротких НК-проб 28, гибридизованных с длинными однонитчатыми НК-носителями 30. Компартмент 60, заполненный гелем 66, обозначен на чертеже как 86.

Компартмент, содержащий НК-мишень 30, помещенную в гель 66, обозначен как 88. Как показано на Фиг.7(b), комплекс НК-пробы 28 и НК-носителя 30 помещен в условия, при которых он денатурирует с образованием однонитчатых НК-пробы 28 и НК-носителя 30.

На Фиг.7(d) показано, что пластину 90 вместе с присоединенной к ней пластиной 78' приводят в контакт с пластиной 72 и прикладывают электрические потенциалы к электродам 62 и 62', в результате чего НК-пробы 28 начинают перемещаться из компартмента 86 в компартмент 88, который содержит НК-мишени. На Фиг.7(e) показано, что в результате электрофореза все НК-пробы 28 покидают компартмент 86 и скапливаются в компартменте 88. После этого, как это показано на Фиг.7(f), пластину 90 отделяют от пластины 72.

Далее пластину с компартментами 88 помещают в условия гибридизации, при которых могут образоваться комплексы НК-проб 28 с НК-мишенями 34. Комплементарные НК-пробы 28 и НК-мишени 34 в результате гибридизации образуют двунитчатые комплексы, как это показано на Фиг.7(g). После этого пластину 90 вновь контактируют с пластиной 72, как показано на Фиг.7(h), и проводят электрофорез в направлении, обратном тому, что показано на Фиг.7(d), с целью вернуть все свободные НК-пробы 28 из компартмента 88 обратно в компартмент 86 с НК-носителями.

Как показано на Фиг.7(i), пластина 90 вновь отделена от пластины 72 и в компартментах 86 организовано горизонтальное электрическое поле, для того чтобы двигать свободные НК-пробы 28. После этого направление горизонтального электрофореза меняют на обратное, как это показано на Фиг.7(k). В обоих случаях электрофорез организован так, что позволяет измерять электрические характеристики движущихся НК-проб 28, например, величину ионного тока. После этого как показано на Фиг.7(l) в компартментах 86 обеспечивают условия гибридизации для образования комплексов между НК-пробами 28 и НК-носителями 30.

После этого компартменты 88, содержащие двунитчатые комплексы НК-мишеней 34 с НК-пробами 28, помещают в условия денатурации. Пластины 90 и 72 вновь контактируют и организуют электрическое поле между электродами 62 и 62' в том же направлении, как на Фиг.7(h), для того чтобы обеспечить перемещение НК-проб 28, комплементарных НК-мишени 34, обратно в компартмент 86. На Фиг.7(o) показано, что после того как все НК-пробы 28 вернутся в компартмент 86, электрическое поле выключают.

Пластины 90 и 72 после этого разъединяют. Содержимое компартментов 88 в пластине 90 становится таким же, как оно было в начале процедуры на Фиг.7(a).

На Фиг.7(q) показано, что в компартментах 86 обеспечены условия гибридизации, в результате чего все НК-пробы 28, которые комплементарны НК-мишени 34, образовали двунитчатые НК комплексы с НК-носителями 30. Таким образом на Фиг.7(r) показано, что НК-чип (устройство), содержащее компартменты 86, полностью готово к диагностике другой НК-мишени; аналогично компартменты 88 готовы для тестирования других НК-проб.