способ получения низкомолекулярного гепарина
Классы МПК: | A61K31/727 гепарин; гепаран C08B37/10 гепарин; его производные |
Автор(ы): | Банникова Галина Евгеньевна (RU), Дрозд Наталья Николаевна (RU), Варламов Валерий Петрович (RU), Макаров Владимир Александрович (RU), Толстенков Александр Сергеевич (RU), Лапикова Елена Сергеевна (RU), Мифтахова Наджия Таировна (RU), Ильина Алла Викторовна (RU), Лопатин Сергей Александрович (RU), Скрябин Константин Георгиевич (RU) |
Патентообладатель(и): | Государственное учреждение гематологический научный центр Российской академии медицинских наук (ГУ ГНЦ РАМН) (RU), Центр "Биоинженерия" РАН (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2007-11-08 публикация патента:
10.01.2010 |
Изобретение относится к медицине, точнее к технологии получения лекарственных средств, предназначенных для лечения тромботических состояний. Предложен способ получения низкомолекулярного гепарина с помощью ферментативной деполимеризации, который характеризуется тем, что лизоцим в сухом виде добавляют к 1% раствору гепарина в 0,1 М NaCl в весовом соотношении 1:100, перемешивают при 50°C в течение 3 часов, обессоливают на колонке с сефадексом и лиофильно высушивают. Изобретение обеспечивает получение низкомолекулярного гепарина с помощью фермента лизоцима яичного белка. 2 табл.
Формула изобретения
Способ получения низкомолекулярного гепарина с помощью ферментативной деполимеризации, характеризующийся тем, что лизоцим в сухом виде добавляют к 1%-ному раствору гепарина в 0,1 М NaCl в весовом соотношении 1:100, перемешивают при 50°C в течение 3 ч, обессоливают на колонке с сефадексом и лиофильно высушивают.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для создания эффективного средства профилактики и лечения тромботических состояний (инфаркты, инсульты, тромбозы различной локализации).
В последнее десятилетие низкомолекулярные гепарины (НМГ) с более узким молекулярно-массовым распределением 4-6 кДа начали вытеснять нефракционированный гепарин (НФГ) как лекарственный препарат. Главное преимущество НМГ следует из их фармакокинетических свойств: в 2-4 раза большее время полувыведения из организма, заметно лучшая биодоступность при подкожном введении и более стабильная дозовая реакция (доза может быть рассчитана только исходя из веса пациента, без дополнительного лабораторного исследования). Меньший токсический эффект связан с вызываемой нефракционированным гепарином тромбоцитопенией, что, в свою очередь, обусловлено меньшим взаимодействием НМГ с тромбоцитами.
Ранее авторами была показана возможность получения НМГ под действием гидролитических ферментов, никогда с этой целью не использованных, таких как папани, химотрипсин, «протеаза С» или целловиридин [1].
Цель изобретения - получение НМГ с помощью фермента лизоцима яичного белка. Данная цель достигается тем, что для гидролиза используется фермент лизоцим. Он легко доступен, дешев. Ранее НМГ с помощью лизоцима никто не получал.
Лизоцим - мураминидаза, фермент класса гидролаз способен разрушать стенку бактериальной клетки, в результате чего происходит ее растворение (лизис). Он действует на один из основных компонентов бактериальной клетки - сложный полисахарид, состоящий из двух типов аминосахаров [2]. Известно применение лизоцима для гидролиза хитозана [3].
Наиболее близким по технической сущности является способ получения НМГ путем частичной деполимеризации под действием иммобилизованных гидролаз [1].
Сущность предложенного способа заключается в том, что в случае использования лизоцима добавляли фермент к раствору гепарина в 0,1 М NaCl в соотношении 1:100 и раствор термостатировали при температуре 50°C в течение 3 часов, обессоливали на колонке с сефадексом G-10. Высушивали лиофильно. С выходом около 70-80% получали гепарин с молекулярной массой на 40-50% ниже, чем у исходного гепарина.
Лизоцим, в виде раствора с целью деполимеризации гепарина, использован авторами впервые. При этом установлено, что анти Ха-активность целевого продукта составляет 139±8 ЕД/мг, что соответствует удельной активности такого препарата НМГ, как фраксипарин 120-160 ЕД/мг.
Авторы исследовали влияние низкомолекулярного гепарина (НМГр) с молекулярной массой 6,8 кДа, полученного с помощью гидролиза нефракционированного гепарина (НФГ "Белмедпрепараты" ОАО, молекулярная масса 13,8 кДа) лизоцимом в растворе на изменение времени свертывания плазмы крови человека в тесте активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ, влияние на внутренний путь свертывания крови) и РеаКлот НПО "Ренам" (влияние на активность фактора Ха) [4]. Лиофильно высушенную плазму человека приобретали в НПО «Ренам». Для расчета специфических антитромбиновой (антифактор IIа, aIIa) и антифактор Ха (аХа) активностей использовали калибровочную кривую 1-го Международного стандарта низкомолекулярного гепарина (NIBSC).
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.
Пример 1. К 10 мл 1% раствора гепарина (молекулярная масса 13,8 кДа) в 0,1 М NaCl добавляли 1 мг лизоцима. Весовое соотношение фермента к навеске гепарина 1:100. Суспензию перемешивали при 50°C в течение 3 ч и обессоливали на колонке с сефадексом G-10 (2,5×42 см), элюент вода, скорость элюции 80 мл/ч, высушивали лиофильно. Получали 70 мг (70% от исходного) с молекулярной массой 6,8 кДа (НМГр).
Пример 2. К смеси 0,06 мл плазмы и 0,06 мл аЧТВ-реагента (НПО "Ренам") добавляли 0,05 мл растворов НФГ или НМГр в конечных концентрациях 0,14-2,20 мкг/мл. Через 3 мин инкубации при 37°С добавляли 0,06 мл 0,025 М раствора CaCl2 и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с увеличением концентрации образцов (Таблица 1). Антитромбиновые активности (aIIa) НФГ и НМГр при сравнении со стандартом составили 128±3 ЕД/мг и 120±5 ЕД/мг соответственно.
Пример 3. К смеси 0,099 мл плазмы и 0,025 мл раствора фактора Ха (НПО "Ренам") добавляли 0,01 мл растворов НФГ или НМГр в конечных концентрациях 0,07-0,47 мкг/мл. Через 2 мин инкубирования при 37°С добавляли 0,06 мл 0,035 М раствора
СаСl2 и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с увеличением концентрации образцов (Таблица 2). Активности против фактора Ха (аХа) для НФГ и НМГр при сравнении со стандартом составили 117±10 ЕД/мг и 139±8 ЕД/мг.
Таблица 1 | ||||||||||
Время появления сгустка плазмы (сек) в тесте активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ) | ||||||||||
шифр | Конечная концентрация, мкг/мл | |||||||||
0 | 0,22 | 0,27 | 0,3 | 0,36 | 0,43 | 0,54 | 0,72 | 1,1 | 2,2 | |
НФГ | 30,0±1,8 | 32,3±2,7 | 33,9±2,5 | 36,1±3,0* | 37,2±3,3* | 38±4,0* | 43,4±3,8** | 51,4±4,4** | 69,5±6,7*** | 114,7±12,3*** |
НМГр | 31,7±1,5 | 32,8±3,7 | 35,8±2,8 | 36,7±3,5* | 37,5±3,5* | 42,6±3,9** | 49,9±4,1** | 68,7±5,9*** | 110±9,9*** | |
* - р<0.05, ** - р<0.01 и *** - р<0.001 достоверность различий с показаниями при конечной концентрации гепаринов 0 мкг/мл |
Таблица 2 | ||||||||
Время появления сгустка плазмы (сек) в тесте РеаКлот | ||||||||
шифр | Конечная концентрация, мкг/мл | |||||||
0 | 0,07 | 0,14 | 0,18 | 0,23 | 0,28 | 0,35 | 0,47 | |
НФГ | 19,4±1,3 | 20,0±2,3 | 20,2±2,1 | 20,8±1,7 | 22,1±1,9 | 22,5±2,0 | 28,8±2,4** | 37,9±2,8*** |
НМГр | 20,9±1,5 | 21,8±1,9 | 24,5±2,1* | 26,1±2,3** | 27,2±1,9** | 33,6±2,5*** | 43,8±3,1** | |
* - р<0.05, ** - р<0.01 и *** - р<0.001 достоверность различий с показаниями при конечной концентрации гепаринов 0 мкг/мл |
Таким образом, при деполимеризации нефракционированного гепарина (отношение активностей aXa/aIIa=0,9) лизоцимом в растворе мы получаем гепарин с молекулярной массой, меньшей в сравнении с исходным НФГ. При этом отношение активностей аХа /aIIa увеличивается в 1,2 раза.
Список литературы
1. Г.Е.Банникова, В.П.Варламов, Н.Н.Дрозд, В.А.Макаров, В.Е.Тихонов, К.Г.Скрябин, патент РФ № 2295538 от 20 марта 2007 г., Бюлл. Открыт., № 5 (2007).
2. Бернхард С., Структура и функция ферментов. М., 1971.
3. Ильина А.В., Варламов В.П. Ферментативная деполимеризация N-сукцинилхитозана. Биоорг.Хим. 2007; 33(1):156-9.
4. Bates SM, Weitz JI // Circulation. 2005. V 112. N 4. P 53-60.
Класс A61K31/727 гепарин; гепаран
Класс C08B37/10 гепарин; его производные