способ получения низкомолекулярного гепарина

Классы МПК:A61K31/727 гепарин; гепаран
C08B37/10 гепарин; его производные
Автор(ы):, , , , , , , , ,
Патентообладатель(и):Государственное учреждение гематологический научный центр Российской академии медицинских наук (ГУ ГНЦ РАМН) (RU),
Центр "Биоинженерия" РАН (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2007-11-08
публикация патента:

Изобретение относится к медицине, точнее к технологии получения лекарственных средств, предназначенных для лечения тромботических состояний. Предложен способ получения низкомолекулярного гепарина с помощью ферментативной деполимеризации, который характеризуется тем, что лизоцим в сухом виде добавляют к 1% раствору гепарина в 0,1 М NaCl в весовом соотношении 1:100, перемешивают при 50°C в течение 3 часов, обессоливают на колонке с сефадексом и лиофильно высушивают. Изобретение обеспечивает получение низкомолекулярного гепарина с помощью фермента лизоцима яичного белка. 2 табл.

Формула изобретения

Способ получения низкомолекулярного гепарина с помощью ферментативной деполимеризации, характеризующийся тем, что лизоцим в сухом виде добавляют к 1%-ному раствору гепарина в 0,1 М NaCl в весовом соотношении 1:100, перемешивают при 50°C в течение 3 ч, обессоливают на колонке с сефадексом и лиофильно высушивают.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для создания эффективного средства профилактики и лечения тромботических состояний (инфаркты, инсульты, тромбозы различной локализации).

В последнее десятилетие низкомолекулярные гепарины (НМГ) с более узким молекулярно-массовым распределением 4-6 кДа начали вытеснять нефракционированный гепарин (НФГ) как лекарственный препарат. Главное преимущество НМГ следует из их фармакокинетических свойств: в 2-4 раза большее время полувыведения из организма, заметно лучшая биодоступность при подкожном введении и более стабильная дозовая реакция (доза может быть рассчитана только исходя из веса пациента, без дополнительного лабораторного исследования). Меньший токсический эффект связан с вызываемой нефракционированным гепарином тромбоцитопенией, что, в свою очередь, обусловлено меньшим взаимодействием НМГ с тромбоцитами.

Ранее авторами была показана возможность получения НМГ под действием гидролитических ферментов, никогда с этой целью не использованных, таких как папани, химотрипсин, «протеаза С» или целловиридин [1].

Цель изобретения - получение НМГ с помощью фермента лизоцима яичного белка. Данная цель достигается тем, что для гидролиза используется фермент лизоцим. Он легко доступен, дешев. Ранее НМГ с помощью лизоцима никто не получал.

Лизоцим - мураминидаза, фермент класса гидролаз способен разрушать стенку бактериальной клетки, в результате чего происходит ее растворение (лизис). Он действует на один из основных компонентов бактериальной клетки - сложный полисахарид, состоящий из двух типов аминосахаров [2]. Известно применение лизоцима для гидролиза хитозана [3].

Наиболее близким по технической сущности является способ получения НМГ путем частичной деполимеризации под действием иммобилизованных гидролаз [1].

Сущность предложенного способа заключается в том, что в случае использования лизоцима добавляли фермент к раствору гепарина в 0,1 М NaCl в соотношении 1:100 и раствор термостатировали при температуре 50°C в течение 3 часов, обессоливали на колонке с сефадексом G-10. Высушивали лиофильно. С выходом около 70-80% получали гепарин с молекулярной массой на 40-50% ниже, чем у исходного гепарина.

Лизоцим, в виде раствора с целью деполимеризации гепарина, использован авторами впервые. При этом установлено, что анти Ха-активность целевого продукта составляет 139±8 ЕД/мг, что соответствует удельной активности такого препарата НМГ, как фраксипарин 120-160 ЕД/мг.

Авторы исследовали влияние низкомолекулярного гепарина (НМГр) с молекулярной массой 6,8 кДа, полученного с помощью гидролиза нефракционированного гепарина (НФГ "Белмедпрепараты" ОАО, молекулярная масса 13,8 кДа) лизоцимом в растворе на изменение времени свертывания плазмы крови человека в тесте активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ, влияние на внутренний путь свертывания крови) и РеаКлот НПО "Ренам" (влияние на активность фактора Ха) [4]. Лиофильно высушенную плазму человека приобретали в НПО «Ренам». Для расчета специфических антитромбиновой (антифактор IIа, aIIa) и антифактор Ха (аХа) активностей использовали калибровочную кривую 1-го Международного стандарта низкомолекулярного гепарина (NIBSC).

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. К 10 мл 1% раствора гепарина (молекулярная масса 13,8 кДа) в 0,1 М NaCl добавляли 1 мг лизоцима. Весовое соотношение фермента к навеске гепарина 1:100. Суспензию перемешивали при 50°C в течение 3 ч и обессоливали на колонке с сефадексом G-10 (2,5×42 см), элюент вода, скорость элюции 80 мл/ч, высушивали лиофильно. Получали 70 мг (70% от исходного) с молекулярной массой 6,8 кДа (НМГр).

Пример 2. К смеси 0,06 мл плазмы и 0,06 мл аЧТВ-реагента (НПО "Ренам") добавляли 0,05 мл растворов НФГ или НМГр в конечных концентрациях 0,14-2,20 мкг/мл. Через 3 мин инкубации при 37°С добавляли 0,06 мл 0,025 М раствора CaCl2 и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с увеличением концентрации образцов (Таблица 1). Антитромбиновые активности (aIIa) НФГ и НМГр при сравнении со стандартом составили 128±3 ЕД/мг и 120±5 ЕД/мг соответственно.

Пример 3. К смеси 0,099 мл плазмы и 0,025 мл раствора фактора Ха (НПО "Ренам") добавляли 0,01 мл растворов НФГ или НМГр в конечных концентрациях 0,07-0,47 мкг/мл. Через 2 мин инкубирования при 37°С добавляли 0,06 мл 0,035 М раствора

СаСl2 и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с увеличением концентрации образцов (Таблица 2). Активности против фактора Ха (аХа) для НФГ и НМГр при сравнении со стандартом составили 117±10 ЕД/мг и 139±8 ЕД/мг.

Таблица 1
Время появления сгустка плазмы (сек) в тесте активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ)
шифр Конечная концентрация, мкг/мл
00,22 0,270,3 0,360,43 0,540,72 1,12,2
НФГ 30,0±1,832,3±2,7 33,9±2,5 36,1±3,0*37,2±3,3* 38±4,0* 43,4±3,8** 51,4±4,4** 69,5±6,7*** 114,7±12,3***
НМГр31,7±1,5 32,8±3,7 35,8±2,836,7±3,5* 37,5±3,5* 42,6±3,9** 49,9±4,1** 68,7±5,9*** 110±9,9***
* - р<0.05, ** - р<0.01 и *** - р<0.001 достоверность различий с показаниями при конечной концентрации гепаринов 0 мкг/мл

Таблица 2
Время появления сгустка плазмы (сек) в тесте РеаКлот
шифр Конечная концентрация, мкг/мл
00,07 0,140,18 0,230,28 0,350,47
НФГ 19,4±1,320,0±2,3 20,2±2,1 20,8±1,722,1±1,9 22,5±2,0 28,8±2,4** 37,9±2,8***
НМГр20,9±1,5 21,8±1,9 24,5±2,1*26,1±2,3** 27,2±1,9** 33,6±2,5*** 43,8±3,1**
* - р<0.05, ** - р<0.01 и *** - р<0.001 достоверность различий с показаниями при конечной концентрации гепаринов 0 мкг/мл

Таким образом, при деполимеризации нефракционированного гепарина (отношение активностей aXa/aIIa=0,9) лизоцимом в растворе мы получаем гепарин с молекулярной массой, меньшей в сравнении с исходным НФГ. При этом отношение активностей аХа /aIIa увеличивается в 1,2 раза.

Список литературы

1. Г.Е.Банникова, В.П.Варламов, Н.Н.Дрозд, В.А.Макаров, В.Е.Тихонов, К.Г.Скрябин, патент РФ № 2295538 от 20 марта 2007 г., Бюлл. Открыт., № 5 (2007).

2. Бернхард С., Структура и функция ферментов. М., 1971.

3. Ильина А.В., Варламов В.П. Ферментативная деполимеризация N-сукцинилхитозана. Биоорг.Хим. 2007; 33(1):156-9.

4. Bates SM, Weitz JI // Circulation. 2005. V 112. N 4. P 53-60.

Класс A61K31/727 гепарин; гепаран

способ коррекции тромбофилических нарушений гемостаза во время беременности -  патент 2524653 (27.07.2014)
способ выбора тактики ведения беременных с плацентарной недостаточностью и синдромом задержки роста плода -  патент 2517374 (27.05.2014)
метод лечения андрогенной алопеции: местное нанесение на очаги облысения гепарина (в составе препаратов для местного лечения) -  патент 2517087 (27.05.2014)
композиция для костной пластики (варианты) -  патент 2516921 (20.05.2014)
способ лечения варикозной болезни нижних конечностей с использованием эндовазальной лазерной коагуляции вен -  патент 2514337 (27.04.2014)
способ получения низкомолекулярного гепарина -  патент 2512768 (10.04.2014)
раствор для получения покрытия на имплантатах и биоматериалах -  патент 2509554 (20.03.2014)
способ лечения дистрофических и воспалительных заболеваний переднего и заднего отделов глаза -  патент 2508920 (10.03.2014)
способ ведения пациентов при тромбоэмболии легочной артерии -  патент 2506899 (20.02.2014)
средство для роста волос (варианты) и способ лечения облысения -  патент 2503446 (10.01.2014)

Класс C08B37/10 гепарин; его производные

способ получения низкомолекулярного гепарина -  патент 2512768 (10.04.2014)
поперечно сшитые полисахаридные и белковые матрицы и способы их получения -  патент 2472809 (20.01.2013)
противовоспалительное средство с антикоагулянтной, противоопухолевой и антиметастатической активностью -  патент 2412712 (27.02.2011)
способ получения гепарина с низкой молекулярной массой и антикоагулянтной активностью -  патент 2396282 (10.08.2010)
производные полисахаридов с высокой антитромботической активностью в плазме -  патент 2361881 (20.07.2009)
смеси олигосахаридов, являющихся производными гепарина, способ их получения и содержащие их фармацевтические композиции -  патент 2346005 (10.02.2009)
эпимеризованные производные полисахарида к5 с высокой степенью сульфатирования -  патент 2333222 (10.09.2008)
смесь полисахаридов, являющихся производными гепарина, их получение и фармацевтические композиции, их содержащие -  патент 2332424 (27.08.2008)
способ получения гепаринов с низкой молекулярной массой -  патент 2295538 (20.03.2007)
гликозаминогликаны, производные к5-полисахарида, обладающие высокой антикоагулянтной и антитромботической активностью, и способ их получения -  патент 2283319 (10.09.2006)
Наверх