способ получения экстракта из гинкго билоба и экстракт гинкго билоба

Формула изобретения

1. Способ получения экстракта из гинкго билоба, имеющего пониженное содержание 4'-O-метилпиридоксина и/или бифлавонов, включающий следующие стадии:

a) экстракции листьев гинкго билоба с применением ацетона, содержащего воду, или алканола, содержащего 1-3 атома углерода и содержащего воду, или безводного метанола,

b) выделение органического растворителя путем концентрации раствора до содержания, равного 10% по весу максимально, с возможной добавкой на конечных стадиях перегонки воды;

c) разбавления оставшегося водного раствора водой до содержания твердых веществ от 5 до 25% по весу, охлаждения до температуры ниже 25°С и выдержки до образования осадка,

d) обработки оставшегося водного раствора сульфатом аммония и последующей экстракции по меньшей мере один раз с помощью метилэтилкетона или смеси метилэтилкетона и ацетона,

e) концентрирования полученного экстракта и разбавление его смесью этанол-вода с получением раствора, содержащего 50% по весу воды и 50% по весу этанола, и с содержанием твердых веществ, равных 10% по весу,

f) обработки раствора соединением свинца или нерастворимым полиамидом,

g) экстракции отфильтрованного раствора с помощью алифатического или циклоалифатического растворителя с точкой кипения от 60 до 100°С,

h) концентрирования оставшегося водно-спиртового раствора с последующей обработкой сульфатом аммония и экстракцией метилэтилкетоном и этанолом,

i) концентрирования полученной органической фазы до содержания твердых веществ, равного от 50 до 70% по весу,

k) растворения концентрата в водном спирте, содержащем 1-3 атома углерода, и возможного фильтрования,

l) фильтрации через смолу - адсорбент на основе возможно замещенных стиролов/дивинилбензолов, для снижения содержания бифлавонов и/или сильнокислый ионообменник для снижения содержания 4'-O-метилпиридоксина, при этом вещества, которые должны быть удалены, остаются в смоле, и

m) сушки концентрата при пониженном давлении с получением сухого экстракта, содержащего воду в количестве менее 5%.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что водный спирт на стадии к) представляет собой водный этанол.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что водный этанол содержится в количестве от 40 до 60% по весу.

4. Экстракт из листьев гинкго билоба, предназначенный для лечения деменции и нарушений кровообращения, полученный способом по п.1, характеризующийся тем, что он содержит:

менее 10 м.д. 4'-O-метилпиридоксина и/или

менее 20 м.д. бифлавонов, выбранных из группы, содержащей аментофлавон, билобетин, гинкгетин, изогинкгетин и скиадопитазин.

5. Экстракт по п.4, отличающийся тем, что он содержит менее 2 м.д. 4'-O-метилпиридоксина.

6. Экстракт по п.4 или 5, отличающийся тем, что он содержит менее 10 м.д. бифлавонов.

7. Экстракт по п.4 или 5, отличающийся тем, что он содержит менее 5 м.д. бифлавонов.

8. Экстракт по п.4, отличающийся тем, что он содержит:

20-30% по весу флавоноидов, выбранных из группы, содержащей гликозиды кверцетин, кемпферол и изорамнетин,

4,5-8,5% по весу терпеновых лактонов и

менее 10 м.д. гинкголевых кислот.

9. Экстракт по п.4, отличающийся тем, что он содержит:

22,0-27,0% по весу флавоноидов, выбранных из группы, содержащей гликозиды кверцетин, кемпферол и изорамнетин,

5,0-7,0% по весу терпеновых лактонов и

максимум 5 м.д. гинкголевых кислот.

10. Экстракт по п.4, отличающийся тем, что он содержит:

22,0-27,0% по весу флавоноидов, выбранных из группы, содержащей гликозиды, кверцетин, кемпферол и изорамнетин,

2,8-3,4% по весу гинкголидов А, В и С в общем,

2,6-3,3 по весу билобалида и

максимум 5 м.д. гинкголевых кислот.

11. Применение экстракта по любому из пп.4-10 для изготовления лекарственного средства или пищевого продукта.

12. Лекарственное средство, предназначенное для лечения деменции и нарушений кровообращения, характеризующееся наличием в своем составе экстракта гинкго по любому из пп.4-10.

13. Пищевой продукт, характеризующийся наличием в своем составе экстракта гинкго по любому из пп.4-10.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к усовершенствованному многостадийному способу получения экстракта из гинкго билоба, имеющего пониженное содержание 4'-O-метилпиридоксина и/или бифлавонов, при этом уменьшение их содержания осуществляется путем фильтрования через адсорбирующую смолу и/или ионообменник, при этом вещества, которые должны быть удалены, задерживаются смолой. Данное изобретение относится также к экстракту, полученному из гинкго билоба, имеющему пониженное содержание 4'-O-метилпиридоксина и/или бифлавонов, который получается способом согласно данному изобретению, а также к его применению.

Уже в течение десятилетий экстракты из листьев гинкго билоба применяются в качестве лекарственного препарата. В настоящее время они используются для лечения различных видов деменции и ее симптомов, а также нарушений церебрального и периферического кровообращения. Ингредиентами, с которыми связана эффективность, являются лактоны терпенов (гинкголиды А, В, С и билобалид), а также гликозиды флавонов (кверцетин, кемпферол и изорамнетин). Листья гинкго билоба содержат также компоненты, которые не влияют на желательную эффективность, но которые могут отвечать за риски и побочное действие. Кроме неполярных ингредиентов растений, таких как гинкголевые кислоты, этими компонентами являются 4'-O-метилпиридоксин и бифлавоны. Таким образом, в экстракте гинкго, который является эффективным и в то же самое время безопасным, как это только возможно, приводящим к наименьшим побочным эффектам, эти соединения не должны содержаться.

4'-O-метилпиридоксин может вызвать появление симптомов отравления, таких как конвульсивные судороги и потеря сознания. Это соединение называется также гинкготоксином. Бифлавоны, содержащиеся в гинкго, могут быть иммунотоксичными и могут вызывать контактную аллергию. Эти бифлавоны, содержащиеся в гинкго, преимущественно представляют собой аментофлавон, билобетин, гинкгетин, изогинкгетин и скьядопитизин.

4'-O-метилпиридоксин

Бифлавоны

Аментофлавон: R¹=R² =R³=Н

Билобетин: R¹=R ³=Н, R²=ОСН₃

Гинкгетин: R³=Н, R¹=R²=ОСН₃

Изогинкгетин: R¹=Н, R²=R ³=ОСН₃

Скьядопитизин: R¹ =R²=R³=ОСН₃

Способы уменьшения содержания 4'-O-метилпиридоксина и одновременно бифлавонов, а также получаемые при этом экстракты уже описаны в ЕР 1037646 В1. Согласно этому источнику 4'-O-метилпиридоксин удерживается с помощью кислого катионообменника, а бифлавоны адсорбируются на активированном угле. Предпочтительно, эти стадии осуществляются после "обработки раствора соединением свинца или нерастворимым полиамидом". Способ по патенту ЕР 1037646 В1 основан на методе, первоначально описанном в DE 3940091 С2.

В ЕР 1037646 В1 уменьшение содержания бифлавонов и 4'-O-метилпиридоксина осуществляется на стадии, когда соли свинца и соли аммония содержатся в таком довольно большом количестве, что нужно применять повышенное количество ионообменника.

Кроме того, уменьшение содержания бифлавонов и 4'-O-метилпиридоксина описано и заявляется только как уменьшение комбинации этих веществ. Однако в зависимости от пределов, которые возможно будут установлены в будущем, и с учетом требования наименьшей модификации состава экстракта возможно будет желательным удаление только бифлавонов или только 4'-O-метилпиридоксина.

Кроме того, содержание 4'-O-метилпиридоксина менее 50 м.д. (ч/млн) и бифлавонов менее 100 м.д., которое указано в ЕР 1037646 В1, является все еще сравнительно высоким. Поскольку в ЕР 1037646 В1 не описан сравнительный пример, действительная степень очистки, достигнутая в примерах 2 и 3, не указана в этом источнике.

Таким образом, цель данного изобретения состоит в создании способа получения экстрактов гинкго, имеющих низкое содержание 4'-O-метилпиридоксина и/или низкое содержание бифлавонов, который не имеет недостатков, указанных выше и, в особенности,

- предусматривает применение легко регенерируемых и/или очень недорогих адсорбентов,

- обеспечивает содержание 4'-O-метилпиридоксина менее 20 м.д., предпочтительно менее 10 м.д. и особенно предпочтительно менее 2 м.д. и/или содержание бифлавонов менее 20 м.д., предпочтительно менее 10 м.д. и особенно предпочтительно менее 5 м.д. и

- приводит к получению экстрактов, имеющих содержание флавоноидов, равное от 20 до 30% по весу (особенно предпочтительно от 22,0 до 27,0%), лактонов терпенов от 4,5 до 8,5% по весу (особенно предпочтительно от 5,0 до 7,0%, предпочтительно содержание гинкголидов А, В и С от 2,8 до 3,4% и содержание биобалида от 2,6 до 3,2%), содержание гинкголевых кислот максимум 5 м.д., при этом указанное содержание флавоноидов равно от 22,0 до 27,0%, лактонов терпенов от 5,0 до 7,0% (из них 2,8-3,4% составляют гинкголиды А, В и С 2,6-3,2% составляет биобалид) и содержание гинкголевых кислот (максимум 5 м.д.) соответствуют требованиям German Pharmacopoeia 2003 ("Deutsches Arzneibuch", DAB).

В соответствии с DAB флавоноиды определяют в виде кверцетина, кемпферола и изорамнетина после кислого гидролиза и затем рассчитывают как гликозиды флавоноидов.

Эта цель может быть достигнута путем отделения бифлавонов при помощи адсорбирующей смолы и/или отделения 4'-O-метилпиридоксина при помощи кислых ионообменников.

Для того чтобы получить экстракты согласно данному изобретению, предпочтительно осуществить следующий способ, согласно которому стадии a)-i), а также стадия m) уже по существу описаны в DE 3940091 С2, этот способ включает:

a) экстракцию листьев гинкго билоба при температуре, равной 20-100°С, предпочтительно 40-60°С, с применением ацетона, содержащего воду, в количестве 20-90% по весу, алканола, содержащего от 1 до 3 атомов углерода (метанола, этанола, н-пропанола и изопропанола), также содержащего воду, в количестве 20-90% по весу или безводного метанола при соотношении лекарство: растворитель, равном от 1:4 до 1:20, предпочтительно от 1:5 до 1:10;

b) отделение органического растворителя путем его выпаривания до содержания максимум 10% по весу (предпочтительно максимум 5% по весу), при этом во время конечных стадий отгонки может быть добавлена вода;

c) разбавление оставшегося водного раствора водой до содержания твердых веществ, равного от 5 до 25% по весу (предпочтительно от 15 до 20% по весу), охлаждение раствора до температуры ниже 25°С (предпочтительно около 10-12°С) и выдержку оставшегося водного раствора до образования осадка;

d) обработку оставшегося водного раствора сульфатом аммония (предпочтительно до содержания до 40% по весу, особенно предпочтительно 25-35% по весу) и последующую экстракцию раствора по меньшей мере один раз с применением метилэтилкетона или смеси метилэтилкетона и ацетона (предпочтительно в соотношении от 9:1 до 4:6, в частности 6:4);

e) концентрирование полученного экстракта (предпочтительно до содержания твердых частиц, равного 50-70% по весу) и разбавление экстракта смесью этанола и воды с целью получения раствора, содержащего 50% по весу воды и 50% по весу этанола и с содержанием твердых частиц, равным 10% по весу;

f) обработку раствора соединением свинца (предпочтительно ацетатом свинца, гидроокисью ацетата свинца, нитратом свинца или водной суспензией гидроокиси свинца) до изменения цвета от коричневого до темно-коричневого или нерастворимым полиамидом (предпочтительно полиамидом 6, полиамидом 6,6 или сшитым поливинилпирролидоном (повидоном));

g) экстракцию отфильтрованного раствора при помощи алифатического или циклоалифатического растворителя, имеющего точку кипения от 60 до 100°С;

h) концентрирование оставшегося водно-спиртового раствора, последующую обработку раствора сульфатом аммония и экстрацию раствора метилэтилкетоном и этанолом (раствор предпочтительно концентрируют при пониженном давлении до содержания этанола около 5% максимально, сульфат аммония добавляют до содержания 20% по весу, экстракцию осуществляют растворителем с соотношением от 8:2 до 5:5, предпочтительно 6:4);

i) концентрацию полученной органической фазы, до содержания твердых частиц от 50 до 70% по весу;

k) растворение концентрата в водном этаноле, содержащем 1-3 атома углерода, и необязательное фильтрование продукта;

l) фильтрацию через смолу-адсорбент и/или ионообменник, при этом вещества, которые должны быть удалены, остаются на смоле, и

m) сушку концентрата (предпочтительно при максимальной температуре от 60 до 80°С) при пониженном давлении с получением сухого экстракта, имеющего содержание воды менее 5%.

Преимущество способа согласно данному изобретению состоит в том, что стадию уменьшения содержания осуществляют в конце способа. Таким образом, необходимо применять меньшее количество ионообменника и при этом достигается особенно низкое содержание 4'-O-метилпиридоксина и/или бифлавонов. Предпочтительные смолы-адсорбенты на стадии l) представляют собой смолы на основе необязательно замещенных стиролов / дивинилбензолов, такие как Diaion НР-20, НР-21 или Sepabeads SP-207 и SP-850. Предпочтительные ионообменники являются сильнокислыми ионообменниками, такими как Merck I или Amberlite IR-120. Стадия фильтрации возможно включает обычное промывание растворителем. Водный спирт на стадии k) представляет собой водный метанол, этанол, н-пропанол или изопропанол с содержанием 20-90%, соответственно, предпочтительно водный этанол, особенно предпочтительной является концентрация равная 40-60% по весу.

Предметом настоящего изобретения являются также экстракты, предпочтительно сухие экстракты, которые получаются способом по данному изобретению и которые характеризуются содержанием:

- менее 20 м.д., предпочтительно менее 10 м.д. и в особенности менее 2 м.д. 4'-O-метилпиридоксина и/или

- менее 20 м.д., предпочтительно менее 10 м.д. и в особенности менее 5 м.д. бифлавонов.

Кроме того, предмет данного изобретения составляют экстракты, в особенности сухие экстракты, которые получаются по способу по данному изобретению и которые характеризуются содержанием:

- 20-30% по весу, предпочтительно 22,0-27,0% по весу флавоноидов,

- 4,5-8,5% по весу, предпочтительно 5,0-7,0% по весу терпеновых лактонов и

- менее 10 м.д., предпочтительно менее 5 м.д. гинкголевых кислот.

Еще одним предметом данного изобретения являются также экстракты, предпочтительно сухие экстракты, которые получаются способом по данному изобретению и которые характеризуются содержанием:

- 20-30% по весу, предпочтительно 22,0-27,0% по весу флавоноидов,

- 2,5-4,5% по весу гинкголидов А, В и С в общем, предпочтительно 2,8-3,4% по весу гинкголидов А, В и С в общем,

- 2,0-4,0% по весу, предпочтительно 2,6-3,2% по весу билобалида,

- менее 10 м.д., предпочтительно не более 5 м.д. гинкголевых кислот и

- менее 20 м.д., предпочтительно менее 10 м.д., особенно предпочтительно менее 2 м.д. 4'-O-метилпиридоксина и/или

- менее 20 м.д., предпочтительно менее 10 м.д. и особенно предпочтительно менее 5 м.д. бифлавонов.

Согласно European Pharmacopoeia (Европейской Фармакопее) сухие экстракты обычно содержат сухой остаток, составляющий по меньшей мере 95% по весу.

Экстракты согласно данному изобретению могут применяться в виде порошков, гранул, таблеток, драже (таблеток с покрытием) или капсул, предпочтительно перорально.

Для того чтобы приготовить таблетки, экстракт смешивают с подходящими фармацевтически приемлемыми адъювантами, такими как лактоза, целлюлоза, двуокись кремния, кроскармелоза и стеарат магния, и прессуют в таблетки, которые могут быть снабжены подходящим покрытием, например, на основе гидроксиметилцеллюлозы, полиэтиленгликоля, пигментов (таких как двуокись титана, окись железа) и талька. Экстракт по данному изобретению помещают в капсулы, возможно с добавлением адъювантов, таких как стабилизаторы, наполнители и т.п. Доза экстракта, принимаемая в день, составляет 10-2000 мг, предпочтительно 50-1000 мг и в особенности предпочтительно 100-500 мг.

Еще одним предметом данного изобретения являются лекарственные препараты, пищевые продукты и другие препараты, содержащие эти экстракты, возможно в сочетании с другими веществами, такими как активные ингредиенты и/или фармацевтически приемлемые адъюванты.

Термин "пищевой продукт", используемый в данном описании, относится к диетическим пищевым продуктам, диетическим добавкам, а также к медицинским пищевым продуктам и диетическим добавкам.

Примеры

Приготовление раствора экстракта, используемого в примерах 1 и 2, а также в сравнительных примерах 1 и 2.

Высушенные листья гинкго билоба подвергали экстракции при температуре около 50°С, используя семикратное количество по отношению к их весу (вес/вес) (то есть отношение лекарство - растворитель равно 1:7) смеси ацетон/вода 60/40 (вес/вес) (стадия а)).

Органический растворитель отделяли от экстракта (стадия в)) и оставшийся концентрированный водный раствор разбавляли водой до содержания твердых частиц, равного примерно 10% по весу. Раствор охлаждали до температуры около 12°С при перемешивании и полученный осадок удаляли (стадия с)). К оставшемуся водному раствору добавляли примерно 30% по весу сульфата аммония и полученный раствор подвергали экстракции смесью метилэтилкетона и ацетона в отношении 6:4 (стадия d)).

Полученный экстракт концентрировали и полученный таким образом экстракт разбавляли водой и этанолом, получали раствор, содержащий 50% по весу воды и 50% по весу этанола, с содержанием твердых частиц около 10% по весу (стадия е)). Раствор отфильтровывали и добавляли в фильтрат водный раствор ацетата гидроокиси свинца (стадия f).

После фильтрации оставшийся водно-спиртовой раствор экстрагировали гептаном (стадия g)).

Затем водно-спиртовой раствор концентрировали при пониженном давлении до содержания этанола, равного 5%, и добавляли сульфат аммония до получения его содержания, равного примерно 20% по весу в расчете на количество воды. Полученный раствор экстрагировали смесью метилэтилкетона и этанола в отношении 6:4 (стадия h)).

Полученную органическую фазу концентрировали (содержание твердых частиц около 55% по весу) (стадия i)). Затем полученный продукт разбавляли этанолом и водой, получали раствор с содержанием этанола около 75% и с содержанием твердых частиц, равным около 15% (стадия k)).

Пример 1: экстракт гинкго с пониженным содержанием 4'-O-метилпиридоксина

1249 г раствора экстракта, полученного в соответствии со способом, описанным выше, разбавляли водой до содержания этанола около 40% (вес/вес) и пропускали 50 мл (что соответствует 0,28 мл/г сухого экстракта) через Amberlite IR-120 (сильнокислый ионообменник) (колонка: примерно 2×16,5 см; поток: около 8 мл/мин) (стадия 1)), затем промывали 200 мл 50%-ного этанола (вес/вес). Полученный раствор концентрировали в роторном испарителе и сушили в вакууме при 50°С (стадия m)): 179,4 г.

Как можно видеть из следующей Таблицы, было достигнуто содержание 4'-O-метилпиридоксина, равное 0,4 м.д. без существенного изменения состава ингредиентов, которое релевантно по отношению к эффективности.

Сравнительный пример 1: экстракт гинкго без уменьшения содержания на стадии 1) по данному изобретению

98,4 г раствора экстракта, примененного в примере 1, концентрировали путем выпаривания и сушили под вакуумом при 50°С: 14,7 г.

Пример 2а: экстракт гинкго с пониженным содержанием бифлавонов

500 г раствора экстракта, полученного в препаративном примере, описанном выше, разбавляли водой до содержания этанола около 40% (вес/вес) и 400 мл (что соответствует 5,7 мл/г сухого экстракта) пропускали через Sepabeads SP-850 (смола-адсорбент) (колонка: примерно 4×32 см; поток: около 8 мл/мин) (стадия 1)), затем промывали примерно 2 л 40%-ного этанола (вес/вес) в общем. 10% полученного раствора (259,3 г) концентрировали в роторном испарителе и сушили при замораживании (стадия m)); 6,92 г оставшиеся 90% раствора применяли в примере 2b).

Как видно из следующей Таблицы, было достигнуто содержание бифлавона менее 1 м.д. без существенного изменения состава ингредиентов, что релевантно по отношению к эффективности.

Пример 2b: экстракт гинкго с пониженным содержанием 4'-O-метилпиридоксина

90% раствора, полученного в примере 2а) (2334,1 г) в количестве 25 мл (что соответствует 0,40 мл/г сухого экстракта) пропускали через Amberlite IR-120 (сильнокислый ионообменник) (колонка: примерно 1,5×11 см; поток: около 10 мл/мин) (стадия 1)), затем промывали 100 мл 40%-ного этанола (вес/вес). Полученный раствор концентрировали в роторном испарителе и сушили при замораживании (стадия m)): 61,67 г.

Как можно видеть из следующей Таблицы, было достигнуто содержание 4'-O-метилпиридоксина, равное 0,4 м.д., и содержание бифлавонов менее 1 м.д. соответственно, без существенного изменения ингредиентов, что релевантно в отношении эффективности.

Сравнительный пример 2: экстракт гинкго без уменьшенного содержания примесей на стадии 1) по данному изобретению.

50 г раствора экстракта, использованного в примере 2а, концентрировали путем выпаривания и сушили при замораживании: 7,05 г.

Сравнительный пример 3: экстракт гинкго с уменьшением содержания бифлавонов и 4'-O-метилпиридоксина после обработки соединением свинца (стадия f)) в соответствии с ЕР 1037646 В1.

Высушенные листья гинкго билоба (лекарство) экстрагировали при температуре около 50°С, используя семикратное по отношению к их весу количество (вес/вес) (то есть отношение лекарство - растворитель 1:7) смеси ацетон/вода 60/40 (вес/вес). Органический растворитель отделяли от экстракта и оставшийся концентрированный водный раствор разбавляли водой до содержания твердых веществ около 10% по весу, охлаждали до температуры около 12°С при перемешивании и удаляли полученный осадок.

Около 30% по весу сульфата аммония добавляли к водному раствору и полученный раствор экстрагировали смесью метилэтилкетона и ацетона в отношении 6:4.

Полученный экстракт концентрировали и полученный таким образом концентрат разбавляли водой и этанолом, получали раствор, содержащий 50% по весу воды и 50% по весу этанола, и с содержанием твердых частиц около 10% по весу. Раствор фильтровали, в фильтрат добавляли водный раствор ацетата гидроокиси свинца и снова отфильтровывали (стадия f)).

150 мл полученного таким образом раствора (порция сухого экстракта: 7,1%, содержание этанола: около 50%) перемешивали с 2,5 г (что соответствует 0,17 к/г конечного продукта) активного углерода в течение 30 мин при комнатной температуре. Фильтрат помещали в колонку с 4,2 мл (что соответствует 0,28 мл/г конечного продукта) сильнокислого катионообменника (Merck I). Колонку с ионообменником промывали 4×5 мл EtOH (50%).

Соединенные элюаты экстрагировали, встряхивая с 3×70 мл н-гексана. Фаза этанол/вода концентрировалась в роторном испарителе и разбавляли водой до 100 г. Полученный таким образом раствор экстракта экстрагировали 1×40 мл, 2×30 мл и 1×20 мл смеси метилэтилкетона: этанол в отношении 3: 2, для достижения разделения фаз добавляли 15 г сульфата аммония.

Органическую фазу перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре после добавления 25 г сульфата аммония. Нерастворившийся сульфат аммония, а также образовавшуюся фазу разделяли. Раствор экстракта концентрировали в роторном испарителе при температуре 50°С и сушили под вакуумом при температуре 60°С: 14,8 г.

Как можно увидеть из данных в следующей Таблице, содержание 4'-O-метилпиридоксина составило 52 м.д., содержание бифлавонов - 31,3 м.д. и, таким образом, согласно данному изобретению по сравнению с примером 2b) достигаются гораздо более высокое содержание и худшие результаты уменьшения содержания этих компонентов.

Определение содержания флавоноидов, терпеновых лактонов и гинкголевых кислот, указанных в Таблице 1, проводили в соответствии с DAB.

Количественное определение 4'-O-метилпиридоксина осуществляли методом ЖХВР и методом флуоресценции после обогащения при помощи картриджей Sep Рак Plus С18 с последующим обогащением при помощи карриджей Bond Elut LRC-SC{, при этом применяли колонку Phenomenex Prodigy 5 мк ODS - 3 ЖХВР и градиент трифторуксусная кислота (pH 2): метанол=9:1 (об/об) метанол.

Определение содержания бифлавонов, указанных в Таблице 1, осуществляли методом ЖХВР и УФ-обнаружения при длине волны 340 нм при помощи колонки Nova Рак С18 с градиентом вода: ацетонитрил 9:1 (об./об.)+0,3% по объему фосфорной кислоты (85%) ацетонитрил+0,3% по объему фосфорной кислоты.

В каждом случае результаты калибровали, используя эталонные вещества, имеющие высокую, определенную степень чистоты.