производное инсулинотропного пептида, содержащее модифицированную n-концевую аминокислоту

Формула изобретения

1. Производное эксендина-4, где N-концевой остаток гистидина эксендина-4 заменен фрагментом, выбранным из группы, состоящей из N-диметилгистидила, бета-гидрокси-имидазопропионила, 4-имидазоацетила и бета-карбоксиимидазопропионила, которое проявляет увеличенную стабильность в крови и улучшенную активность по сравнению с эксендином-4.

2. Производное эксендина-4 по п.1, где производное эксендина-4 состоит из аминокислотной последовательности следующей формулы 1:

(1)

где R1 выбирают из группы, состоящей из N-диметилгистидила, бета-гидрокси-имидазопропионила, 4-имидазоацетила и бета-карбоксиимидазопропионила;

R2 выбирают из группы, состоящей из -NH₂ или -ОН;

Х выбирают из группы, состоящей из Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser и Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly;

Y выбирают из группы, состоящей из Lys, Ser и Arg; и

Z выбирают из группы, состоящей из Lys, Ser и Arg.

3. Производное эксендина-4 по п.2, где R1 представляет собой N-диметилгистидил, Y представляет Lys или Ser, Z представляет собой Lys и R2 представляет собой -NH₂.

4. Производное эксендина-4 по п.2, где R1 представляет собой 4-имидазоацетил, Y представляет Lys или Ser, Z представляет собой Lys и R2 представляет собой -NH₂.

5. Производное эксендина-4 по п.2, где R1 представляет собой бета-гидрокси-имидазопропионил, Y представляет Lys или Ser, Z представляет собой Lys и R2 представляет собой -NH₂.

6. Производное эксендина-4 по п.2, где R1 представляет собой бета-карбокси-имидазопропионил, Y представляет Lys или Ser, Z представляет собой Lys и R2 представляет собой -NH₂.

7. Фармацевтическая композиция для лечения диабета, включающая эффективное количество производного эксендина-4 по п.1 и фармацевтичесчки приемлемый носитель.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к производному инсулинотропного пептида, обладающему улучшенной инсулинотропной активностью. Конкретно, настоящее изобретение относится к инсулинотропному пептиду, содержащему модифицированную N-концевую аминокислоту, обладающему высокой стабильностью и инсулинотропной активностью.

Уровень техники

Пептиды имеют тенденцию легко подвергаться денатурации по причине их низкой стабильности, они разлагаются in-vivo под действием протеолитических ферментов, теряя, таким образом, свою активность, и имеют относительно небольшой размер, благодаря чему легко проходят через почечный барьер. Соответственно, с целью поддержания уровня в крови и титра лекарственного средства, включающего пептид в качестве эффективного компонента, необходимо часто вводить пептидное лекарственное средство пациенту для поддержания его целевого уровня в крови и для поддержания целевого титра. Однако пептидные лекарственные средства обычно вводят в форме инъецируемых препаратов, и такое частое введение, предназначенное для поддержания уровня физиологически активных пептидов в крови, вызывает у пациентов сильную боль. Для разрешения этих проблем было сделано много попыток. В качестве одной из таких попыток был предложен способ, при котором увеличивалось прохождение пептидного лекарственного средства через биологическую мембрану, и затем осуществлялся перенос пептидного лекарственного средства в организм с помощью ротоглоточной или носоглоточной ингаляции. Однако этот способ все еще является трудным для поддержания in-vivo-активности пептидного лекарственного средства благодаря значительно более низкой in-vivo-эффективности переноса по сравнению с инъецируемыми препаратами.

С другой стороны, было сделано много попыток для улучшения стабильности пептидных лекарственных средств в крови и для поддержания высокого уровня лекарственных средств в крови в течение продолжительного периода времени, за счет чего достигается их максимальная фармацевтическая эффективность. Таким образом, для препарата продолжительного действия такого пептидного лекарственного средства требуется увеличение стабильности пептидного лекарственного средства и поддержание титра на достаточно высоком уровне, чтобы не вызывать при этом иммунного ответа у пациентов.

В качестве метода стабилизации пептидов и ингибирования деградации протеолитическими ферментами были осуществлены некоторые попытки модификации определенной аминокислотной последовательности, которая является чувствительной к протеолитическому ферменту. Например, GLP-1 (7-37 или 7-36 амид), функция которого заключается в уменьшении концентрации глюкозы в крови при лечении диабета Типа 2, имеет короткий полупериод физиологической активности, составляющий примерно 4 минуты или менее (Kreymann et al., 1987), благодаря потере титра GLP-1 в результате расщепления между 8-й аминокислотой (Ala) и 9-й аминокислотой (Asp) с помощью дипептидил пептидазы IV (DPP IV). В результате, были осуществлены разнообразные исследования на аналогах GLP-1, имеющих устойчивость к DPP IV, и были осуществлены попытки замены Ala⁸ на Gly (Deacon et al., 1998; Burcelin et al., 1999), или на Leu или D-Ala (Xiao et al., 2001), таким образом, увеличивая устойчивость к DPP IV, поддерживая при этом активность аналогов. N-концевая аминокислота His⁷ в GLP-1 является критической для активности GLP-1, и служит в качестве мишени для DPP IV. Соответственно, в Патенте US № 5545618 описано, что N-конец модифицируют с помощью алкильной или ацильной группы, и у Gallwitz, et al. описано, что His ⁷ подвергают N-метилированию или альфа-метилированию, или His полностью заменяют на имидазол для увеличения устойчивости к DPP IV, и для поддержания физиологической активности. В связи с тем, что устойчивость к депептидил пептидазе увеличивают для улучшения стабильности производных, модифицированные по His ⁷ производные, как обнаружено, обладают заметно меньшей аффинностью к рецептору с меньшим стимулированием cAMP при той же концентрации (Gallwitz. et al., Regulatory Peptide 79:93-102 (1999), Regulatory Peptide 86:103-111 (2000)).

Дополнительно к GLP-1, эксендины представляют собой пептиды, которые обнаружены в яде ящерицы (glia monster), широко распространенной в Аризоне и в северной Мексике. Эксендин-3 присутствует в яде Heloderma horridum, и эксендин-4 присутствует в яде Heloderma suspectum. Эксендины имеют высокую степень гомологии, составляющую 53%, с GLP-1 (Goke, et al., J. Bio. Chem., 268:19650-55 (1993)). Эксендин-4, согласно имеющимся сведениям, действует на GLP-1-рецепторы на определенных секретирующих инсулин-клетках, на диспергированных ацинарных клетках поджелудочной железы морской свинки и на париетальных клетках желудка, и также сообщается, что пептид стимулирует высвобождение соматостатина и ингибирует высвобождение гастрина в изолированных желудках. Кроме того, согласно имеющимся сведениям было обнаружено, что эксендин-3 и эксендин-4 стимулируют продуцирование cAMP в панкреатических ацинарных клетках и стимулируют высвобождение амилазы из панкреатических ацинарных клеток. Так как эксендин-4 (Патент US № 5424686) содержит последовательность His-Gly вместо His-Ala, которая функционирует в качестве субстрата дипептидил пептидазы в GLP-1, то он обладает устойчивостью к DPP IV, и более высокой физиологической активностью, чем GLP-1. В результате, in-vivo он имеет период полужизни, составляющий 2-4 часа, который продолжительнее, чем у GLP-1. Хотя нативный эксендин in-vivo имеет увеличенный период полужизни по сравнению с GLP-1, его физиологическая активность не поддерживается в достаточной степени. Например, в случае коммерчески доступного эксендина-4 (эксенатид (exenatide)), его необходимо инъецировать пациенту дважды в день, что является затруднительным для пациентов.

Для улучшения терапевтической эффективности нативного эксендина были сделаны попытки получения его аналогов, производных и вариантов. Термин "аналог или вариант" обычно обозначает пептид, полученный с помощью замены, делеции или вставки одной или более аминокислот в нативный пептид или из нативного пептида. Термин "производное" обозначает химически модифицированный пептид, полученный с помощью алкилирования, ацилирования, этерификации или амидирования одной или более аминокислот в нативном пептиде.

Новые соединения - агонисты эксендина описаны в Заявке PCT № PCT/US 98/16387. В Патенте US № 6956026, имеющем приоритет по этой заявке, раскрыт способ уменьшения приема пищи с применением эксендина. Кроме того, в EP 0996459 с приоритетом, основанным на заявке PCT, раскрыто применение эксендинов и их аналогов для уменьшения приема пищи, и в Патенте US № 7157555 описаны соединения - агонисты эксендина. Однако они раскрывают только последовательности аналогов эксендина. Кроме того, не упоминаются активность и свойства указанных аналогов, что также не подтверждено подробным описанием.

Описание

Техническая задача

Соответственно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что производные эксендина, содержащие модифицированный His¹ , демонстрируют более высокую стабильность в крови и инсулинотропную активность по сравнению с нативным эксендином, и таким образом создали настоящее изобретение.

Техническое решение

Целью настоящего изобретения является предложение производных инсулинтропного пептида, обладающих улучшенной стабильностью в крови и улучшенной инсулинотропной активностью.

Другой целью настоящего изобретения является предложение фармацевтической композиции, предназначенной для лечения диабета, включающей производное инсулинотропного пептида, обладающее улучшенной инсулинотропной активностью.

Описание чертежей

На Фиг.1 продемонстрирована стабильность производных эксендина-4 в сыворотке. A:эксендин-4, D:DA-эксендин-4, H:HY-эксендин-4, C:CA-эксендин-4.

На Фиг.2 продемонстрированы инсулинотропные активности эксендина-4 и производного эксендина-4, CA-эксендина 4.

На Фиг.3 продемонстрирован эффект понижения уровня глюкозы в крови в результате действия эксендина-4 и CA-эксендина-4 у животных моделей диабета.

Лучший способ осуществления изобретения

Согласно аспекту, настоящее изобретение относится к производному инсулинотропного пептида, обладающему улучшенной стабильностью в крови и улучшенной инсулинотропной активностью.

Производное, согласно настоящему изобретению, представляет собой производное, содержащее химически модифицированный N-концевой остаток гистидина, или производное, содержащее химически модифицированную аминогруппу N-концевого остатка гистидина.

Предпочтительно, инсулинотропный пептид согласно настоящему изобретению представляет собой эксендин-4, эксендин-3 или их производные. При использовании здесь термин "производное эксендина-4 или эксендина-3" обозначает пептид, полученный путем замены, делеции и/или вставки одной или более аминокислот в эксендине-4 или в эксендине-3, или пептид, содержащий один или более химически модифицированные аминокислотные остатки, например модифицированные с помощью алкилирования, ацилирования, этерификации или амидирования, причем активность этого пептида эквивалентна активности нативного эксендина-4.

В качестве примеров производных эксендина-3 или эксендина-4 в WO 97/46584 раскрыто получение производного эксендина-4 с помощью делетирования C-конца эксендина-4 или замены аминокислоты эксендина-4 на синтетическую аминокислоту Норлейцин. Также, в WO 99/07404 раскрыты производные эксендина, в которых аминокислоты заменены на синтетические аминокислоты, например пентил-глицин, гомопролин или трет-бутил-глицин, и в US 2008/0119390 раскрыты производные эксендина, состоящие из укороченных по сравнению с нативным эксендином-4 аминокислотных последовательностей, полученные путем делетирования некоторых аминокислотных остатков в эксендине-4, и полученные путем замены некоторых аминокислотных остатков в эксендине-4 на другие аминокислотные остатки. Эти публикации введены в настоящее описание с помощью ссылок.

Конкретно, настоящее изобретение также может охватывать его производное с удаленной аминогруппой N-концевого гистидина (дезамино-гистидил-производное), его производное, полученное путем замены аминогруппы на гидроксильную группу (бета-гидрокси-имидазопропионил-производное), его производное, полученное путем модификации аминогруппы с помощью двух метильных остатков (диметил-гистидил-производное), его производное, полученное путем замены аминогруппы на карбоксильную группу (бета-карбокси-имидазопропионил-производное) или его производное с удаленным положительным зарядом аминогруппы, в которой альфа-атом углерода N-концевого остатка гистидина удален с сохранением только имидазоацетильной группы (имидазоацетил-производное), и другие производные, содержащие модифицированную N-концевую аминогруппу.

Предпочтительно, в настоящем изобретении предлагаются производные эксендина-4, содержащие химически модифицированную N-концевую аминогруппу или аминокислотный остаток, более предпочтительно, производное эксендина-4, в котором альфа-аминогруппа или альфа-атом углерода N-концевого остатка гистидина (первая аминокислота эксендина-4) заменена или удалена, и еще более предпочтительно, дезамино-гистидил-эксендин-4 (DA-Эксендин-4) с удаленной N-концевой аминогруппой, бета-гидрокси-имидазопропионил-эксендин-4 (HY-эксендин-4), полученный путем замены аминогруппы на гидроксильную группу, бета-карбокси-имидазопропионил-эксендин-4 (CX-эксендин-4), полученный путем замены аминогруппы на карбоксильную группу, диметил-гистидил-эксендин-4 (DM-эксендин-4), полученный путем модификации аминогруппы с помощью двух метильных остатков, и имидазоацетил-эксендин-4 (CA-эксендин-4) с удаленным альфа-атомом углерода N-концевого остатка гистидина.

Согласно определенному аспекту, настоящее изобретение относится к производному инсулинотропного пептида, включающего аминокислотную последовательность следующей Формулы 1.

R1-X-R2 <Формула 1>,

где R1 выбирают из группы, состоящей из дезаминогистидила, N-диметилгистидила, бета-гидрокси-имидазопропионила, 4-имидазоацетила и бета-карбокси-имидазопропионила;

R2 выбирают из группы, состоящей из -NH₂ , -OH и -Lys;

X выбирают из группы, состоящей из Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly и Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser;

Y выбирают из группы, состоящей из Lys, Ser и Arg; и

Z выбирают из группы, состоящей из Lys, Ser и Arg.

Предпочтительное производное инсулинотропного пептида имеет Формулу 1, где R1 выбирают из дезаминогистидила, N-диметил-гистидила, бета-гидрокси-имидазопропионила, 4-имидазоацетила и бета-карбокси-имидазопропионила, Y представляет собой Lys или Ser, Z представляет собой Lys, и R2 представляет собой -NH ₂.

Согласно другому определенному аспекту, настоящее изобретение относится к производному инсулинотропного пептида, включающего аминокислоту следующей Формулы 2.

R3-X'-R4 <Формула 2>,

где R3 представляет собой 4-имидазоацетил;

X' представляет собой Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser или

Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly;

R4 представляет собой -NH₂;

Y выбирают из группы, состоящей из Lys, Ser и Arg; и

Z выбирают из группы, состоящей из Lys, Ser и Arg.

В отношении их активности химическая модификация в N-концевом остатке гистидина эксендина-4 имеет отличный эффект по сравнению с другим инсулинотропным пептидом GLP-1. Можно ожидать, что GLP-1, содержащий химическую модификацию в N-концевом остатке гистидина, например, -метил-GLP-1, n-метил-GLP-1 или imi-GLP-1, будет ингибировать деградацию с помощью дипептидил пептидазы, посредством чего увеличится стабильность, и, собственно, имеются сообщения о практическом уменьшении степени деградации. Однако также имеются сообщения о том, что такие модифицированные соединения обладают относительно низкой аффинностью к рецептору с уменьшенным стимулированием cAMP по сравнению с нативным GLP-1.

Напротив, так как эксендин-4 не расщепляется с помощью дипептидил пептидазы, трудно предсказать эффект химической модификации в N-концевом остатке гистидина на активность модифицированного соединения, конкретно, на его влияние на аффинность к рецептору и на концентрацию глюкозы в крови.

Соответственно, в настоящем изобретении предлагается производное эксендина-4, содержащее химически модифицированный N-концевой остаток гистидина, или содержащее химически модифицированную аминогруппу N-концевого остатка гистидина, которое демонстрирует неожиданно превосходную инсулинотропную активность по сравнению с нативным эксендином-4. Эти производные in vitro демонстрируют превосходную стабильность в крови и превосходную инсулинотропную активность по сравнению с эксендином-4 (Фиг.2). Практически, было обнаружено для диабетических мышей db/db, что эти производные демонстрируют превосходный эффект уменьшения концентрации глюкозы в крови по сравнению с нативным эксендином-4 (Фиг.3). Считается, что изменение общего заряда благодаря модификации аминогруппы N-концевого остатка гистидина вызывает различия в чувствительности к протеолитическому воздействию в крови или влияет на аффинность к рецептору. Однако все еще существует необходимость более широких молекулярных исследований производных. Ожидается, что такое свойство усиливает собственную инсулинотропную активность эксендина-4, а именно терапевтический эффект при диабете типа 2, и индуцирует уменьшение приема пищи, задержку опорожнения желудка и тому подобное.

Производные эксендина-4, включающие дезамино-гистидил-эксендин-4 (DA-эксендин-4), бета-гидрокси-имидазопропионил-эксендин-4 (HY-эксендин-4), бета-карбокси-имидазопропионил-эксендин-4 (CX-эксендин-4), диметил-гистидил-эксендин-4 (DM-эксендин-4) и имидазоацетил-эксендин-4 (CA-эксендин-4) по настоящему изобретению, получают путем удаления и замены альфа-аминогруппы N-концевого остатка гистидина или путем удаления альфа-атома углерода N-концевого остатка гистидина. Таким образом, присутствие других аминокислотных последовательностей не ограничивается при условии сохранения их активности. Кроме того, специалисту в данной области понятно, что производные эксендина-4 модифицируют с помощью обычного метода, включающего модификацию полимера, такого как PEG и сахарная цепь, и сшивку с альбумином или трансферрином для того, чтобы усилить их терапевтический эффект, превосходящий терапевтический эффект эксендина-4.

Согласно другому аспекту, в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения диабета, включающая производное инсулинотропного пептида.

При использовании в настоящем описании термин "введение" обозначает введение определенного количества вещества пациенту с помощью определенного подходящего метода. Конъюгат по настоящему изобретению вводится посредством любого из обычных путей введения при условии, что он способен достигать целевой ткани. Предполагаются разнообразные способы введения, включающие внутрибрюшинное введение, внутривенное, внутримышечное, подкожное, внутрикожное, пероральное, местное, интраназальное, интрапульмонарное и интраректальное, но настоящее изобретение не ограничено этими приведенными в качестве примера способами введения. Однако поскольку пептиды гидролизуются при пероральном введении, активные ингредиенты композиции для перорального введения должны быть покрыты оболочкой или в композицию должны быть включены компоненты для защиты против деградации в желудке. Предпочтительно, композиция по настоящему изобретению может вводиться в инъецируемой форме. Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться с использованием определенного приспособления, способного транспортировать активные ингредиенты в клетку-мишень.

Фармацевтическая композиция, включающая конъюгат по настоящему изобретению, может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель. Для перорального введения фармацевтически приемлемый носитель может включать связующее вещество, скользящее вещество, дезинтегратор, вспомогательное вещество, солюбилизатор, диспергирующий агент, стабилизатор, суспендирующий агент, красящий агент и отдушку. Для инъецируемых препаратов фармацевтически приемлемый носитель может включать буферный агент, консервирующий агент, анальгетик, солюбилизатор, изотонический агент и стабилизатор. Для препаратов местного введения фармацевтически приемлемый носитель может включать основу, вспомогательное вещество, скользящее вещество и консервирующий агент. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть включена в разнообразные лекарственные формы в комбинации с вышеуказанными фармацевтически приемлемыми носителями. Например, для перорального введения фармацевтическая композиция может быть включена в таблетки, пастилки, капсулы, эликсиры, суспензии, сиропы или пластинки. Для инъецируемых препаратов фармацевтическая композиция может быть включена в единую дозированную форму, такую как многоразовый контейнер, или ампула в качестве одноразовой лекарственной формы. Фармацевтическая композиция также может быть включена в растворы, суспензии, таблетки, пилюли, капсулы и препараты пролонгированного действия.

С другой стороны, примеры носителя, вспомогательного вещества и разбавителя, подходящего для фармацевтических композиций, включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральные масла. Кроме того, фармацевтические композиции могут дополнительно включать наполнители, антикоагулирующие агенты, скользящие вещества, влагоудерживающие вещества, отдушки и антисептики.

Частота введения и дозировка фармацевтической композиции по настоящему изобретению может определяться с помощью нескольких связанных факторов, включающих типы заболеваний, которые необходимо подвергнуть лечению, пути введения, возраст пациента, пол, вес и тяжесть состояния, а также с помощью типов лекарственного средства в качестве активного компонента. Так как фармацевтическая композиция по настоящему изобретению in-vivo обладает превосходной продолжительной эффективностью и титром, то поэтому можно значительно уменьшать частоту введения и дозировку фармацевтических лекарственных средств по настоящему изобретению.

Инсулинотропные производные по настоящему изобретению не раскрыты заявителями прежних изобретений, или приблизительно раскрыты без представления определенных аминокислотных последовательностей, и никогда не проводили сравнения их активностей с активностью нативного эксендина-4, других производных и вариантов. Таким образом, никогда ранее не ожидалось, что производные эксендина-4, чья альфа-аминогруппа или альфа-атом углерода N-конца заменены или делетированы, могут проявлять заметно превосходные активности. Соответственно, превосходная стабильность в сыворотке и инсулинотропная активность производных инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению максимально усиливают терапевтический эффект на диабет типа 2.

Способ осуществления изобретения

В дальнейшем в этом документе для лучшего понимания настоящего изобретения представлены следующие примеры, которые приведены для иллюстрации, и которые не следует понимать как ограничение настоящего изобретения.

Пример 1. Стабильность в плазме производного эксендина-4

Для измерения стабильности в плазме производных эксендина-4, каждое из веществ - нативный Эксендин-4 и производные Эксендина-4, экспонировали в плазме, и количества оставшихся не денатурированных белков измеряли с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой для осуществления теста денатурации в зависимости от времени экспонирования.

В настоящем эксперименте для анализа образцов, экспонированных в плазме, образцы, смешанные с плазмой, депротеинизировали и затем анализировали.

Нативный эксендин-4, дезамино-гистидил-эксендин-4 (DA-Эксендин-4), бета-гидрокси-имидазопропионил-эксендин-4 (HY-эксендин-4), бета-карбокси-имидазопропионил-эксендин-4 (CA-эксендин-4), диметил-гистидил-эксендин-4 (DM-эксендин-4) и имидазоацетил-эксендин-4 (CA-эксендин-4) получали соответственно в концентрации 1 мг/мл. 200 мкл каждого образца производного эксендина-4 смешивали с 200 мкл крысиной сыворотки и проводили реакцию при 37°C в течение каждой из продолжительностей измерения. 100 мкл каждого образца брали в каждый момент времени, соответствующий 0 ч, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 18 ч и 24 ч. 400 мкл охлажденного метанола добавляли к 100 мкл образца для терминации реакции с последующим встряхиванием в течение 20 сек. Каждую смесь центрифугировали при 15000 об/мин в течение 30 мин, и супернатант использовали для анализа.

ВЭЖХ с обращенной фазой проводили с использованием градиента TFA в ACN в качестве подвижной фазы с использованием колонки C18.

Результаты рассчитывали на основании соотношения (%) площади основного пика эксендина-4 к общей площади пика, и результат каждого производного в момент времени 0 ч принимали равным 100%, в результате чего строили график данных образца, демонстрирующий, что соотношение площади основного пика уменьшается при увеличении времени экспонирования.

До момента времени, соответствующего 24 ч, в то время как чистота нативного эксендина-4 уменьшается примерно до 70%, чистота трех производных (формы D, H, C) уменьшилась примерно до 77%, 78%, 77%, соответственно (ФИГ.1).

Пример 2. Измерение in vitro-активности производного эксендина-4

Для измерения эффективности производных эксендина-4, включающих дезамино-гистидил-эксендин-4, оценивали их in-vitro -клеточную активность. Нативный эксендин-4 и производные эксендина-4 синтезировали в American Peptide Corporation. Выделяли клетки инсулиномы или островки Лангерганса, которые, как правило, используют для измерения in-vitro-активности GLP-1, и анализировали изменения продуцирования cAMP при обработке с помощью GLP-1.

В настоящем эксперименте in-vitro-активность измеряли с использованием RIN-m5F (ATCC CRL-11605), которые известны как крысиные клетки инсулиномы, содержащие рецептор GLP-1, благодаря чему их, как правило, используют для измерения in-vitro -активности GLP-1. Клетки RIN-m5F обрабатывали с помощью GLP-1, нативного эксендина-4 и производных эксендина-4, включающих N-концевой- -дезамино-гистидил-Эксендин-4 в различных концентрациях, и затем оценивали продуцирование cAMP с использованием тестируемых веществ для определения величин EC₅₀.

Таблица 1
Тестируемые вещества	EC50 (нМ)	Отношение к Эксендину-4
Эксендин-4	1,21	100
Дезамино-гистидил (DA)-Эксендин-4	0,95	127,4
Диметил-гистидил (DM)-Эксендин-4	1,31	92,4
Имидазоацетил (СА)-эксендин-4	1,2	100
Бета-гидроксипропионил (HY)-эксендин-4	1,3	92,4

Пример 3. Измерение инсулинотропной активности производного эксендина-4

Инсулинотропные активности производных эксендина-4 сравнивали в клетках RINm5F. Клетки RINm5F размораживали и субкультивировали, по меньшей мере, один раз, с последующей инокуляцией в 96-луночные планшеты с плотностью 1×10⁵ клеток/на лунку в культуральной среде, содержащей FBS (Gibco, #11082). Затем клетки культивировали в инкубаторе в присутствии 5% CO₂ при 37°C в течение 48 часов. Культуральную среду меняли на свежую среду, содержащую 0,5% FBS, и затем инкубировали в течение 1 часа. Каждое из веществ, CA-эксендин-4 и эксендин-4 (byetta, Amylin) разводили в культуральной среде, содержащей 0,5% FBS и глюкозу, с получением концентраций от 10 нМ до 0,001 нМ. За исключением образцов эксендина, получали разведенные растворы и использовали в качестве контрольной группы. Удаляли культуральную среду для клеток RINm5F и добавляли к клеткам полученные образцы с последующим культивированием в инкубаторе в присутствии 5% CO₂ при 37°C в течение 1 часа. Затем среду извлекали из каждой лунки. Для определения концентраций инсулина в извлеченной среде использовали набор реагентов ELISA для крысиного инсулина, и полученные результаты продемонстрированы на фиг.2 и в Таблице 2.

Таблица 2
Образец	Отношение максимальной секреции инсулина к контрольной группе
СА Эксендин-4	83,6%
Эксендин-4	43,3%

Как продемонстрировано на фиг.2 и в Таблице 2, обнаружено, что одно из производных эксендина-4, CA эксендин-4 демонстрирует примерно 2-кратное превышение инсулинотропной активности по отношению к нативному эксендину-4 при одной и той же концентрации.

Пример 4. Сравнение in vivo-эффективности производных эксендина-4

Для измерения in vivo-эффективности производных эксендина-4 в крови животных моделей диабета измеряли эффект понижения уровня глюкозы в результате действия производных эксендина-4 по сравнению с нативным эксендином-4. Мышей db/db (Jackson Lab, возраст 10-12) не кормили в течение 2 часов, и затем им вводили эксендин-4 и CA эксендин-4 в количестве 0,01-1000 мкг/кг, соответственно. Через 1 ч собирали образцы крови из хвостовой вены для измерения уровня глюкозы в крови с использованием глюкометра. Эксендин-4, CA эксендин-4 и носитель вводили посредством подкожного пути введения, и рассчитывали % изменения уровня глюкозы в крови по отношению к носителю при каждой концентрации. При каждой концентрации с использованием программы Prism рассчитывали ED₅₀ для эффекта понижения уровня глюкозы (фиг.3, Таблица 3).

Таблица 3
Образец	ED50 (мкг/кг)	R 2
CA эксендин-4	2,3	0,99
Эксендин-4	9,92	0,98

Как продемонстрировано на фиг.3 и в Таблице 3, обнаружено, что CA эксендин-4 демонстрирует примерно 5-кратное превышение эффекта понижения уровня глюкозы в крови по отношению к нативному эксендину-4 у животных моделей диабета.

Промышленная применимость

Производные инсулинотропного пептида согласно настоящему изобретению максимально усиливают собственную инсулинотропную активность эксендина, а именно терапевтический эффект на диабет типа 2, и индуцируют уменьшение приема пищи, задержку опорожнения желудка и тому подобное, превосходя в этом нативный и другие аналоги инсулинотропного пептида. Таким образом, производные инсулинотропного пептида и включающая их фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению могут эффективно использоваться для лечения заболеваний.