выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор, кассета экспрессии, клетка продуцирующая флуоресцентный биосенсор, выделенный флуоресцентный биосенсор

Формула изобретения

1. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный белок со свойствами биосенсора для измерения изменения соотношения НАД+/НАДН внутри клеток, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO:4, где указанный флуоресцентный белок со свойствами биосенсора реагирует увеличением сигнала при смещении соотношения НАД+/НАДН в сторону уменьшения концентрации НАДН.

2. Кассета экспрессии, которая, будучи интегрированной в геном клетки или при введении в клетку в составе внехромосомного элемента, способна обеспечить экспрессию флуоресцентного белка со свойствами биосенсора для измерения изменения соотношения НАД+/НАДН внутри клеток и содержит нуклеиновую кислоту по п.1 под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.

3. Клетка, продуцирующая флуоресцентный белок со свойствами биосенсора, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, содержащая кассету экспрессии по п.2 в составе внехромосомного элемента или элемента, интегрированного в геном этой клетки.

4. Выделенный флуоресцентный белок со свойствами биосенсора для измерения изменения соотношения НАД+/НАДН внутри клеток, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, где указанный флуоресцентный белок со свойствами биосенсора реагирует увеличением сигнала при смещении соотношения НАД+/НАДН в сторону уменьшения концентрации НАДН.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится в основном к области биологии и химии и может быть использовано, в частности, при создании биосенсоров для детекции никотинамидадениндинуклеотида, сконструированных на основе флуоресцентных белков.

Флуоресцентные белки семейства GFP (Green Fluorescent Protein, GFP), включая собственно GFP из медузы Aequorea victoria (avGFP), его мутанты и гомологи, сегодня широко известны благодаря их интенсивному использованию в качестве флуоресцентных маркеров in vivo в биомедицинских исследованиях, что детально рассмотрено Lippincott-Schwartz и Patterson в (Science, 2003, 300(5616):87-91) и Chudakov et al. (J. Physiol Rev., 2010, Jul; 90(3):1103-63).

Флуоресцентные белки способны к флуоресценции при облучением светом подходящей длины волны. Флуоресцентные свойства этих белков обусловлены взаимодействием двух или более аминокислотных остатков, формирующих хромофор, а не флуоресценцией какого-либо одного аминокислотного остатка.

GFP гидромедузы Aequorea aequorea (синоним A. victoria) был описан Johnson et al. как часть биолюминесцентной системы медузы, где GFP играет роль вторичного эммитера, преобразовывающего синий свет от фотобелка экворина в зеленый свет (J. Cell Comp Physiol, 1962, 60:85-104). кДНК, кодирующая A. victoria GFP, была клонирована Prasher et al. (Gene, 1992, 111(2):229-33). Оказалось, что этот ген может быть гетерологично экспрессирован в практически любом организме благодаря уникальной способности GFP автокаталитически образовывать хромофор (Chalfie et al., Science 263, 1994, p.802). Эти сведения открыли широкие перспективы для использования GFP в клеточной биологи в качестве генетически кодируемой флуоресцирующей метки.

GFP был использован в широком спектре приложений, включая исследование экспрессии генов и локализацию белков (Chalfie et al., Science 263, 1994, 802-805; Heim et al. in Proc. Nat. Acad. Sci., 1994, 91: 12501-12504) как инструмент для визуализации внутриклеточного распределения органелл (Rizzuto et al., Curr. Biology, 1995, 5: 635-642) для визуализации транспорта белков по секреторному пути (Kaether and Gerdes, FEBS Letters, 1995, 369: 267-271).

Проведены многочисленные исследования для улучшения свойств avGFP (Aequorea victoria GFP) и для получения вариантов GFP, пригодных и оптимизированных для различных исследовательских целей. Проведена оптимизация генетического кода avGFP (codon usage) для повышения уровня экспрессии в клетках млекопитающих ("гуманизированный" GFP, Haas, et al., Current Biology, 1996, 6: 315-324; Yang, et al., Nucleic Acids Research, 1996, 24: 4592-4593). Получены также различные мутанты GFP, в том числе "усиленный зеленый флуоресцентный белок" (EGFP), имеющий две аминокислотные замены: F64L и S65T (Heim et al., Nature 373, 1995, р.663). Другие мутанты являются синим, голубым и желто-зеленым спектральными вариантами avGFP и содержат замены аминокислотных остатков, формирующих хромофор, и/или остатков, формирующих окружение хромофора.

В 1999 г. гомологи GFP были клонированы из небиолюминесцентных видов Anthozoa (Matz et al., Nature Biotechnol, 1999, 17: 969-973). Это открытие продемонстрировало, что эти белки не являются обязательно компонентом биолюминесцентной системы. GFP-подобные белки из Anthozoa обладают большим спектральным разнообразием и включают циановые, зеленые, желтые, красные флуоресцентные белки и фиолетово-синие нефлуоресцентные хромопротеины (CPs) (Matz et al., Bioessays, 2002, 24(10):953-959). В дальнейшем кДНК GFP-подобных белков были клонированы из ряда гидроидных медуз и из копепод (Shagin et al., Mol Biol Evol, 2004, 21(5):841-850). Сегодня семейство GFP-подобных белков включает сотни флуоресцентных и окрашенных гомологов GFP. Сходство этих белков с GFP варьирует от 80-90% до менее чем 25% идентичности аминокислотной последовательности.

Получены кристаллические структура avGFP дикого типа, GFP S65T мутанта и ряда гомологов GFP (Ormo et al. Science, 1996, 273: 1392-1395; Wall et al. Nat Stmct Biol, 2000, 7: 1133-1138; Yarbrough et al. Proc Nati Acad Sci USA, 2001, 98: 462-467; Prescott et al. Structure (Camb), 2003, 11: 275-284; Petersen et al. J Biol Chem, 2003, 278: 44626-44631; Wilmann et al. J Biol Chem, 2005, 280: 2401-2404; Remington et al. Biochemistry, 2005, 44, p.202; Quillin et al. Biochemistry, 2005, 44: 5774-5787). Было постулировано, что все члены семейства обладают общей 3D структурой (GFP-подобным доменом), представляющей собой так называемый "бочонок" из 11 бета-слоев, образующих компактную встречно-параллельную структуру, внутри которой располагается альфа-спираль, содержащая хромофор. Хромофор формируется внутри GFP-подобного домена путем окислительной циклизации трех консервативных аминокислотных остатков в центральном регионе альфа-спирали (Cody et al., Biochemistry, 1993, 32, p.1212). Положения аминокислотных остатков, формирующих хромофор, соответствует Ser65-Tyr66-Gly67 региону avGFP. Эти аминокислотные остатки легко могут быть идентифицированы у любого GFP-подобного белка путем выравнивания его последовательности с последовательностью avGFP.

Флуоресцентные белки представляют собой уникальное семейство структурно родственных белков, которые способны формировать хромофор автокаталитически без привлечения внешних субстратов или кофакторов. Под действием индуцирующего света хромофор производит флуоресценцию, легко детектируемую с помощью современного лабораторного оборудования (спектрофлуориметр, флуоресцентный микроскоп, флуоресцентно-активируемый клеточный сортер, планшетный флуориметр).

Процесс автокаталитического формирования хромофора белков с различными спектральными свойствами подробно описан в ряде статей и включает несколько химических реакций (Heim et. al. Proc Natl Acad Sci USA. 1994, 91:12501-12504; Ormo et al. Science 1996, 273:1392-1395; Yang et al. Nat Biotechnol. 1996, 14:1246-1251; Brejc et al. J. Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94: 2306-2311; Palm et al. Nat Struct Biol. 1997, 4:361-365; Gurskaya et al., BMC Biochem. 2001, 2:6; Gross et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2000, 97:11990-11995; Wall et al. Nat Struct Biol. 2000, 7:1133-1138; Yarbrough et al., J. Proc Natl Acad Sci USA. 2001, 98:462-467; Pakhomov A.A. and Martynov V.I. Chem. Biol. 2008, 15, 755-764; Quillinet et al. Biochemistry. 2005, 44, p.5774; Yampolsky et al. Biochemistry, 2005, 44, p.5788; Shu et al. Biochemistry. 2006, 45, p.9639; Kikuchi et al. Biochemistry. 2008, 47, p.11573; Yampolsky et al., Biochemistry, 2009, 48 (33), p.8077).

GFP-подобные белки широко используют для создания генетически-кодируемых биосенсоров. Исследование внутриклеточных процессов с помощью таких генетически кодируемых биосенсоров становятся все более популярным, так как только такие сенсоры могут дать информацию об изменении исследуемого параметра непосредственно в живой системе. Такие биосенсоры востребованы как в фундаментальных исследованиях сигнальных путей организма, так и при тестировании токсических и лекарственных препаратов на модельных клеточных линиях или организмах. В сравнении с химическими и физическими методами регистрации биологически активных субстанций биосенсорами, требующими экзогенно добавляемых красителей, субстратов или кофакторов, генетически кодируемые нанобиосенсоры относятся к классу безреагентных и многоразовых сенсоров.

Биосенсоры на основе флуоресцентных белков представляют собой химерные белки, в состав которых входит сенсорный домен - белок, белковый домен или полипептид, чувствительный к изменению определенного параметра клетки, например изменению концентрации какого-либо иона или молекулы (ионов кальция, перекиси водорода, ионов водорода и т.д.). В качестве сигнальной части биосенсора используют GFP-подобные белки или их варианты, подвергнутые круговой пермутации (Suslova and Chudakov, Trends Biotechnol. 2005, 23(12), 605-13; Griesbeck, Curr Opin NeurobioL, 2004, v.14(5), p.636; Bunt and Wouters, Int Rev CytoL, 2004, v.237, p.205).

Создание пермутированных GFP-подобных белков необходимо для увеличения подвижности хромофорного окружения и, следовательно, для большей лабильности спектральных свойств белка. Круговая пермутация флуоресцентных белков описана Topell S. и Glockshuber R. (Methods in Molecular Biology. 2002, 183, p.31). Например, для круговой пермутации avGFP в его первичную структуру вносится разрыв в область между 144 и 149 аминокислотами, нативные N- и С-концы оперативно совмещаются при помощи полипептидного линкера. Новые N- и С-концы находятся в непосредственной близости от хромофора и могут влиять на его микроокружение. Круговая пермутация производится на уровне нуклеиновой кислоты путем оперативного сшивания 3'- и 5'- концов нуклеотидной последовательности, кодирующей флуоресцентный белок, и внесения разрыва в последовательность между кодонами, кодирующими новые N- и С-концевые аминокислоты. Методы для получения таких конструкций хорошо известны специалистам в данной области.

В результате круговой пермутации кпФБ приобретается способность реагировать на конформационные перестройки в области новых N и С-концов изменением спектра флуоресценции (сенсоры с использованием обычных флуоресцентных белков оказались малочувствительными).

Эффективность биосенсоров на основе кпФБ, полученных из avGFP, была продемонстрирована на примере сенсора на ионы кальция (Nagai et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2001, 98(6), p.197) и пероксид водорода (Belousov et al., Nature Method. 2006, 4, p.281).

Одной из важнейших молекул в клетке, для детекции которой востребованы генетически-кодируемые биосенсоры, никотинамидадениндинуклеотид (фиг.1). По химической структуре эта молекула представляет собой динуклеотид. Она построена из амида никотиновой кислоты и аденина, соединенных между собой цепочкой, состоящей из двух остатков D-рибозы и двух остатков фосфорной кислоты. Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) - кофермент, присутствующий во всех живых клетках, входит в состав ферментов группы дегидрогеназ, катализирующих окислительно-восстановительные реакции; выполняет функцию переносчика электронов и водорода, которые принимает от окисляемых веществ. Восстановленная форма (НАДН) способна переносить их на другие вещества.

Окисленные и восстановленные формы никотинамидадениндинуклеотида обладают отличиями в спектрах поглощения (Березов и Коровкин. Биологическая химия. Издательство "Медицина", Москва, 1990). НАД+ имеет узкую полосу поглощения с максимумом при 260 нм благодаря наличию аденина в его структуре. У восстановленной формы этого кофермента появляется вторая полоса поглощения с максимумом при 340 нм, это обусловлено исчезновением одной двойной связи в никотинамидном комплексе кофермента при его восстановлении.

Никотинамидадениндинуклеотид участвует в регуляции многих важнейших процессов клетки, таких как регуляция внутриклеточного Са²⁺, регуляция экспрессии генов. Известно его участие в процессах старения и клеточной гибели. Важным клеточным параметром является соотношение концентрации окисленной и восстановленной форм никотинамидадениндинуклеотида (НАД+/НАДН). НАД+/НАДН индекс отражает окислительно-восстановительный и общий метаболический статус клетки. В цитоплазме значение этого параметра строго регулируется и может изменяться от 700 до 1, в то время как в митохондриях диапазон изменений составляет от 8 до 1 (Weihai Y. Frontiers in Bioscience. 2006, 11, 3129-3148).

В настоящее время существует несколько подходов для определения НАД+ и НАДН в клетках и тканях. В частности, используют энзиматические системы на основе ферментов, которые используют в качестве кофактора НАДН и НАД+ (Liu et al., Reviews in Fluorescence, 2006, 107-124). В качестве примера можно отметить систему на основе лактатдегидрогеназы, осуществляющей превращение пирувата в лактат. Показано, что изменение в системе соотношения пируват/лактат пропорционально изменению соотношения НАД+/НАДН. Кроме того, так как НАДН в отличие от НАД+ обладает флуоресценцией с максимумом при 460 нм, используя алкогольдегидрогеназу и этанол в качестве субстрата, можно наблюдать за изменением интенсивности флуоресценции в данной системе. Главный недостаток этих методов заключается в том, что их применение возможно лишь на биологических экстрактах.

Методов регистрации изменений соотношения НАД+/НАДН в клетках в режиме реального времени до недавнего времени не было разработано. Недавно было предложено несколько вариантов биосенсоров на основе флуоресцентных белков для регистрации изменений соотношения НАД+/НАДН в клетках в режиме реального времени.

В качестве сенсорного домена в этих биосенсорах использован НАДН-связывающий бактериальный белок Rex (Brekasis and Paget, EMBO J. 2003 22, p.4856). Белок Rex является важным регулятором транскрипции компонентов дыхательной цепи в ответ на изменение внутриклеточного НАД+/НАДН индекса у грамположительных бактерий (Brekasis and Paget, EMBO J. 2003, 22, p.4856; Corda and Girolamo, Embo J. 2003, 22, 1953-8).

Белки Rex из представителей самых разных бактерий обладают значительной степенью сходства, около 30% их последовательности является строго консервативной. Для всех них постулирован одинаковый механизм функционирования (Krystle et al., Molecular Cell. 2010, 38, p.563).

Известна кристаллическая структура белка T-Rex (из Thermus thermophilus), а также некоторых других представителей семейства. T-Rex представляет собой димер, каждая субъединица состоит из двух доменов, связанных коротким линкером из пяти аминокислот. N-концевой домен (1-113 аминокислоты) связывает ДНК, главную роль в связывании ДНК играет альфа-3 петля, С-концевой домен (120-211 аминокислоты) отвечает за связывание нуклеотидов и представляет собой мотив Россмана (Wang et al., Molecular Microbiology. 2008, 69(2), p.466). Димерное состояние стабилизировано за счет альфа-спиралей С-концевого домена, в частности альфа-8 спирали, которая расположена в пространстве между двумя доменами, играет в этом важную роль. Молекулы НАДН связываются с каждым С-концевым доменом неподалеку от интерфейса, ответственного за формирование димера (Patschkowski et al., In Bacterial Stress Responses, G.Storz and R.Hengge-Aronis, eds., Washington, DC: ASM Press, 2000, p.61). Это приводит к конформационным изменениям, передающимся на подвижный линкер между доменами. В результате N-домены димера поворачиваются с образованием компактного закрытого состояния, неспособного более связывать ДНК (Wang et al., Molecular Microbiology 2008, 69(2), p.466).

Таким образом, гомодимерный Rex способен находиться в трех состояниях (Wang et al., Molecular Microbiology. 2008, 69(2), p.466). При низкой концентрации свободных нуклеотидов белок может пребывать в переходном состоянии - часть его молекул находится в свободном состоянии, а часть в слабом комплексе с ДНК. В условиях наличия кислорода, когда индекс НАД+/НАДН имеет высокое значение, Rex образует прочный комплекс с ДНК и молекулой НАД+, выступая в качестве репрессора транскрипции некоторых генов (cydABC, rexhemACD и других). Если НАД+/НАДН соотношение снижается в условиях недостатка кислорода, Rex связывает НАДН, что приводит к конформационным изменениям в структуре белка и последующему освобождению белка из комплекса с ДНК. Это активирует экспрессию генов, продукты которых позволяют клеткам выжить в условиях кислородного голодания.

Известны следующие варианты сенсоров для регистрации НАД+/НАДН на основе Rex белка и cpYFP-флуоресцентного белка, подвергнутого круговой пермутации:

- биосенсор FRex создан на основе белка B-Rex (Zhao et al., Cell Metab. 2011, 14(4):555-566). В состав биосенсора входит подвергнутый круговой пермутации флуоресцентный белок cpYFP, оперативно связанный с N-конца с одной полноразмерной субъединицей белка B-Rex, а с С-конца - с нуклеотид-связывающим доменом второй субъединицы B-Rex. Таким образом, сенсор состоит из трех белковых частей и представлен на фиг.2;

- биосенсор PEREDOX создан на основе белка T-Rex (Hung et al., Cell Metab. 2011, Oct 5; 14(4):545-554). В состав биосенсора входит подвергнутый круговой пермутации флуоресцентный белок cpYFP, оперативно встроенный между двух субъединиц белка T-Rex (фиг.2).

Также предложен вариант химерного белка PEREDOX-mCherry, в котором PEREDOX оперативно слит с красным флуоресцентным белком mCherry, флуоресценция которого служит для нормирования сигнала биосенсора.

Полученные сенсоры позволяют с высокой специфичностью регистрировать изменение соотношения НАД+/НАДН в клетках в режиме реального времени. Однако все указанные биосенсоры реагируют увеличением пика возбуждения флуоресценции на увеличение концентрации в среде восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида. Таким образом, эти биосенсоры оказываются применимы в случаях, когда в ходе биологического процесса происходит увеличение концентрации восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида, однако мало удобны для регистрации соотношения НАД+/НАДН в случаях, когда происходит окисление никотинамидадениндинуклеотида.

Кроме того, эти биосенсоры обладают значительным размером (более 560 аминокислот) и сложной мультидоменной структурой. Это может затруднять создание химерных белков на их основе для направления биосенсоров в определенные компартменты клетки.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка новых биосенсоров для регистрации НАД+/НАДН в клетках в режиме реального времени, особенно обладающих меньшей молекулярной массой и способных реагировать увеличением сигнала при увеличении концентрации окисленной формы никотинамидадениндинуклеотида.

Поставленная задача решается предлагаемыми:

- выделенной нуклеиновой кислотой, кодирующей флуоресцентный биосенсор для измерения изменения соотношения НАД+/НАДН внутри клеток, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO:4, где указанный биосенсор реагирует увеличением сигнала при смещении соотношения НАД+/НАДН в сторону уменьшения концентрации НАДН;

- кассетой экспрессии, которая, будучи интегрированной в геном клетки или при введении в клетку в виде внехромосомного элемента, способна обеспечить экспрессию флуоресцентного биосенсора для измерения изменения соотношения НАД+/НАДН внутри клеток и содержит нуклеиновую кислоту по п.1 под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.

- клеткой, продуцирующей биосенсор, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, содержащей кассету экспрессии по п.2 в виде внехромосомного элемента или элемента, интегрированного в геном этой клетки.

- выделенным флуоресцентным биосенсором для измерения изменения соотношения НАД+/НАДН внутри клеток, кодируемым нуклеиновой кислотой по п.1, где указанный биосенсор реагирует увеличением сигнала при смещении соотношения НАД+/НАДН в строну уменьшения концентрации НАДН.

Предлагаемое изобретение обеспечивает выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих флуоресцентный биосенсор для регистрации изменения соотношения НАД+/НАДН, сигнал которого возрастает при смещении соотношения НАД+/НАДН в сторону увеличения в среде концентрации окисленной формы никотинамидадениндинуклеотида НАД+ и соответственно уменьшается при увеличение в среде концентрации НАДН.

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота предлагаемого изобретения кодирует флуоресцентный биосенсор для регистрации изменения соотношения НАД+/НАДН внутри клеток. В некоторых воплощениях указанный биосенсор реагирует увеличением сигнала при увеличении концентрации окисленной формы никотинамидадениндинуклеотида (НАД+), то есть при сдвиге соотношения НАД+/НАДН в пользу НАД+.

В некоторых воплощениях биосенсор настоящего изобретения состоит из единственной молекулы белка T-Rex (SEQ ID NO:1), в который оперативно встроена молекула белка cpYFP (SEQ ID NO:2). В некоторых воплощениях биосенсор предлагаемого изобретения имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4 (T-Rex-116-117-cpYFP-7). В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота настоящего изобретения имеет нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:12. Молекулы нуклеиновых кислот, которые отличаются от представленных нуклеотидных последовательностей вследствие вырожденности генетического кода, также входят в рамки предлагаемого изобретения.

В других воплощениях также обеспечиваются векторы, включающие нуклеиновую кислоту предлагаемого изобретения.

Кроме того, предлагаемое изобретение обеспечивает кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту предлагаемого изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. А также обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты предлагаемого изобретения. В других воплощениях обеспечиваются функциональные флуоресцентные биосенсоры предлагаемого изобретения, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, указанными выше. Кроме того, обеспечиваются набор, содержащий нуклеиновые кислоты, и/или векторы, и/или экспрессионные кассеты, включающие указанные нуклеиновые кислоты предлагаемого изобретения.

Краткое описание фигур

На фигуре 1 представлена химическая структура восстановленной (НАДН) и окисленной (НАД+) форм никотинамидадениндинуклеотида и их взаимный переход.

На фигуре 2 проиллюстрирована структура известных биосенсоров FRex и PEREDOX и биосенсоров T-Rex-116-117-cpYFP и T-Rex-79-80-cpYFP предлагаемого изобретения.

На фигуре 3 представлена схема сопряженной ферментативной системы.

На фигуре 4 показаны спектры возбуждения и эмиссии T-Rex-79-80-cpYFP-34.

На фигуре 5 показан спектр возбуждения T-Rex-116-117-cpYFP-7.

Фигура 6 иллюстрирует динамику изменения спектра пробы, содержащей T-Rex-116-117-cpYFP-7 на добавление НАДН.

Осуществление изобретения

Для более полного раскрытия вышеперечисленных характеристик предлагаемого изобретения ниже представлено детальное описание изобретения, кратко сформулированного выше, в виде ссылок на воплощения, некоторые из которых проиллюстрированы дополнительными фигурами. При этом следует отметить, что прилагаемые фигуры иллюстрируют лишь типичные воплощения настоящего изобретения и, следовательно, не должны быть восприняты в качестве ограничения объема изобретения, которое может допускать другие в равной степени эффективные воплощения.

Как указано выше, предлагаемое изобретение направлено на молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют биосенсор для регистрации изменения соотношения НАД+/НАДН, сигнал которого возрастает при смещении соотношения НАД+/НАДН в сторону уменьшения концентрации НАДН и увеличения концентрации НАД+.

Нуклеиновые кислоты предлагаемого изобретения получены с помощью рекомбинантных технологий. В предпочтительных воплощениях нуклеиновые кислоты предлагаемого изобретения кодируют белок, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4. Также обеспечиваются векторы и кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту предлагаемого изобретения. Кроме того, обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты предлагаемого изобретения.

Указанные нуклеиновые кислоты применяются во многих различных приложениях и методах, в частности, для мониторинга изменений концентрации окисленной и восстановленной форм никотинамидадениндинуклеотида внутри клеток. Наконец, обеспечиваются наборы для их использования в таких методах и приложениях.

Определения

Различные термины, относящиеся к биологическим молекулам предлагаемого изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения.

Как здесь используется, термин "флуоресцентный белок" означает белок, относящийся к семейству GFP-подобных белков, который обладает способностью к флуоресценции; например он может проявлять низкую, среднюю или интенсивную флуоресценцию при облучении светом с подходящей для возбуждения длиной волны. Флуоресцентное свойство флуоресцентного белка представляет собой такое свойство, которое является результатом работы хромофора, образующегося путем автокаталитической циклизации трех или более аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Как таковые флуоресцентные белки предлагаемого изобретения не включают белки, которые обладают флуоресценцией за счет отдельных флуоресцирующих остатков, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин. Термин «флуоресцентный белок» относится также к флуоресцентным белкам GFP-семейства, подвергнутым круговой пермутации.

Как здесь используется, термин "avGFP" относится к зеленому флуоресцентному белку из медузы Aequorea victoria, включая варианты avGFP, известные из уровня техники, сконструированные для обеспечения большей интенсивности флуоресценции или флуоресценции в других цветовых областях. Последовательность дикого типа avGFP была раскрыта Prasheretal. (Gene. 1992, 111: 229-33).

Как здесь используется, термин "флуоресцентный белок, подвергнутый круговой пермутации", или "кпФБ", относится к белку, полученному из флуоресцентного белка (например из avGFP) с помощью генно-инженерной модификации нуклеиновой кислоты, в результате которой С- и N-концы исходного флуоресцентного белка оказываются оперативно слиты, а новые С- и N-концы формируются вблизи хромофора. Круговая пермутация не влияет на формирование «бочонка» GFP-подобного домена и формирование активного (способного к флуоресценции) хромофора. Круговая пермутация приводит к тому, что кпФБ приобретает способность менять спектральные характеристики при конформационных изменениях белковых доменов или полипептидов, оперативно слитых с его С- и N-концами.

Как здесь используется, термин «cpYFP» относится к кпФБ на основе avGFP, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO:2.

Как здесь используется, термин "выделенный" или «изолированный» означает молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях. Как здесь используется, термин "мутант" или "производное" относятся к белку, раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены, и/или замещены, и/или удалены (делегированы), и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей белков предлагаемого изобретения. Как здесь используется, термин "мутант" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин "мутант" здесь относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.

Как здесь используется, "гомология" - это термин, использующийся для описания взаимосвязи последовательностей нуклеотидов или аминокислот с другими последовательностями нуклеотидов или аминокислот, которая определена степенью идентичности и/или сходства между указанными сравниваемыми последовательностями.

Как здесь используется, аминокислотная или нуклеотидная последовательности "по существу сходны" или "по существу такие же, как референсная последовательность", если аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют по крайней мере 85% идентичности с указанной последовательностью внутри выбранного для сравнения региона. Таким образом, по существу сходные последовательности включают те, которые имеют, например, по крайней мере, 85% идентичности, по крайней мере, 90% идентичности, по крайней мере, 95% идентичности или по крайней мере, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности. Две последовательности, которые идентичны одна другой, также по существу сходны.

Процент идентичности последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как BLAST, описанный Altschul et al., (J. Mol. Biol., 1990, 215, p.403). Для целей настоящего изобретения сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, производимое с помощью пакета программ Blast, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами, может быть использовано для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями.

Как здесь используется, термин "подобные белки" или "по существу сходные белки" относится к белкам, которые имеют аминокислотные последовательности, идентичные по крайней мере на 85%, как правило идентичные на 90% или более, чаще всего идентичные по крайней мере на 95% или более (например на 96% и более, 97% и более, 98% и более, 99% и более, 100%). Длина гомологичных аминокислотных последовательностей у «подобных белков» при этом может составлять, по крайней мере, 100 аминокислотных остатков, чаще, по крайней мере, 200 аминокислотных остатков или 300 аминокислотных остатков.

В некоторых воплощениях термин "подобные белки" или "по существу сходные белки" относится к белкам, которые имеют аминокислотные последовательности целого белка, идентичные по крайней мере на 85%, как правило, идентичные на 90% или более, чаще всего идентичные по крайней мере на 95% или более (например на 96% и более, 97% и более, 98% и более, 99% и более, 100%).

Как здесь используется, термин "функциональный" означает, что нуклеотидная или аминокислотная последовательность может функционировать для указанного испытания или задачи. Термин "функциональный", используемый для описания биосенсора предлагаемого изобретения, означает, что он меняет спектральные характеристики при изменении соотношения НАД+/НАДН в среде.

Как здесь используется, термин «среда» по отношению к биосенсору означает любую среду, в которой этот биосенсор может функционировать. Для выделенного белка это может быть любой буферный раствор, в котором этот сенсор сохраняет функциональность. Для белка, экспрессированного в клетке, это цитоплазма или клеточный компартмент, в котором биосенсор локализован.

Как здесь используется, "биохимические свойства" относятся к белковому фолдингу (сворачиванию) и скорости созревания, скорости восстановления после реакции с тестируемой субстанцией, времени полужизни, способности к агрегации, способности к олигомеризации, рН и температурной стабильности и другим подобным свойствам.

Как здесь используется, "флуоресцентные свойства" или "спектральные свойства" относятся к коэффициенту молярной экстинкции при подходящей длине волны, к квантовому выходу флуоресценции, форме спектра возбуждения флуоресценции или спектра испускания, длине волны, соответствующей максимуму возбуждения флуоресценции, и длине волны, соответствующей максимуму испускания, отношению амплитуды возбуждения флуоресценции при двух разных длинах волн, отношению амплитуды испускания при двух разных длинах волн, времени жизни возбужденного состояния и анизотропии оптических свойств. Измеряемая разница может быть определена как количество любого количественного флуоресцентного свойства, например интенсивность флуоресценции при определенной длине волны, или интегральная флуоресценция на всем спектре испускания.

Как здесь используется, "агрегация" относится к склонности или способности экспрессированного белка формировать нерастворимый осадок (агрегаты). "Агрегация" должна быть отличаема от "олигомеризации". В частности, мутанты с уменьшенной способностью к агрегации, например с увеличенной растворимостью, не обязательно имеют уменьшенную способность к олигомеризации.

Как здесь используется, "олигомеризация" относится к склонности или способности экспрессированного белка формировать комплексы (олигомеры) в результате специфического взаимодействия двух или более полипептидов. Указанное специфическое взаимодействие наблюдается в специальных условиях, например в физиологических условиях, и относительно стабильно в этих условиях. Ссылка на "способность" белков олигомеризоваться означает, что белки могут формировать димеры, триммеры, тетрамеры или подобные комплексы в специальных условиях. Как правило, флуоресцентные белки обладают способностью к олигомеризации в физиологических условиях. Флуоресцентные белки могут также олигомеризоваться при других, например, рН, нежели рН при физиологических условиях. Условия, при которых флуоресцентные белки формируют олигомеры или проявляют склонность к олигомеризации, могут быть определены с помощью хорошо известных методов, таких как гель-фильтрация, или иным способом, известным в данной области.

Ссылка на нуклеотидную последовательность, "кодирующую" полипептид, означает, что с нуклеотидной последовательности в ходе трансляции и транскрипции мРНК продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин также включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие одинаковую аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, включают последовательности, содержащие интроны.

Термин "оперативно связанный", «оперативно встроенный» или ему подобные при описании структуры биосенсора или химерных белков на его основе относится к полипептидным последовательностям, которые находятся в физической и функциональной связи одна с другой. В наиболее предпочтительных воплощениях основные функции полипептидных компонентов химерной молекулы не изменены по сравнению с функциональными свойствами выделенных полипептидных компонентов. Например, белок T-Rex, входящий в состав биосенсора предлагаемого изобретения, сохраняет способность связывать никотинамидадениндинуклеотид, а кпБФ - способность к флуоресценции. В случае когда биосенсор предлагаемого изобретения сшит с представляющим интерес сигналом внутриклеточной локализации, химерный белок сохраняет способность реагировать на изменение соотношения НАД+/НАДН, но локализуется в определенном клеточном компартменте. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, нуклеотидные последовательности, кодирующие химерный белок, включающий "оперативно связанные" компоненты (белки, полипептиды, линкерные последовательности, белковые домены и т.д.), состоят из фрагментов, кодирующих указанные компоненты, где эти фрагменты ковалентно связаны таким образом, что в ходе трансляции и транскрипции нуклеотидной последовательности продуцируется полноразмерный химерный белок. Иными словами, фрагменты соединены таким образом, что в местах их соединения отсутствуют "сбойки" рамки считывания и стоп-кодоны.

Как здесь используется, термин «НАД+/НАДН» означает соотношение концентраций окисленной (НАД+) и восстановленной (НАДН) форм никотинамидадениндинуклеотида в среде. Формула никотинамидадениндинуклеотида представлена на фиг.1. Как здесь используется, термин «сигнал биосенсора» означает детектируемое изменение спектральной характеристики биосенсора в ответ на изменение соотношения НАД+/НАДН.

Молекулы нуклеиновых кислот

Предлагаемое изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие флуоресцентный биосенсор для регистрации изменения соотношения НАД+/НАДН, сигнал которого возрастает при увеличении в среде концентрации окисленной формы никотинамидадениндинуклеотида. Как здесь используется, молекула нуклеиновой кислоты - это молекула ДНК, такая как геномная ДНК или кДНК молекула, или молекула РНК, такая как молекула мРНК.

Как здесь используется, термин "кДНК" относится к нуклеиновым кислотам, которые обладают размещением элементов последовательности, найденным в нативных зрелых видах мРНК, где элементы последовательности - это экзоны и 5' и 3' некодирующие области.

Структура биосенсора схематически изображена на фиг.2. Биосенсор представляет собой химерный белок, состоящий из единственной двухдоменной субъединицы белка T-Rex из Thermus aquaticus (SEQ ID NO:1), в которую оперативно встроен подвергнутый круговой пермутации белок cpYFP (SEQ ID NO:2). В предпочтительных воплощениях cpYFP оперативно встроен между 70 и 120 аминокислотами белка T-Rex, например между 79 и 80 аминокислотами или между 116 и 117 аминокислотами. В предпочтительных воплощениях последовательность cpYFP оперативно соединена с последовательностями фрагментов T-Rex с помощью аминокислотных линкерных последовательностей 1 и 2, как показано на фиг.2. В предпочтительных воплощениях линкерная последовательность 1 состоит из трех аминокислот (например, оперативно связанных аминокислот S, А и G), а линкерная последовательность 2 состоит из двух аминокислот (например, оперативно связанных аминокислот G и Т).

Методы получения таких химерных белков хорошо известны профессионалам в данной области. Например, части нуклеиновой кислоты, кодирующие различные элементы (например, фрагменты аминокислотной последовательности T-Rex с 1 по 116 аминокислоты и с 117 по 211 аминокислоты, линкерные последовательности, белок cpYFP), могут быть встроены в определенном порядке в полилинкер вектора таким образом, что между различными частями не будет стоп-кодонов в рамке считывания и не будет сбоек рамки считывания. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть собрана из фрагментов с помощью ДНК-лигазы или ПЦР с праймерами, содержащими части, комплементарные концевым последовательностям соединяемых фрагментов.

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая флуоресцентный биосенсор, может быть синтезирована из подходящих нуклеозидтрифосфатов. Этот метод основан на хорошо известных в данной области протоколах. Например, доступность информации о последовательности аминокислот или информации о нуклеотидной последовательности дает возможность изготовить выделенные молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретении с помощью олигонуклеотидного синтеза. В случае информации о последовательности аминокислот может быть синтезировано несколько нуклеиновых кислот, отличающихся друг от друга вследствие вырожденности генетического кода. Методы выбора вариантов кодонов для требуемого хозяина хорошо известны в данной области. Синтетические олигонуклеотиды могут быть приготовлены с помощью фосфорамидитного метода, и полученные конструкты могут быть очищены с помощью методов, хорошо известных в данной области, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), или других методов, как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ^nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и по инструкции, описанной в, например, United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research. Длинные двухцепочечные молекулы ДНК предлагаемого изобретения могут быть синтезированы за следующие стадии: несколько меньших фрагментов с необходимой комплементарностью, которые содержат подходящие концы, способные к когезии с соседним фрагментом. Соседние фрагменты могут быть сшиты с помощью ДНК-лигазы или метода, основанного на ПЦР. Нуклеиновая кислота, кодирующая биосенсор, может быть выделена любым из многих известных методов.

Кроме того, также обеспечиваются вырожденные варианты нуклеиновых кислот, которые кодируют биосенсор предлагаемого изобретения. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот включают замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие кодоны, кодирующие те же самые аминокислоты. В частности, вырожденные варианты нуклеиновых кислот создаются, чтобы увеличить экспрессию в клетке-хозяине. В этом воплощении кодоны нуклеиновой кислоты, которые не являются предпочтительными или являются менее предпочтительными в генах клетки-хозяина, заменены кодонами, которые обильно представлены в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, где указанные замененные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту.

Особенный интерес представляют гуманизированные версии нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Как здесь используется, термин "гуманизированный" относится к заменам, сделанным в последовательности нуклеиновой кислоты для оптимизации кодонов для экспрессии белка в клетках млекопитающих (человека) (Yang et al., Nucleic Acids Research. 1996, 24: 4592-4593). См. также патент США № 5795737, который описывает гуманизацию белков, раскрытие которого здесь включено ссылкой.

В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения - это ДНК (или кДНК) молекула, содержащая открытую рамку считывания, которая кодирует биосенсор настоящего изобретения и способна в подходящих условиях (например, физиологические внутриклеточные условия) быть использована для экспрессии белка в клетке-хозяине. Настоящее изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты, которые гомологичны, по существу сходны, идентичны или получены из нуклеиновых кислот, кодирующих белки настоящего изобретения. Указанные нуклеиновые кислоты находятся в среде, отличной от среды, в которой они находятся в естественных условиях, например они выделены, представлены в увеличенном количестве, находятся или экспрессированы в системах in vitro или в клетках или организмах, отличных от тех, в которых они находятся в естественных условиях.

Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть выделены и получены по существу в очищенной форме. По существу очищенная форма означает, что нуклеиновые кислоты являются по меньшей мере приблизительно на 50% чистыми, обычно по меньшей мере приблизительно на 90% чистыми и обычно являются "рекомбинантными", то есть фланкированы одним или более нуклеотидов, с которыми она обычно не связана в хромосоме, встречающейся в природе в ее естественном организме-хозяине.

Изменения или различия в нуклеотидной последовательности между высокосходными нуклеотидными последовательностями могут представлять нуклеотидные замены в последовательности, которые возникают в процессе нормальной репликации или дупликации. Другие замены могут быть специально рассчитаны и вставлены в последовательность для определенных целей, таких как изменение кодонов определенных аминокислот или нуклеотидной последовательности регуляторного региона. Такие специальные замены могут быть произведены in vitro с помощью различных технологий мутагенеза или получены в организмах-хозяевах, находящихся в специфических селекционных условиях, которые индуцируют или отбирают эти изменения. Такие специально полученные варианты последовательности могут быть названы "мутантами" или "производными" исходной последовательности.

Мутантные или производные нуклеиновые кислоты могут быть получены на матричной нуклеиновой кислоте, выбранной из вышеописанных нуклеиновых кислот, путем модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов в матричной последовательности или их комбинации для получения варианта матричной нуклеиновой кислоты. Модификации, добавления или делеции могут быть выполнены любым способом, известным в данной области (см. например Gustin et al., Biotechniques. 1993, 14: 22; Barany, Gene. 1985, 37: 111-123; Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. 1985, 199:537-539; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1989, CSH Press, pp.15.3-15.108), включая подверженный ошибкам ПЦР (error-prone PCR), shuffling, олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР со сборкой, парный ПЦР мутагенез, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный множественный мутагенез, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, случайный мутагенез, генная реассемблирование (gene reassembly), генный сайт-насыщающий мутагенез (GSSM), искусственную перестройку с лигированием (SLR) или их комбинации. Модификации, добавления или делеции могут быть также выполнены методом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, фосфотиоат-модифицированный мутагенез ДНК, мутагенез на урацилсодержащей матрице, мутагенез с двойным пропуском, точечный восстановительный по рассогласованию мутагенез, мутагенез штамма, дефицитного по восстановлениям, химический мутагенез, радиоактивный мутагенез, делетационный мутагенез, рестрикционно-избирательный мутагенез, рестрикционный мутагенез с очисткой, синтез искусственных генов, множественный мутагенез, создание химерных множественных нуклеиновых кислот и их комбинации.

Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, кодирующие химерные белки, состоящие из биосенсора настоящего изобретения и сигнала определенной внутриклеточной локализации. Такие химерные белки могут быть получены путем оперативного соединения нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, кодирующей биосенсор, и нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнал внутриклеточной локализации. Методы получения таких нуклеиновых кислот хорошо известны специалистам в данной области.

Также обеспечиваются вектор и другие конструкции нуклеиновой кислоты, содержащие заявленные нуклеиновые кислоты. Подходящие векторы включают вирусные и невирусные векторы, плазмиды, космиды, фаги и т.д., предпочтительно плазмиды, и используются для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.д., последовательности нуклеиновой кислоты предлагаемого изобретения в подходящего хозяина. Выбор подходящего вектора является понятным для квалифицированного специалиста в данной области, и известно много таких доступны коммерчески векторов. Для приготовления конструкции полноразмерная нуклеиновая кислота или ее часть обычно встраивается в вектор посредством прикрепления ДНК-лигазой к расщепленному ферментами рестрикции сайту в векторе. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть вставлена гомологичной рекомбинацией in vivo, обычно присоединением гомологичных участков к вектору на флангах желательной нуклеотидной последовательности. Гомологичные участки добавляют лигированием олигонуклеотидов или полимеразной цепной реакцией с использованием праймеров, включающих, например, как гомологичные участки, так и часть желательной нуклеотидной последовательности.

Также обеспечиваются кассеты экспрессии или системы, использованные inter alia для получения заявленных биосенсоров или химерных белков на их основе или для репликации заявленных молекул нуклеиновой кислоты. Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку.

В кассете экспрессии указанная нуклеиновая кислота является функционально связанной с регуляторной последовательностью, которая может включать промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы и обеспечивает инициацию считывания РНК (транскрипции) в клетке-хозяине. В кассете экспрессии нуклеиновая кислота предлагаемого изобретения может быть также связана с сигналами терминации транскрипции, функциональным в клетке-хозяине. Методы изготовления кассет экспрессии или систем для экспрессии желаемого продукта известны специалистом, квалифицированным в данной области. Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют белки предлагаемого изобретения, могут быть выбраны способами, известными в данной области (например ко-трансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным выявление и выделение транфецированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном).

Белковый продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой изобретения, может быть получен путем экспрессии в любой удобной системе экспрессии, включая, например, бактериальные системы, дрожжевые системы, клетки насекомых, земноводных или клетки млекопитающих. Например, для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как Е. coli, В. subtilis, S. cerevisiae, клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами или клетки высшего организма, такого как позвоночные, например COS 7 клетки, НЕК 293, СНО, ооциты Xenopus и т.д.

Если используется любая вышеупомянутая клетка-хозяин или другие подходящие клетки-хозяева или организмы для репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот изобретения, то полученная реплицированная нуклеиновая кислота, экспрессированный белок или полипептид находятся в рамках притязания изобретения как продукт клетки-хозяина или организма. Продукт может быть выделен подходящим способом, известным в данной области.

Белки

Нуклеиновая кислота по предлагаемому изобретению кодирует флуоресцентный биосенсор для регистрации изменения соотношения НАД+/НАДН, сигнал которого возрастает при увеличении в среде концентрации окисленной формы никотинамидадениндинуклеотида. Специфические биосенсоры, представляющие интерес, включают биосенсоры, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID No:4, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 8 и SEQ ID NO:10, свойства которых подробно описаны в экспериментальной части, infra.

Заявленный биосенсор обладает способностью к детектируемой флуоресценции, которая может быть зарегистрирована с помощью визуального скрининга, спектрофотометрии, спектрофлуориметрии, флуоресцентной микроскопии, с помощью FACS или другим общепринятым способом для регистрации флуоресценции. Заявленный биосенсор имеет максимум (пик) эмиссии флуоресценции в диапазоне от 500 нм до 550 нм, например 520 нм, и два пика возбуждения флуоресценции; первый в диапазоне 400-450 нм (например, 420 нм) и второй в диапазоне 470-510 нм (например, 490 нм). В преимущественных воплощениях первый пик возбуждения выражен слабее, чем второй. В преимущественных воплощениях первый пик возбуждения может быть измерен с помощью спектрофотометрии, спектрофлуориметрии, флуоресцентной микроскопии, с помощью FACS или другим общепринятым способом для регистрации флуоресценции.

Заявленный биосенсор меняет интенсивность флуоресценции при возбуждении светом с длиной волны 490 нм, при этом интенсивность флуоресценции при возбуждении светом с длиной волны 420 нм остается неизменной. Для нужд настоящего изобретения сигналом биосенсора является отношение интенсивности флуоресценции при возбуждении светом с длиной волны 490 нм к интенсивности флуоресценции при возбуждении светом с длиной волны 420 нм. Этот параметр не зависит от концентрации биосенсора в среде.

В преимущественных воплощениях интенсивность флуоресценции заявленного биосенсора при возбуждении светом с длиной волны 490 нм падает при увеличении концентрации НАДН в среде, которое сопровождается эквимолекулярным увеличением концентрации в среде НАД+. Таким образом, при увеличении концентрации НАД+ в среде происходит увеличение сигнала биосенсора.

Регистрация сигнала биосенсора может быть осуществлена с помощью спектрофотометрии, спектрофлуориметрии, флуоресцентной микроскопии, с помощью FACS или другим общепринятым способом для регистрации флуоресценции.

Заявленный биосенсор обладает высокой чувствительностью и способен регистрировать изменение соотношения НАД+/НАДН в диапазоне от 0,1 до 700, обычно в диапазоне от 400 до 0,1.

Чувствительность биосенсора может быть измерена в клеточном лизате, содержащем биосенсор, в сопряженной ферментативной системе, схематически изображенной на фиг.3. В данной системе в ходе ферментативной реакции глюкоза под действием гексокиназы превращается в глюкозо-6-фосфат, который является субстратом для дегидрогеназы, использующей в качестве кофактора НАД+. Таким образом, возможна одновременная регистрация динамики изменения соотношения НАД+/НАДН с помощью ферментативной системы и изменения сигнала самого биосенсора, присутствующего в среде.

Заявленный биосенсор обладает относительно небольшими размерами и состоит из 400-500 аминокислот, обычно длина биосенсора 450-470 аминокислот, например 462 аминокислоты (включая первый метионин).

Также обеспечиваются функциональные биосенсоры, которые по существу сходны с указанными выше биосенсорами, где по существу сходны означает, что эти белки имеют аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID Nos:4, 6, 8 или 10, по крайней мере, на 85% идентичности, обычно, по крайней мере, 90% и чаще, по крайней мере, 95% (например, 95% и выше; 96% и выше, 97% и выше; 98% и выше: 99% и выше или 100% идентичности последовательности).

Мутанты могут быть получены с использованием стандартных методов молекулярной биологии, как подробно описано в разделе "молекулы нуклеиновых кислот" выше. Примеры обеспечивают общие приемы и использование стандартных способов, так что специалисты, квалифицированные в данной области, могут легко получить большой ряд дополнительных мутантов и проверить, было ли изменено биологическое (например, биохимическое, спектральное, и т.д.) свойство. Например, интенсивность флуоресценции может быть измерена с использованием спектрофлуориметра при различных длинах волн возбуждения.

Биосенсоры предлагаемого изобретения присутствуют в среде, отличной от их естественной среды; например они рекомбинантны. Белки предлагаемого изобретения могут находиться в выделенном состоянии, что означает, что белки по существу свободны от других белков и других биологических молекул, присутствующих в естественной среде, таких как олигосахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагменты и т.п., где термин "по существу свободны" в этом случае означает, что меньше чем 70%, обычно меньше чем 60% и чаще меньше чем 50% композиции, содержащей выделенный белок, представляет собой некоторые другие биологические молекулы, чем встречающиеся в природе. В некоторых воплощениях белки присутствуют в по существу очищенной форме, где "по существу очищенная форма" означает очищенная по меньшей мере на 95%, обычно по меньшей мере на 97% и чаще по меньшей мере на 99%.

Заявленные биосенсоры могут быть получены искусственным путем, например экспрессией рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, белка, представляющего интерес, в соответствующем хозяине, как описано выше. Для очистки белка могут применяться любые обычные методики, где подходящие методы очистки белка описаны в Guide to Protein Purification, (Deuthser ed., Academic Press. 1990). Например, лизат может быть приготовлен из исходного источника и очищен с использованием ВЭЖХ, вытеснительной хроматографии, гель-электрофореза, аффинной хроматографии и т.п.

Также обеспечиваются белки слияния, включающие биосенсор настоящего изобретения, слитые с последовательностью внутриклеточной локализации (например, с сигналом локализации в ядре, в пероксисомах, аппарате Гольджи, митохондрии и т.д.). Полипептид, обеспечивающий определенную внутриклеточную локализацию, может быть оперативно присоединен к N-концу и/или С-концу биосенсора. Сигналы внутриклеточной локализации хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например Nakai К. (Advances in Protein Chemistry. 2000, Vol.54, p.277).

Трансформанты Нуклеиновые кислоты предлагаемого изобретения используют для получения трансформантов, включая трансгенных организмов или сайт-специфичных генных изменений в клеточных линиях. Трансгенные клетки, заявленные в изобретении, содержат одну или более нуклеиновых кислот, заявленных по предлагаемому изобретению, в качестве трансгена. Для целей изобретения любая приемлемая клетка-хозяин может быть использована, включая прокариотические (например, Escherichia coli, Streptomyces sp., Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, и т.д.) или эукариотические клетки-хозяева. Трансгенный организм, заявленный по изобретению, может быть прокариотическим или эукариотическим организмом, включая бактерии, цианобактерии, грибы, растения и животные, в которых одна или больше клеток организма содержат гетерогенную нуклеиновую кислоту, заявленную по изобретению, введенную посредством вмешательства человека такими способами как технологии трансгеноза, которые известны в данной области.

Выделенная нуклеиновая кислота предлагаемого изобретения может быть введена в хозяина способами, известными в данной области, например инфицированием, трансфекцией, трансформацией или трансконъюгацией. Способы переноса молекулы нуклеиновой кислоты (то есть ДНК) в такие организмы широко известны и обеспечивается в ссылках, таких как Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2001, 3nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).

В одном воплощении трансгенный организм может быть прокариотическим организмом. Способы трансформации прокариотических хозяев хорошо описаны в данной области (например, см. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, 2nd edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. 1995, John Wiley & Sons, Inc).

В другом воплощении трансгенными организмами могут быть грибы, например дрожжи. Дрожжи широко используются как носители для экспрессии гетерогенного гена (например см. Goodey et al. Yeast biotechnology, D R Berry et al., eds, 1987, Alien and Unwin, London, p.401 и King et al Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G Т Yarronton, eds, Blackie, Glasgow. 1989, p.107). Несколько типов дрожжевых векторов доступны, включая интегративные векторы, которые требуют рекомбинации с геномом хозяина для их поддержки, и автономно реплицирующиеся плазмидные векторы. В другом воплощении трансгенными организмами могут быть животные.

Трансгенные животные могут быть получены трансгенными способами, известными в данной области, и обеспечиваются в ссылках, таких как Pinkert, Transgenic Animal Technology: a Laboratory Handbook. (2003), 2nd edition San Diego: Academic Press; Gersenstein and Vintersten, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd ed, (2002), Nagy A. (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory; Blau et al.. Laboratory Animal Medicine, 2nd Ed., (2002) Fox J.G., Anderson L.C., Loew P.M., Quimby F.W. (Eds), American Medical Association, American Psychological Association; Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Ed.) Oxford University Press; 2nd edition, (2000). Например, трансгенные животные могут быть получены гомологичной рекомбинацией, где изменяется эндогенный локус. Альтернативно, конструкция нуклеиновой кислоты включается случайным образом в геном. Векторы для устойчивого включения включают плазмиды, ретровирусы и другие животные вирусы, YAC, и т.п. Нуклеиновые кислоты могут быть введены в клетку непосредственно или опосредованно, введением в прекурсор клетки, путем намеренной генетической манипуляции, такой как микроинъекция или инфицирование рекомбинантным вирусом или рекомбинантным вирусным вектором и т.п. Термин «генетическая манипуляция» не включает классическое скрещивание или оплодотворение in vitro, а предпочтительно является направленным на введение рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот. Эти молекулы нуклеиновой кислоты могут быть включены в хромосому, или они являться внехромосомными реплицирующими ДНК. Конструкции ДНК для гомологичной рекомбинации будут содержать, по меньшей мере, часть нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, где ген имеет желательную генетическую модификацию(ции) и включает области гомологии с целевым локусом. Конструкциям ДНК для произвольного включения не обязательно содержать область гомологии с медиатором рекомбинации. Легко могут быть включены маркеры для положительной и отрицательной селекций. Способы получения клеток, имеющих целевые генные модификации, через гомологическую комбинацию известны в данной области. Для различных способов трансфекции клеток млекопитающих (Keown et al., Meth. Enzymol. 1990, 185:527-537).

Трансгенные животные могут быть любыми животными, не относящимися к человеку, включая млекопитающее, не относящееся к человеку (например мышь, крыса), птица или амфибия и т.д., и использованы в функциональном исследовании, скрининге лекарственного средства и т.п. Также могут быть получены трансгенные растения. Способы получения трансгенных растительных клеток и растений описаны в патентах США № № 5767367; 5750870; 5739409; 5689049; 5689045; 5674731; 5656466; 5633155; 5629470; 5595896; 5576198; 5538879; 5484956; раскрытия которых включены сюда ссылкой. Способы получения трансгенных растений также рассмотрены в Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea and Leegood, John Wiley & Sons) 1993, p.275 и в Plant Biotechnology and Transgenic Plants (eds. Oksman-Caldentey and Barz), (2002) p.719) Например, эмбриогенные эксплантаты, содержащие соматические клетки, могут использоваться для получения трансгенного хозяина. После сбора клеток или тканей экзогенная ДНК, представляющая интерес, вводится в растительные клетки, при этом известен для такого введения ряд различных способов. При наличии выделенных протопластов возникает возможность для введения через ДНК-опосредованные протоколы передачи гена, включая инкубацию протопластов с очищенной ДНК, такой как плазмида, содержащая целевую экзогенную последовательность, представляющую интерес, в присутствии поливалентных катионов (например, PEG или PLO); или электропорацию протопластов в присутствии выделенной ДНК, включающей целевую экзогенную последовательность. Протопласты, которые успешно включили экзогенную ДНК, затем отбираются, выращиваются в каллус и в конечном счете в трансгенное растение при контакте с подходящими количествами и отношениями стимулирующих факторов, таких как ауксины и цитокины. Могут использоваться другие подходящие способы получения растения, которые доступны для квалифицированных специалистов в данной области, таки, как применение "генной пушки", или Agrobacterium-опосредованная трансформация.

Способы применения

Биосенсоры предлагаемого изобретения являются генетически кодируемыми флуоресцентными белками, меняющими спектральные свойства в присутствии перекиси водорода. Они могут быть использованы для регистрации изменения соотношения НАД+/НАДН внутри клеток, особенно в ходе процессов, при которых происходит падение концентрации НАДН и соответственно увеличение концентрации НАД+.

Для осуществления применения должна быть получена нуклеиновая кислота, кодирующая биосенсор. Получение таких конструкций очевидно для любого специалиста в данной области. Полученная конструкция должна быть встроена в кассету экспрессии (или вектор), обеспечивающую временную или постоянную экспрессию этой нуклеиновой кислоты в клетках-хозяевах. Вектор или кассета экспрессии может содержать элементы, обеспечивающие адресную доставку конструкции в интересующие клетки, или находится в составе частиц, обеспечивающих адресную доставку. После трансфекции клеток вектором и по истечении времени, необходимого для наработки в клетках продукта экспрессии, может быть осуществлена регистрация изменения соотношения НАД+/НАДН внутри клеток.

Биосенсоры настоящего изобретения могут быть сшиты с сигналами различной внутриклеточной локализации для направления биосенсоров в определенные клеточные компартменты и регистрации колебаний НАД+/НАДН в этих клеточных компартментах.

Наборы

Также обеспечиваются в соответствии с настоящим изобретением наборы для использования при осуществлении вышеописанных применений. В предпочтительных воплощениях наборы обычно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую биосенсор, предпочтительно с элементами для экспрессии биосенсора в клетке-хозяине. Например, наборы могут включать вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую заявленный биосенсор. Компоненты наборов обычно присутствуют в соответствующей среде для хранения, такой как водный или буферный раствор, обычно в соответствующей емкости. В отдельных воплощениях набор включает множество различных векторов, каждый их которых кодирует заявленный белок, где векторы предназначены для экспрессии в различных средах и/или при различных условиях, например, для конститутивной экспрессии, где вектор включает сильный промотор для экспрессии в клетках млекопитающих или вектор с ослабленным промотором с множественными клонированными сайтами для выборочной вставки промотора и нестандартной экспрессии, и т.д.

В дополнение к описанным выше компонентам заявленные наборы будут дополнительно включать инструкции для осуществления заявленных способов. Эти инструкции могут присутствовать в заявленных наборах в различных формах (например, в печатном варианте или на электроном носителе в виде текстового и/или графического файла) в количестве одна или более.

Следующие примеры предлагается в качестве иллюстративных, но не ограничивающих.

Примеры конкретного исполнения предлагаемого изобретения

Пример 1

Получение вариантов биосенсора

Нуклеиновую кислоту, кодирующую белок T-Rex из Thermus aquaticus, получали путем ПЦР из геномной ДНК Thermus thermophilus с помощью ген-специфических праймеров и клонировали в pQE-30 (Qiagen) no стандартной технологии.

Нуклеиновую кислоту, кодирующую cpYFP, синтезировали из подходящих нуклеозидтрифосфатов и использовали для встраивания в последовательность нуклеиновой кислоты T-Rex в рамку считывания перед триплетами, кодирующими следующие аминокислотные остатки: 78, 79, 99, 100, 116, 117, 126, 130, 133, 136, 140. Для этого соответствующие фрагменты ДНК T-Rex и cpYFP амплифицировали с ген-специфических праймеров, очищали при помощи электрофореза в 1% агарозном геле и объединяли в целую конструкцию методом "overlap extention" ПЦР как описано Wurch et al. (Methods in Molecular Biology. 2004, 12 (9), p.653). Амплификацию проводили на приборе РТС-100 Thermal Cycler (MJ Reserch). Каждая реакционная проба также содержала праймеры (0,5 мкМ), эквимолярную смесь dNTP (0,5 мкМ), матричную ДНК (10-100 нг), Tersus полимеразу (Евроген). Для доведения смеси до нужного объема использовали воду степени очистки milliQ. Использовали следующий режим амплификации: денатурация 95°С - 12 сек; отжиг 65°С - 4 мин; элонгация 72°С - 1 мин, 10 циклов ПНР. Амплификацию полной конструкции осуществляли в 15 циклах ПЦР с концевых праймеров. Использовали следующий режим амплификации: денатурация 95°С - 15 сек; отжиг 60°С - 20 сек; элонгация 72°С - 1 мин. Конструкцию клонировали в pQE-30 (Qiagen) по стандартной технологии и использовали для трансфекции клеток Е. coli. На первом этапе отбора оценивали наличие флуоресценции и яркость колоний Е. coli, которые были трансформированы каждым из полученных генетических конструктов. Кроме того, оценивали время появления флуоресценции у данных колоний, что давало информацию о скорости созревания различных версий сенсора в бактериальных клетках.

Отбор оптимальных клонов, экспрессирующих белок-сенсор, осуществляли с помощью флуоресцентного бинокулярного микроскопа Olympus US SZX12. Визуально оценивали наличие флуоресценции и яркость отдельных колоний Е. coli при возбуждении в синей и фиолетовой областях спектра. Учитывали скорость появления флуоресценции отдельных колоний. Отобранные клоны переносили на новую чашку и подращивали при 37°С в течение 10-12 часов.

Для большинства клонов, содержащих разные версии химерных белков, интенсивность флуоресценции была слабой. При интегрировании cpYFP между позициями 117-118, 126-127, 130-131 белка T-Rex флуоресценции в клонах, экспрессирующих такие версии химерных белков, не наблюдалось. Более интенсивной флуоресценцией по сравнению с прочими обладали клоны, которые экспрессировали белковые конструкты, где cpYFP был интегрирован между позициями 79-80, 99-100 и 116-117. Эти версии использовали в дальнейшем тестировании.

На следующем этапе оценивали чувствительность отобранных вариантов биосенсора к изменению соотношения НАД+/НАДН. Для этого рекомбинантные белки очищали из клеток с помощью металл аффинной хроматографии со смолой TALON (Клонтех, США) и оценивали величину изменений спектра флуоресценции в зависимости от наличия в среде НАДН и НАД+. Измерение спектральных характеристик проводили на флуоресцентном спектрофотометре Varian Cary Eclipse. Для этого клетки, являющиеся потомками одного отобранного на первом этапе клона, в небольшом количестве отбирали и суспендировали в 1 мл буфера PBS в кювете для флуориметра. Далее в кювету вносили избыток НАД+ (на 250 нМ белка 100 мкМ НАД+), после изменения сигнала сенсора в этой же пробе постепенно увеличивали концентрацию НАДН до 25, 50, 100, 250 и 500 нМ. Сравнивали ответы различных версий сенсора на появление незначительного количества НАДН в системе на фоне имеющегося избытка НАД+. Таким образом, отбирали версии сенсора, наиболее чувствительные к НАДН.

Для определения концентрации белка проводили денатурацию исследуемого образца с помощью добавления NaOH до конечной концентрации 1М. После с данного образца снимали спектр поглощения в диапазоне от 350 до 500 нм на спектрофотометре Varian Сагу 100 Bio. В этих условиях хромофор биосенсора поглощает при 450 нм (молярный коэффициент экстинкции = 40,000 M^-1cM^-1). Зная величину оптической плотности и молярный коэффициент экстинкции для хромофора, определяли концентрацию белка по формуле как произведение молярного коэффициента экстинкции и оптической плотности.

Спектры возбуждения флуоресценции всех протестированных белков были представлены хорошо выраженной депротонированной формой хромофора (максимум возбуждения - 490-500 нм), в то время как протонированная форма (максимум возбуждения - 420 нм) была выражена слабее.

Биосенсоры T-Rex-79-SO-cpYFP (SEQ ID NO:7, 8) и T-Rex-116-117-cpYFP (SEQ ID NO:9, 10) реагировали даже на малые изменения концентрации НАДН в системе. Например, при концентрации 250 нМ в пробе T-Rex-79-80-cpYFP интенсивность флуоресценции при возбуждении светом с длиной волны при 500 нм составляла 520 оптических ед., при концентрации в той же пробе 25 нМ НАДН интенсивность падала до 400 о. ед. и продолжала снижаться при дальнейшем увеличении концентрации НАДН. Интенсивность в области 420 нм оставалась неизменной.

Спектр возбуждения T-Rex-99-100-cpYFP изменялся крайне незначительно даже при избыточном количестве НАДН в пробе. Поэтому T-Rex-99-100-cpYFP был исключен из дальнейшего тестирования.

Пример 2

Случайный мутагенез T-Rex-79-SO-cpYFP и T-Rex-116-117-cpYFP

Главным недостатком полученных версий биосенсоров была низкая скорость созревания белков. Флуоресценция бактериальных клонов, которые были трансформированы плазмидами соответствующих версий, наблюдалась лишь на вторые сутки.

Для увеличения скорости созревания биосенсоров нуклеиновые кислоты T-Rex-79-SO-cpYFP и T-Rex-116-117-cpYFP, полученные, как описано в примере 1, подвергли случайному мутагенезу с помощью набора для случайного мутагенеза (Клонтех) с использованием методики, прилагаемой фирмой-производителем. В дальнейшем отбирали клоны по наличию яркой флуоресценции и времени появления флуоресценции.

Было отобрано 65 клонов белка T-Rex-79-80-cpYFP, являющихся его мутантными формами. Белки выделяли и тестировали на чувствительность спектра флуоресценции к НАД+ и НАДН. Из всех отобранных мутантных версий лишь одна (T-Rex-79-80-cpYFP-34) сохранила свою чувствительность к НАД+ и НАДН, идентичную исходной версии T-Rex-79-80-cpYFP. По сравнению с исходным белком эта версия содержала замены L169P, Y175N и D313G. Все три мутации располагаются в последовательности cpYFP, в то время как структура T-Rex не была изменена. На фиг.4 показаны спектры возбуждения и эмиссии T-Rex-79-80-cpYFP-34. Последовательности нуклеотидов и аминокислот этого белка показаны в SEQ ID No:5 и 6 соответственно.

Было отобрано 40 клонов белка T-Rex-116-117-cpYFP, являющихся его мутантными формами. Белки выделяли и тестировали на чувствительность спектра флуоресценции к НАД+ и НАДН. На основании тестирования была отобрана версия T-Rex-116-117-cpYFP-7, обладающая наивысшей чувствительностью к НАД+ и НАДН. По сравнению с исходным белком эта версия содержала замену D350G. На фиг.5 показаны спектры возбуждения и эмиссии T-Rex-116-117-cpYFP-7. Последовательности нуклеотидов и аминокислот этого белка показаны в SEQ ID No:3 и 4 соответственно. Белок T-Rex-116-117-cpYFP-7 отличается от T-Rex-79-80-cpYFP-34 по спектру возбуждения и имеет более выраженную протонированную форму хромофора (максимум возбуждения светом длиной волны 420 нм). Характерная динамика изменения спектра пробы, содержащей T-Rex-116-117-cpYFP-7, на добавление НАДН показана на фиг.6.

Пример 3

Изменение спектральных характеристик T-Rex-116-117-cpYFP-7 и Т-Rex-79-80-cpYFP-34 в сопряженной ферментативной системе.

Биосенсоры T-Rex-116-117-cpYFP-7 и T-Rex-79-80-cpYFP-34, нуклеиновые кислоты которых были получены, как описано в примере 2, были выделены из бактерий, как описано в примере 1, и использованы для тестирования их чувствительности к изменению соотношения НАД+/НАДН в сопряженной ферментативной системе, показанной на фиг.3.

Для этого в спектрофотометрическую кювету внесли следующие компоненты реакционной среды: 30 мМ Трис-HCl буфер, 10 мМ глюкозу, 15 мМ MgCl₂, 2,5 мМ АТФ (AppliChem), 1 мМ НАД+ (Sigma). Количество белка в различных пробах отличалось, поскольку сигнал сенсора не должен зависеть от его концентрации. Далее в систему вносили глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу, инкубировали 3-5 минут, после чего начинали реакцию добавлением гексокиназы. Прирост НАДН в системе регистрировали по флуоресценции при 340 нм. Таким образом определяли зависимость сигнала сенсора (соотношение интенсивностей 420/490 на спектре возбуждения) от НАД+/НАДН соотношения в системе в данный момент времени (спектры снимали каждые 30 секунд). Для обоих вариантов увеличение интенсивности на 340 нм, что соответствует увеличению доли НАДН в системе и уменьшению доли НАД+, сопровождалось снижением интенсивности на 500 нм, что соответствует депротонированной форме хромофора сенсора. В области 420 нм изменений практически не было. Оба варианта демонстрировали высокую чувствительность к изменению соотношения НАД+/НАДН в среде.

Пример 4

Экспрессия в клетках млекопитающих.

Векторы на основе pQE-30, содержащие нуклеиновые кислоты для T-Rex-116-117-cpYFP-7 и T-Rex-79-80-cpYFP-34, были получены как описано в примерах 1 и 2. Для осуществления переклонирования полученных конструктов из вектора pQE30 в вектор pCleGFP (Клонтех, США) фрагменты нуклеиновых кислот, содержащие кодирующую область биосенсора, амплифицировали с использованием концевых ген-специфических праймеров, содержащих сайты рестрикции для переклонирования и полимеразу Tersus (Евроген). Полученные фрагменты очищали с помощью фенольно-хлороформной экстракции и лигировали в pCleGFP, предварительно, подвергнутый рестрикции по аналогичным сайтам, на место EGFP.

Клетки HeLa Kyoto рассаживали в слайды (µ-Slide VI, Ibidi) в среде DMEM, содержащей 10% инактивированной эмбриональной сыворотки (РАА Laboratories) из расчета 5-7 тыс. клеток на одну дорожку, трансфецировали соответствующим вектором и культивировали по стандартному протоколу.

Перед микроскопией среду во всех слайдах заменяли раствором Хэнкса без бикарбоната натрия. Для визуализации флуоресценции трансфецированных клеток использовали флуоресцентный микроскоп Leica DMI 6000 В. Микроскопию клеток проводили при температуре 37°С, детекцию флуоресценции проводили в двух каналах, соответствующих двум пикам возбуждения хромофора cpYFP (420 нм и 490-500 нм), эмиссия 510 нм. Для канала, соответствующего протонированной форме хромофора cpYFP (420 нм), использовали фильтры EFW Excitation: 427/10 (CFP), Emission: BP 542/27 (YFP). Для депротонированной формы хромофора cpYFP(500 нм) - фильтры Excitation: BP 504/12 (YFP); Emission: BP 542/27 (YFP). Использовали объектив НСХ Р2 ApoLambda blue 63*1,4 Oil. Оба биосенсора экспрессировались в клетках HeLa Kyoto и сохраняли функциональность, что было подтверждено с помощью тестирования биосенсоров в клеточном лизате. Для тестирования использовали сопряженную ферментативную систему, описанную в примере 2.

Все публикации и патенты, цитируемые в настоящем описании, вводятся в настоящее описание посредством ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно введена посредством ссылки. Цитирование любой публикации приводится в соответствии с контекстом и интерпретацией по предлагаемому изобретению и не должно истолковываться как признание любой такой публикации прототипом данного изобретения.