способ экспресс-оценки качества и биологической ценности молока

Формула изобретения

Способ оценки качества и биологической ценности молока, включающий проведение железоиндуцированной хемилюминесценции с добавлением к 10 мл молока 1 мл 5·10^-2 М раствора сернокислого железа, измерение светосуммы свечения продукта проводят методом хемилюминесцентного анализа на «Хемилюминомере ХЛ-003» в течение 5 мин при температуре 25°С, значениях рН молока от 6,55 до 6,75, определения светосуммы и максимальной светимости хемилюминесценции при их значениях соответственно менее 3,5 у.е. и менее 0,85 у.е., соответственно продукт оценивают как сохранивший качество и биологическую ценность.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к методам оценки качества и биологической ценности молока, и может быть использовано для контроля биологической сохранности молока.

Известны следующие способы оценки качества молока путем определения:

1. перекисного числа молочного жира, отражающего способность пероксидов взаимодействовать с йодидом калия. Количественно перекисное число выражают в процентах йода, восстановленного 100 г жира [Охрименко О.В. Лабораторный практикум по химии и физике молока / О.В.Охрименко, К.К.Горбатова, А.В.Охрименко. - СПб.: ГИОРД, 2005, - С.186-190; 165-169]. Недостаток метода состоит в том, что он позволяет определять только содержание первичных продуктов окисления - пероксидов и гидропероксидов;

2. йодного числа молочного жира, основанный на способности непредельных жирных кислот присоединять йод [там же]. Недостаток данного способа состоит в том, что он позволяет определять лишь процентное соотношение насыщенных жирных и ненасыщенных жирных кислот в составе молочного жира;

3. титруемой кислотности молока, метод основан на нейтрализации кислых соединений, содержащихся в молоке, щелочью с применением индикатора фенолфталеина [Молоко и молочные продукты. Общие методы анализа. - М.: ИПК Издательство стандартов, 2001, - С.24-25; 99-100]. Недостаток данного способа в том, что на его показатели влияют широкий спектр факторов, а именно: состав рационов, порода, возраст, индивидуальные особенности, лактационный период и состояние минерального обмена животных;

4. активности редуктаз, метод основан на определении активности ферментов, относящихся к классу оксидоредуктаз (дегидрогеназ) [там же]. Данный метод позволяет косвенно судить о бактериальной обсемененности молока, не отражая другие показатели, обуславливающие в совокупности качественные характеристики молочного продукта.

Пороки молока биохимического происхождения отчасти обуславливаются процессами окисления жиров. В первую очередь окисляются полиненасыщенные жирные кислоты, содержащиеся в фосфолипидах оболочек жировых шариков и свободном жире [Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов. - 3-е изд., перераб. и доп.- СПб.: ГИОРД, 2003, - С.125-127]. Полиненасыщенные жирные кислоты играют роль незаменимых компонентов при биосинтезе липидов клеточных мембран и биологически активных веществ, в частности эйказаноидов. Окисление ненасыщенных жирных кислот происходит при действии неблагоприятных факторов - неправильной технологической подготовке молока, длительном хранении и т.д. Оно может протекать как с разрывом, так и без разрыва двойных связей, то есть по свободнорадикальному механизму с образованием токсических продуктов - кетонов, гидроперекисей и т.д. Окисление липидов молока, которые, попадая в организм, входят в структуру биомембран и влияют на их функциональную активность, наряду с накоплением токсических перекисей, снижает биологическую ценность молочных продуктов. В этой связи встает вопрос о разработке экспресс-методов оценки состояния свободнорадикального окисления в липидах молока, критериев контроля безопасности и биологической ценности молочных продуктов.

Получить представления о процессах перекисного окисления липидов можно измеряя концентрацию начальных, промежуточных и конечных продуктов, участвующих в окислении. Известно определение интенсивности и скорости процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) путем измерения диеновых конъюгатов (появляются на начальных этапах перекисного окисления), гидроперекисей липидов (обнаруживаются на поздних этапах перекисного окисления) и малонового диальдегида (является конечным продуктом перекисного окисления).

Способы, основанные на определении промежуточных и конечных продуктов окисления, не всегда дают возможность судить о скорости и интенсивности реакций свободнорадикального окисления липидов. Так, определение диеновых, триеновых конъюгатов, гидроперекисей требует выделения из исследуемого материала липидов. Исследования должны проводиться в строго контролируемых, специально подобранных условиях, исключающих разрушение или образование продуктов окисления во время подготовки объекта [Владимиров Ю.А., Арчанов А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972, - С.236-237].

Имеет ограничения и метод определения малонового диальдегида, образующего окрашенный комплекс с тиобарбитуровой кислотой: этот продукт появляется, главным образом, при автоокислении жирных кислот и, следовательно, он неприемлем при сравнении скоростей перекисного окисления липидов в системах, резко отличающихся по составу жирных кислот. Более того, некоторые продукты, не имеющие отношения к перекисному окислению липидов, также реагируют с тиобарбитуровой кислотой, давая окрашенные комплексы с близкими максимумами поглощения, искажающими результаты исследования. Сложность применения этого метода состоит, прежде всего, в его неспецифичности, так как источником малонового диальдегида могут быть продукты разложения ДНК и других нелипидных молекул [Фаткуллина Л.Д., Голощапов А.Н. Определение пероксидного окисления липидов в эритроцитах по тесту с тиобарбитуровой кислотой // Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения: Сб. докл. М.: Изд-во РУДН, 2005, - С.35-39].

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ оценки качества молочных продуктов путем регистрации радикалов с использованием метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) [Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. - М.: Высшая школа, 1989, - С.164].

Однако использование метода электронного парамагнитного резонанса для оценки интенсивности реакций ПОЛ ограничено в связи с относительно низкой чувствительностью метода и невозможностью идентифицировать процессы, ответственные за сигнал ЭПР.

Задачей изобретения является упрощение способа оценки, сокращение времени исследования.

Технический результат при использовании изобретения - повышение достоверности способа за счет определения интенсивности реакций перекисного окисления липидов, про- или антиоксидантных свойств биологически активных веществ в составе молока, сокращение времени исследования.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе, включающем определение перекисного окисления липидов, проводят железоиндуцированную хемилюминесценцию по программе: «Мешалка - быстро», «Термостат - включен», «Время измерения - 5 минут» при температуре среды 25°С, значениях рН молока от 6,55 до 6,75, определяют светосумму и максимальную светимость хемилюминесценции и при их значениях соответственно менее 3,5 у.е. и менее 0,85 у.е. продукт оценивают как сохранивший качество и биологическую ценность.

Предлагаемый способ экспресс-оценки качества и биологической ценности молочных продуктов осуществляется следующим образом. Настраивают прибор Хемилюминомер (ХЛ-003) по программе: «Мешалка - быстро», «Термостат - включен», «Время измерения - 5 минут». В кювету прибора помещают 10 мл молочного продукта, индуцируют хемилюминесценцию введением в молоко 1 мл 5·10^-2 М раствора сернокислого железа (FeSO·7H ₂O) при температуре в среде исследования 25°С и значениях рН молока от 6,55 до 6,75. Определяют светосумму и максимальную светимость хемилюминесценции и при их значениях соответственно менее 3,5 у.е. и менее 0,85 у.е. продукт оценивают как сохранивший качество и биологическую ценность.

Интенсивность процессов сверхслабого свечения молока, регистрируемая методом хемилюминесцентного анализа, обуславливается, в свою очередь, скоростью реакций свободнорадикального перекисного окисления липидов. Низкая интенсивность сигнала спонтанного свечения - одно из препятствий в применении метода хемилюминесцентного анализа. В связи с этим применяют активаторы хемилюминесценции. Кроме того, на интенсивность свечения влияют как температура, так и концентрация водородных ионов в образце.

Предлагаемый способ иллюстрируется чертежом, на котором представлена запись хемилюминесценции молока пастеризованного: на 1 (I), 3 (II) и 5 сутки хранения (III).

Пример 1

Исходные данные для исследования: молоко пастеризованное с жирностью 3,2% 3 видов: I-серия - на 1 сутки хранения (контроль); II-серия - на 3 сутки хранения; III-серия - на 5 сутки хранения. Исследования проводили на хемилюминомере ХЛ-003, настроенном по программе: «Мешалка - быстро», «Термостат включен», «Время измерения - 5 мин». Температура молока 25°С, рН - 6,55. Свечение индуцировали добавлением к 10 мл исследуемого молока 1 мл 5·10^-2 М раствора сернокислого железа. Результаты оценивали по светосумме хемилюминесценции (ХЛ), которая является интегральным показателем процессов перекисного окисления липидов [Фархутдинов P.P., Тевдорадзе С.И. Методики исследования хемилюминесценции биологического материала на хемилюминомере ХЛ-003 // Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения: Сб. докл. М.: Изд-во РУДН, 2005, - С.147-155]. Записи хемилюминесценции различных проб молока представлены на чертеже, а цифровые данные приведены в таблице 1.

Как видно из данных (табл.1), светосумма свечения молока увеличилась с 3,40±0,16 у.е. в контроле до 3,72±0,25 у.е. во II-серии (р<0,05), что свидетельствует об интенсификации процессов ПОЛ молока в процессе хранения. На 5-е сутки хранения молока светосумма свечения возросла до 3,83±0,14 у.е. против 3,40±0,16 у.е. в контроле (р<0,05).

Пример 2

Изучение процессов перекисного окисления липидов молока при различных температурных режимах тепловой обработки.

При исследовании ХЛ использовали молоко четырех видов:

- пастеризованное при температуре 76±2°С с выдержкой 15-20 с и охлаждением до 4-6°С (I-я серия);

- стерилизованное при температуре 130-150°С с выдержкой 2-3 с и последующим охлаждением до 20-22°С (II-я серия);

- топленое - выдержанное в течение 3-4 часов при температуре 95-99°С (III-я серия);

- молоко, не подвергнутое температурной обработке (IV-я серия).

Кратковременное воздействие высоких температур используется при проведении пастеризации и стерилизации молока. При этом достигается понижение содержания бактерий или частичное угнетение их активности.

Однако длительное действие высоких температур, как известно, может оказывать негативное влияние на химический состав молока и его технологические свойства: нарушать нативную структуру белков, способствовать гидролизу его пептидных связей и разрушению белково-липидных комплексов. Температурная обработка (100°С и более) разрушает лецитино-белковые оболочки жировых шариков, способствует росту интенсивности и скорости реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ). Этот процесс сопровождается образованием альдегидов и кетонов, которые изменяют физико-химические свойства продукта.

В таблице 2 представлены основные параметры ХЛ четырех сравниваемых между собой видов молока: I - молоко натуральное, не подвергнутое температурной обработке; II - пастеризованное при 75°С; III - стерилизованное при температуре 130-150°С; IV - топленое при температуре 95-99°С и выдержанное при этой же температуре в течение 3-4 часов.

Полученные данные показывают, что показатели ХЛ у пастеризованного молока (II-серия) несколько выше аналогичных значений ХЛ молока, не подвергнутого температурной обработке (I-серия). Так, если во II-серии опытных образцов светосумма свечения составила 2,82±0,46 у.е., спонтанная светимость - 0,27±0,06 у.е., вспышка 1,41±0,09 у.е., максимальная светимость - 0,77±0,09 у.е., то в I-серии эти показатели соответственно составили - 1,69±0,31 у.е., 0,32±0,03 у.е., 1,51±0,08 у.е., 0,53±0,04 у.е.

В стерилизованном молоке (III-серия) значительно возросли показатели ХЛ по сравнению с молоком I-серии: светосумма свечения молока составила 7,14±0,38 у.е., спонтанная светимость - 0,35±0,01 у.е., вспышка 2,53±0,04 у.е., максимальная светимость - 2,12±0,09 у.е.

В топленом молоке отмечали повышение интенсивности свечения вследствие активизации процессов свободнорадикального окисления: светосумма свечения 29,82±4,54 у.е., спонтанная светимость - 1,11±0,12 у.е., вспышка 9,02±0,65 у.е., максимальная светимость - 10,64±0,81 у.е.

Таким образом, в ходе проведенных исследований было установлено, что на интенсивность и скорость реакций свободнорадикального окисления липидов молока в значительной степени влияют температура и длительность обработки: определены относительно низкие значения светосуммы свечения при щадящих режимах температурной обработки (2,82±0,46 у.е.), а при более высоких температурах (95-99°С и 130-150°С) показатели ХЛ возросли соответственно до 7,14±0,38 у.е. и 29,82±4,54 у.е.

Таблица 1
Показатели хемилюминесценции молока пастеризованного жирностью 3,2%: 1, 3 и 5 сутки хранения (М±m, n=10)
Серия	Показатели хемилюминесценции
Светосумма, у.е.	Спонтанная светимость, у.е.	Вспышка, у.е.	Максимальная светимость, у.е.
I-серия (контроль)	3,40±0,16	0,30±0,02	1,37±0,03	0,85±0,04
II-серия	3,72±0,25	0,36±0,01	1,40±0,04	0,92±0,06
III-серия	3,83±0,14	0,38±0,01	1,48±0,03	1,00±0,04
Примечание: приведены средние значения 10 измерений

Таблица 2
Показатели ХЛ молока при разных температурных режимах пастеризации и стерилизации (М±m, n=10)
Общие сведения	Показатели хемилюминесценции
Светосумма, у.е.	Спонтанная светимость, у.е.	Вспышка, у.е.	Максимальная светимость, у.е.
Молоко, не подвергнутое температурной обработке (контроль), - I серия	1,69±0,31	0,32±0,03	1,51±0,08	0,53±0,04
Молоко, пастеризованное при температуре 76±2°С, - II серия	2,82±0,46	0,27±0,06	1,41±0,09	0,77±0,09*
Молоко, стерилизованное при температуре 130-150°С, - III серия	7,14±0,38*	0,35±0,01	2,53±0,04*	2,12±0,09
Молоко, топленое при температуре 95-99°С, - IV серия	29,82±4,54*	1,11±0,12*	9,02±0,65	10,64±0,81*
* - различие с контролем статистически значимо (р 0,05)