антитела против g-белка распираторно-синцитиального вируса (rsv)

Формула изобретения

1. Изолированное моноклональное антитело (mAb) или его иммунореактивный фрагмент, которые связываются с эпитопом в пределах остатков 160-176 G-белка штамма A2 респираторно-синцитиального вируса (RSV), где

тяжелая цепь имеет область CDR1, состоящую из SSNYYWG (положения 31-37 SEQ ID NO :29), область CDR2, состоящую из SIHDSGSIYYNPSLRS (положения 52-67 SEQ ID NO :29), и область CDR3, состоящую из HLVWFGELRNNWFDP (положения 100-114 SEQ ID NO:29), а легкая цепь имеет область CDR1, состоящую из RASQSVNSNLA (положения 24-34 SEQ ID NO :43), область CDR2, состоящую из GASTRAT (положения 50-56 SEQ ID NO:43), и область CDR3, состоящую из QQYNNWPL (положения 89-96 SEQ ID NO:43) (3G12), или

тяжелая цепь имеет область CDR1, состоящую из ЕНАМН (положения 31-35 SEQ ID NO :31), область CDR2, состоящую из GISWNSGSVGYADSVKG (положения 50-66 SEQ ID NO :31), и область CDR3, состоящую из MVATTKNDFHYYKDV (положения 99-113 SEQ ID NO :31), а легкая цепь имеет область CDR1, состоящую из KASQSVSNHLA (положения 24-34 SEQ ID NO :45), область CDR2, состоящую из ETSNRAT (положения 50-56 SEQ ID NO :45), и область CDR3, состоящую из QQRNNWYT (положения 89-96 SEQ ID NO :45) (3D3), или

тяжелая цепь имеет область CDR1, состоящую из TYPIS (положения 31-35 SEQ ID NO :33), область CDR2, состоящую из RIIPDPPMANIAQKFQG (положения 50-66 SEQ ID NO :33), и область CDR3, состоящую из EILQSPPFAVDV (положения 99-110 SEQ ID NO :33), а легкая цепь имеет область CDR1, состоящую из TGSSSDVGGYSHVS (положения 23-36 SEQ ID NO :47), область CDR2, состоящую из EVSNRPS (положения 52-58 SEQ ID NO :47), и область CDR3, состоящую из GSYASTNILH (положения 91-100 SEQ ID NO :47) (2 В11), или

тяжелая цепь имеет область CDR1, состоящую из TYYIH (положения 31-35 SEQ ID NO :37), область CDR2, состоящую из VINPSGGSTTYAQKFQD (положения 50-66 SEQ ID NO :37), и область CDR3, состоящую из VHKGRAEQWQLLHGHFDL (положения 99-116 SEQ ID NO :37), а легкая цепь имеет область CDR1, состоящую из KSSQSVLYSSNNKTYLA (положения 24-40 SEQ ID NO :51), область CDR2, состоящую из WASTRES (положения 56-62 SEQ ID NO :51), и область CDR3, состоящую из QQYYTTP (положения 95-101 SEQ ID NO :51) (1D4), или

тяжелая цепь имеет область CDR1, состоящую из SGQYYWA (положения 31-37 SEQ ID NO :38), область CDR2, состоящую из SIHYSGSTYQNPSLKS (положения 52-67 SEQ ID NO :38), и область CDR3, состоящую из QQLSLSPVENWFDP (положения 100-113 SEQ ID NO :38), а легкая цепь имеет область CDR1, состоящую из RASRSVGSRLA (положения 24-34 SEQ ID NO :52), область CDR2, состоящую из AASTRAT (положения 50-56 SEQ ID NO :52), и область CDR3, состоящую из QQYKEWPL (положения 89-96 SEQ ID NO:52) (IG8), или

тяжелая цепь имеет область CDR1, состоящую из GYAMH (положения 31-35 SEQ ID NO :40), область CDR2, состоящую из VISFDGSNNYYADSVKG (положения 50-66 SEQ ID NO :40), и область CDR3, состоящую из PDVIAVAGTALSNPFDL (положения 99-115 SEQ ID NO :40), а легкая цепь имеет область CDR1, состоящую из RASQSVRSNLV (положения 23-33 SEQ ID NO :54), область CDR2, состоящую из GASTRAT (положения 49-55 SEQ ID NO :54), и область CDR3, состоящую из QQNNNWPP (положения 87-95 SEQ ID NO :54) (10С6).

2. mAb или фрагмент по п.1, где указанное mAb представляют собой 3G12, 3D3, 2 В11, 1D4, 1G8 или 10С6, а указанный иммуноспецифический фрагмент взят из 3G12, 3D3, 2В11, 1D4, 1G8 или 10С6.

3. mAb по п.1, которое находится в форме полного антитела.

4. mAb или фрагмент по любому из пп.1-3 для применения в способе лечения RSV у субъекта-человека, инфицированного RSV.

5. mAb или фрагмент по любому из пп.1-3 для применения в способе снижения воспаления дыхательных путей у субъекта-человека, инфицированного RSV.

6. mAb или фрагмент по любому из пп.1-3 для применения в способе повышения резистентности к инфекции RSV у субъекта-человека.

7. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики RSV, содержащая изолированное моноклональное антитело или фрагмент по любому из пп.1-3 вместе с фармацевтически приемлемым эксципиентом.

8. Фармацевтическая композиция по п.7, дополнительно содержащая дополнительное фармацевтическое средство, отличное от антитела, иммунореактивного по отношению к RSV, вместе с фармацевтически приемлемым эксципиентом; или

дополнительно содержащая одно или более моноклональных антител или их фрагментов, которые иммунореактивны по отношению к F-белку RSV.

9. Фармацевтическая композиция по п.7 или 8 для применения в способе лечения RSV у субъекта-человека, инфицированного RSV.

10. Фармацевтическая композиция по п.7 или 8 для применения в способе снижения воспаления дыхательных путей у субъекта-человека, инфицированного RSV.

11. Фармацевтическая композиция по п.7 или 8 для применения в способе повышения резистентности к инфекции RSV у субъекта-человека.

12. Двухцепочечная выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит первую нуклеотидную последовательность, кодирующую mAb или фрагмент по п.1 или 2, и вторую нуклеотидную последовательность, комплементарную указанной первой нуклеотидной последовательности по всей ее длине.

13. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая систему экспресии и двухцепочечную выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.12, где указанная рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, микробную клетку, клетку насекомого или растительную клетку.

14. Способ получения mAb или его иммунореактивного фрагмента, включающий культивирование клетки по п.13 и выделение указанных mAb или фрагмента.

Описание изобретения к патенту

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительных заявок на патенты США № 61/000469, поданной 25 октября 2007 г., и № 61/089401, поданной 15 августа 2008 г. Содержание каждого из этих документов включено в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к антителам, которые иммунореактивны по отношению к функционально важному эпитопу, содержащемуся на G-белке респираторно-синцитиального вируса (RSV), которые минимально иммуногенны при введении человеку. Эти антитела могут быть использованы для повышения резистентности людей к инфекции RSV, равно как и для снижения инфекционной нагрузки у уже инфицированных лиц, или облегчения симптомов, вызванных инфекцией RSV.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Инфекция RSV представляет собой давнюю и опасную проблему во всем мире, включая Соединенные Штаты Америки, Европу, Австралию и Японию. Особое беспокойство она вызывает в случаях недоношенных младенцев, маленьких детей и пожилых людей и, безусловно, для всех людей с ослабленной иммунной системой. Подсчитано, что около двух третей детей в возрасте до 1 года и почти все дети в возрасте от 1 до 4 лет хотя бы один раз были инфицированы RSV, при этом большинство случаев выздоровления происходит без необходимости медицинского вмешательства. Тем не менее, у 5-10% наблюдается длительная тяжелая инфекция, что считается фактором, провоцирующим симптомы одышки и астмы в более позднем детстве. RSV имеет два основных поверхностных гликопротеина, F и G. Единственное на рынке моноклональное антитело против RSV было одобрено только для профилактического применения у недоношенных детей для предупреждения инфекции RSV, и оно направлено против F-белка. Это антитело, паливизумаб (Synagis^®, от MedImmune), является широко применимым благодаря консервативности последовательности F-белка среди штаммов. Напротив, G-белок является довольно вариабельным, за исключением центрального домена «CX3C», который был почти неизменным у около 100 просеквенированных штаммов. Эта область включает мотив, который, как было показано, взаимодействует с рецепторами фракталкинов. Считается, что такое взаимодействие способствует длительному течению заболевания, характерному для RSV, подавляя эффективный иммунный ответ на данный вирус: Tripp, R. A., et al., Nature Immunology (2001) 2:732-738. Также было показано, что эта область является антагонистом Toll-подобного рецептора 4, который, как полагают, способствует подавлению эффективного иммунного ответа: Polack, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2005) 102:8996-9001; Shingai, et al., Int'l Immunology (2008) epub July 8.

Первоначальные попытки профилактики RSV с помощью вакцинации оказались контрпродуктивными. Вакцинации инактивированным в формалине RSV или G-гликопротеином RSV сопутствовали увеличение тяжести заболевания и легочная эозинофилия, что объясняется ранее отмеченной консервативностью последовательности области G-белка, обозначенной CX3C, которая имитирует хемокиновый фракталкин. (Haynes, L. M., et al., J. Virol. (2003) 77:9831-9844.) Пассивная иммунизация с использованием антител, направленных против G-белка, обычно считается нецелесообразной из-за отсутствия консервативности последовательности этого белка среди штаммов.

Впоследствии той же группой было подтверждено, что ответы антител против G-белка, вызванные инфекцией RSV или вакцинацией, соответствовали ингибированию связывания G-белка с CX3C-фракталкиновым рецептором и модуляции хемотаксиса лейкоцитов, опосредованного G-белком RSV (Harcourt, J. L., et al., J. I. D. (2004) 190:1936-1940), и что ингибирование этого связывания отрицательно сказывается на Т-клеточных ответах (Harcourt, J. L., et al., J. Immunol. (2006) 176:1600-1608). Более современные исследовательские работы по созданию вакцин предотвращают обострение болезни, связанное с фиксированной в формалине вакциной, но было обнаружено, что иммунитет, полученный благодаря более новым вакцинам, быстро ослабевает (от недель до нескольких месяцев), в соответствии с низкой иммунологической памятью в отношении природных RSV: Yu, et al., J. Virol. (2008) 82:2350-2357. Повторные инфекции обычны для этого вируса, в отличие от многих других. За этот эффект могут быть ответственны иммуносупрессивные свойства G-белка.

Моноклональные антитела, направленные против G-белка, известны уже более 20 лет. В работе Anderson, L. J., et al., J. Virol. (1988) 62:4232-4238 описана способность смесей моноклональных антител (mAb) против белков F и G, а также индивидуальных mAb нейтрализовывать RSV. Относящиеся к связыванию G-белка mAb, в особенности 131-2G, позднее были изучены Sullender, W., Virol. (1995) 209:70-79 в антигенном анализе. Было установлено, что это антитело связывается как с RSV группы А, так и группы B, представляющих основные штаммы RSV.

Помимо этого, работа Mekseepralard, C., et al., J. Gen. Virol. (2006) 87:1267-1273 резюмирует более ранние статьи, показывающие, что пассивно введенные антитела как против F, так и против G-белков защищают от экспериментальной инфекции в моделях на грызунах. Эти статьи включают Routledge, et al., J. Gen. Virol. (1988) 69:293-303; Stott, E. J., et al., J. Virol. (1986) 60:607-613; Taylor, G., et al., Immunol. (1994) 52:137-142; и Walsh, E. E., et al., Infect. Immun. (1984) 43:756-758. В исходной статье Mekseepralard и др. отметили, что моноклональное антитело, специфичное против G-белка (1C2), нуждается в гликозилировании для нейтрализации вируса в присутствии комплемента in vitro или при использовании in vivo у мышей. Авторы отмечают, что аминокислоты 173-186 G-белка консервативны и что 1C2 было направлено против консервативной области; однако способ получения неиммуногенных антител был относительно грубым, а именно Fab мышей «химеризовали» на Fc область человека.

Помимо этого, в работе Corbeil, S., et al., Vaccine (1996) 14:521-525 показано, что система комплемента участвует в защите мышей при контрольной стимуляции RSV после пассивной иммунизации моноклональным антителом мыши 18A2B2, даже если это антитело не проявляет вируснейтрализующую способность in vitro.

Публикация РСТ WO 00/43040 описывает использование антител против субстанции P для смягчения воспаления дыхательных путей, связанного с инфекцией RSV. Продукция субстанции Р, известного провоспалительного медиатора, увеличивается посредством введения G-белка RSV и отсутствует у мутантов RSV, у которых отсутствует G-белок или в центральной консервативной области присутствует подавляющая функцию точечная мутация: Haynes, et al., J. Virol. (2003) 77:9831-9844.

Патент США 2006/0018925 описывает и заявляет права на антитела и малые пептиды, способные блокировать взаимодействие области CX3C G-белка с его рецептором. Эти композиции предложены как полезные для модуляции инфекции RSV и стимуляции иммунитета. Хотя предложена гуманизация антител мышей, демонстрирующих лечебно-профилактическое значение этих антител, фактически никаких гуманизированных форм не было получено или описано.

Публикация РСТ WO2007/101441, переуступленного компании Symphogen, направлена на получение рекомбинантных поликлональных антител для лечения инфекций RSV. Поликлональные рекомбинантные антитела состоят из индивидуальных моноклональных антител, выделенных из сыворотки крови человека. В таблице 5 этой публикации описываются 12 моноклональных антител, которые, как утверждается, связываются с «консервативной областью» со 164 по 176 аминокислоты G-белка RSV подтипа А. Пятеро из них были проверены на аффинность с G-белком, и эти аффинности оказались в диапазоне 100-500 пМ. Двое из этих антител были проверены на способность к нейтрализации в реакции подавления бляшкообразования (PRNT); одно показало значение EC₅₀ около 2,5 мкг/мл, а другое вообще не проявило никаких нейтрализующих свойств.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Антитела, специфически иммунореактивные по отношению к G-белку RSV по сравнению с F-белком, в том числе те, которые иммунореактивны по отношению к штаммам обеих групп А и B и имеют высокую аффинность к G-белку и сильную вируснейтрализующую способность, были идентифицированы у людей-доноров, достоверно незадолго инфицированных RSV. Кроме того, антитело мыши против G-белка, первоначально описанное в работе Anderson, et al., J. Virol. (1988) 62:4232-4238, было модифицировано таким образом, чтобы свести к минимуму вероятность иммунологического отторжения при введении человеку. Антитела по данному изобретению находят применение в качестве терапевтических средств, а также для повышения резистентности к RSV у людей. В конкретном плане, антитела к консервативному мотиву в положениях 160-176 G-белка подтипа A терапевтически эффективны при устранении вируса у субъектов, которые уже инфицированы, и для ослабления воспаления дыхательных путей, характерного для инфекции RSV, а также для профилактического применения.

Таким образом, в одном аспекте данное изобретение направлено на моноклональные антитела или их иммунореактивные фрагменты, которые связывают эпитоп приблизительно в пределах положений 160-176 G-белка штамма A RSV и которые минимально иммуногенны при введении человеку. Эти антитела показывают вируснейтрализующие способности в стандартных тестах бляшкообразования по нейтрализации RSV и демонстрируют в таких тестах EC₅₀, составляющую <500 нг/мл, предпочтительно <200 нг/мл, более предпочтительно <100 нг/мл. Антитела по данному изобретению также имеют аффинности к G-белку RSV-A2, составляющие <1 нМ, предпочтительно <500 пМ, более предпочтительно <100 пМ. Антитела по данному изобретению, в одном варианте осуществления, связываются в пределах 30 остатков хемокинового мотива CX3C, содержащегося в G-белке RSV, либо непосредственно с ним, как минимум с его частью, в области, которая имеет высокую степень идентичности аминокислот среди множества штаммов RSV. Хемокиновый мотив CX3C находится примерно в положениях аминокислот 182-186 штамма RSV-A2 и в соответствующих положениях G-белка других штаммов. Было установлено, что соответствующая область, внутри которой связываются антитела по данному изобретению, заключена в пределах остатков 160-176 G-белка RSV-A2 и соответствующих положений G-белка других штаммов. Эта область высококонсервативна в штамме A и содержит лишь небольшие аминокислотные различия между штаммами A и B. В частности, высококонсервативная область имеет последовательность HFEVFNFVPCSIC в положениях 164-176 RSV-A2. Предпочтительно антитела по данному изобретению связывают эпитоп, включающий последовательность FEVFNF или последовательность VFNFVPCSIC. В одном варианте осуществления, антитела по данному изобретению иммунореактивны по отношению к этой области консервативной аминокислотной идентичности и, таким образом, с G-белком штаммов этого вируса как группы A, так и группы B, а потому - с G-белком большинства штаммов.

Для использования в способах по данному изобретению для лечения инфекции RSV или с целью повышения резистентности к RSV, моноклональные антитела и фрагменты по данному изобретению могут быть иммунореактивны по отношению к множеству штаммов обеих групп А и В, и одного единственного моноклонального антитела может быть достаточно, чтобы произвести желаемый эффект. В ином случае, субъекту, подлежащему лечению, или которого предстоит сделать резистентным, может быть введено более чем одно единственное моноклональное антитело, в частности, когда одно антитело в протоколе обладает более высокой реакционной способностью по отношению к штаммам группы А, а другие - более высокой реакционной способностью по отношению к штаммам группы B.

Данное изобретение также включает фармацевтические композиции, пригодные для профилактики или лечения, в том числе смягчения воспаления, которые содержат в качестве действующего средства единственное антитело или иммунореактивный фрагмент по данному изобретению либо не более 2 антител или фрагментов по данному изобретению.

Другие аспекты по данному изобретению включают способы использования антител для лечения RSV у людей или для индуцирования резистентности у этих субъектов.

Моноклональные антитела по данному изобретению могут быть получены рекомбинантно, и, следовательно, данное изобретение также включает рекомбинантные материалы для такого получения, равно как и клеточные линии или иммортализованные клетки, а также не относящиеся к человеку многоклеточные организмы или их клетки, или микробные клетки, для получения этих антител. В одном варианте осуществления клетки, полученные у людей, получают в «иммортализованной» форме, в которой их модифицируют, чтобы обеспечить секрецию антител в течение достаточно длительного периода времени, чтобы их можно было охарактеризовать и клонировать соответствующую кодирующую последовательность.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Фигура 1 представляет собой график, показывающий частоту встречаемости в м.д. антител к различным антигенам RSV у людей. Желательный штамм-независимый анти-G фенотип (Gab) встречается достаточно редко, примерно 10 частей на миллион (м.д.) в совокупности, и снижается до 1 м.д. у отдельных субъектов. «Смеш.» относится к антителам, связывающим как F, так и G; поскольку F и G не имеют гомологии последовательностей, связывание, вероятно, объясняется общими углеводными детерминантами.

Фигура 2A представляет собой схему G-белка RSV с указанием области CX3C и расположения консервативных дисульфидных связей. Схематический вариант является универсальным для всех штаммов, хотя конкретные нумерации положений немного отличаются от одного штамма к другому.

На фигуре 2B графически представлено связывание сывороток от подвергшихся действию RSV субъектов относительно панели перекрывающихся 12-мерных пептидов из G-белка RSV, обнаружившее слабую иммуногенность центральной консервативной области.

На фигуре 2C графически представлена частота полиморфизма для коллекции более 75 штаммов RSV в зависимости от положения в G-белке, обнаружившая замечательную консервативность в центральной консервативной области и в местах альтернативного сплайсинга, что создает растворимую форму G-белка.

На фигуре 3 показаны результаты исследования иллюстративного моноклонального антитела (131-2G) мышей относительно матрицы пептидов с перекрывающимися последовательностями. Это исследование выявило эпитоп, с которым связывается данное mAb. В иллюстративном случае эпитоп находится в пределах 30 остатков мотива CX3C.

Фигуры 4A-4D: На панелях A и B представлены сводные диаграммы крови от двух доноров. На панели A показан донор, обладающий ценной частотой встречаемости Ga/Gb перекрестно-реагирующих клонов. На панели B показан донор, у которого этого нет. Каждая точка диаграммы изображает относительное связывание с 3 пробами для «молекулярного отпечатка» антител, секретируемого единичным клоном. Панель C представляет собой количественный профиль «молекулярного отпечатка» секретируемого белка единичной B-клетки, трансформированной вирусом Эпштейн-Барра (EBV). На панели D показаны профили клеток 4 поколения от клетки HEK293, трансформированной генами антител из клетки на панели C. Этот профиль идентичен таковому на панели C, в пределах точности анализа, как определено с помощью репликатов на панели D.

На фигурах 5A-5B показаны последовательности тяжелых цепей (панель А) и легких цепей (панель B) для репрезентативных антител по данному изобретению.

На фигурах 6A-6F показаны результаты определения аффинности двух антител по данному изобретению, полученные с помощью биосенсоров Biacore. Как показано на панелях E и F, антитело 3D3 связывает G-белок и не показывает непосредственно детектируемой скорости диссоциации. На панелях A и D показано связывание антител с поверхностью сенсора. На панелях B и E показано увеличение сигнала сенсора, по мере того как белок Ga протекает параллельно поверхности и захватывается связанным антителом, за чем следует снижение сигнала, по мере того как поверхность промывают буфером, позволяющим связанному белку Ga десорбироваться с поверхности. На панелях C и F аналогичным образом показаны скорости ассоциации и скорости диссоциации для белка Gb.

Фигура 7 представляет собой график связывания различных антител по данному изобретению по сравнению с Synagis ^® F белок-связывающим антителом, определенный в тесте ELISA с использованием живого вируса для покрытия микропланшет.

Фигура 8 представляет собой график, на котором по оси Х отложена аффинность к G-белку относительно связывания с вирусом по оси Y. Два данных показателя коррелируют, хотя 3D3 показывает несколько меньшую аффинность к живому вирусу, чем можно было бы предполагать, исходя из его аффинности к G-белку.

На фигурах 9A и 9B показано сравнение связывания нескольких антител со штаммами А2 и А5.

На фигуре 10 показаны результаты анализов на вируснейтрализующую способность. Результаты приведены в виде числа бляшек, нанесенных в зависимости от мкг антитела.

На фигуре 11 показано сравнение антитела 3G12 по данному изобретению с антителом Synagis ^® по нейтрализации штамма B RSV.

На фигуре 12 показано сравнение профилактической активности двух антител по данному изобретению с коммерческим антителом Synagis ^®.

На фигурах 13A-13C показана терапевтическая эффективность mAb 131-2G в модели на мышах пост-инфекции RSV (обработка в день +3 после инфекции), включая дозозависимое снижение вирусной нагрузки (панель А) наряду с другими мерами по снижению воспаления легких: клетки NK и клетки PMN (панель B), а также интерферон-гамма (IFN ) (панель C).

На фигуре 14 показана динамика вирусного титра в модели на мышах, обработанных антителами 3G12, 3D3 или Synagis^® в малых дозах, что подчеркивает эффективное преимущество высокоаффинных антител по данному изобретению.

Фигура 15 представляет собой кривую зависимости «доза-эффект», оценивающую влияние антител на количество копий RSV в легких RSV-инфицированных мышей при обработке в день +3 после инфекции.

На фигуре 16 показана сравнительная способность Synagis ^®, 3D3 и 3G12 снижать вирусную нагрузку на конечных стадиях инфекции после обработки в день +3 после инфекции.

На фигуре 17 показано влияние контрольного антитела, анти-F антитела и анти-G антитела на клетки BAL в легких RSV-инфицированных мышей. Обработку проводили в день +3 после инфекции.

На фигурах 18A и 18B показано, что F(ab')₂ иммуноспецифические фрагменты анти-G mAb также эффективны, как интактные mAb, для уменьшения воспаления у RSV-инфицированных мышей, когда их дают в день +3 после инфекции, но неэффективны для снижения вирусной нагрузки.

На фигурах 19A-19C показано влияние анти-G mAb на продукцию IFN в клетках BAL при различных моментах начала введения антител, начиная от профилактического (день -1) до дня +3 и дня +5 после инфекции.

На фигуре 20 показан титр антител против центральной консервативной области G-белка RSV у пожилых пациентов, инфицированных вирусом RSV. Пациенты были отобраны в зависимости от выраженности клинических признаков и симптомов, тяжелых или легких. Отсутствие поддающегося оценке титра к центральной консервативной области коррелирует с тяжелым заболеванием.

СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе термин «лечить» относится к снижению вирусной нагрузки у субъекта, который уже инфицирован RSV, или к смягчению симптомов болезни у этого субъекта. Такие симптомы включают бронхиолит, воспаление дыхательных путей, застой крови в легких и затруднение дыхания.

Термин «придает резистентность к» относится к профилактическому эффекту, при котором вирусная инфекция RSV в результате контрольной стимуляции, как минимум, снижает свою тяжесть.

«Иммортализованные клетки» относятся к клеткам, которые могут пережить значительно больше пересевов, чем немодифицированные первичные изолированные клетки. В контексте настоящего изобретения термин «иммортализованные» не обязательно означает, что клетки продолжают секретировать антитела в течение очень длительных периодов времени, а только то, что они могут выживать дольше, чем культуры первичных клеток. Время, за которое происходит секреция антитела, должно только быть достаточным для его идентификации и воссоздания кодирующих нуклеотидных последовательностей.

Фраза «минимально иммуногенные при введении людям» означает, что ответ на введение в организм человека похож на таковой, когда таким людям вводят человеческие или гуманизированные антитела. Известно, что человеческие или гуманизированные антитела действительно вызывают ответ у 5-10% обработанных людей. Это верно даже для антител, которые выделены непосредственно у людей, так как существует определенный уровень фонового «шума» у вызванной иммунной реакции. Иммунный ответ может быть гуморальным, или клеточным, или обоюдным. В частности, у этого процента лиц можно обнаружить повышенные уровни цитокинов.

Фраза «консервативная область G-белка RSV» относится к аминокислотной последовательности, содержащей 50 аминокислот, предпочтительно 30 аминокислот, более предпочтительно 20 аминокислот, по обе стороны от области CX3C, что показано для конкретного штамма на фигуре 2A. Консервативная область в основном вытянута в 3'-5' направлении от конкретной области CX3C G-белка. Так, используя G-белок RSV штамма A2 в качестве модели, консервативная область, соответствующая антителам по данному изобретению, вытянута примерно со 160 по 188 остаток, предпочтительно со 160 по 176.

Антитела по данному изобретению имеют ряд желательных свойств. Во-первых, они иммунореактивны с G-белком из множества штаммов RSV и, как правило, иммунореактивны с G-белками и штаммов типа A, и штаммов типа B. Во-вторых, они обладают довольно высокой аффинностью к G-белку, некоторые из них в диапазоне от <2 пМ. Так, антитела по данному изобретению имеют аффинности, составляющие, по меньшей мере 10 нМ, предпочтительно 1 нМ, более предпочтительно 500 пМ, еще лучше 100 пМ, либо 50 пМ, 10 пМ или 1 пМ, а также все значения между этими предпочтительными иллюстративными точками. Было установлено, что коммерческие антитела Synagis^®, направленные против F-белка, имеют аффинность около 5 нМ. Антитела против F-белка с более высокой аффинностью, Numax (мотавизумаб), по оценкам, имеют аффинность около 50 пМ. Антитела по данному изобретению показывают превосходную способность работать в качестве терапевтических средств, а также демонстрируют способность снижать количество вирусов в легких на пике инфекции. Они также проявляют эту способность в точке, где обычно инфекция себя исчерпывает. Это особенно полезно, поскольку субъекты, выздоравливающие после инфекции RSV, могут продолжать распространять вирус и, следовательно, могут инфицировать других в постклинических условиях. Антитела и их фрагменты также лечат симптомы инфекции, в том числе воспаление легких.

Антитела по данному изобретению были получены двумя иллюстративными путями. В одном подходе, отмеченные выше существующие моноклональные антитела, 131-2G, которые, как известно, иммунореактивны с консервативной областью G-белка, были сначала просеквенированы, а затем гуманизированы путем гибридизации константной области человека с модифицированными вариабельными областями человека (как тяжелыми, так и легкими цепями). Вариабельные области были выбраны на основе высокой гомологии с вариабельными областями антитела 131-2G, а затем модифицированы, чтобы вставить гипервариабельные аминокислоты 131-2G. Общеизвестны способы такой гуманизации, обеспечивающие правильный набор аминокислотных замен, которые можно выбрать. В случае 131-2G, оригинальная гибридомная линия экспрессировала более одной легкой цепи, требуя выбора, которая из них на самом деле ответственна за связывание консервативного мотива RSV. Это было определено авторами настоящего изобретения, и в одном варианте осуществления антитела по данному изобретению служат примером гуманизированной формы mAb 131-2G.

В альтернативном способе антитела по данному изобретению были выделены из людей-доноров, инфицированных RSV, с помощью патентованного CellSpot способа, который описан в патенте США 7413868, международных публикациях согласно PCT WO 2005/045396 и WO 2008/008858, все включены посредством ссылки.

В этом способе были проанализированы 40 образцов RSV-инфицированных доноров в рамках процесса, производящего ~500000 антитело-продуцирующих клеток на каждый образец крови. Так, в общей сложности ~20000000 различных B-клеток были проанализированы на продукцию антител, которые являются специфическими для консервативной области G-белка. Только ~10% доноров имели подходящую частоту Ga/Gb специфичных клонов (то есть независимых от штамма), и такие клоны присутствовали только у ~1/50000 клеток, даже у представителей с самой высокой частотой. В целом, частота желательных клеток составила ~0,003%, что достаточно низко для целесообразности выделения стандартными методами, но легко достижимо с помощью CellSpot . На фигуре 1 показан спектр реакционных способностей к антигенам RSV для 24 доноров. Как показано на этой фигуре, даже у тех лиц, у кого были обнаружены антитела, перекрестно реагирующие с G-белком, полученным из штаммов как A, так и B, преобладание этих антител значительно меньше, чем антител, иммунореактивных с F-белком, либо с Ga или Gb по отдельности. Удивительно большое число клонов распознают как белок F, так и G (обозначено «смеш.»), которые, вероятно, распознают общие углеводные детерминанты. Аффинности таких анти-углеводных антител, как правило, низки и далее не рассматривались. Самая высокая аффинность антител, найденная у этой группы доноров, аффинность порядка 1 пМ, происходила от одного из доноров с очень низкой частотой Ga/Gb специфичных клонов, ~1 м.д. А именно, обнаружение этого в высшей степени подходящего клона было бы маловероятным без всестороннего скрининга полного репертуара от всех доноров.

Для того чтобы выполнить этот скрининг, В-клетки были иммортализованы вирусом Эпштейна-Барра и оценивались в соответствии с описанными выше способами (см. пример 2 для подробностей). Были выявлены подходящие B-клетки, и были получены и просеквенированы нуклеотидные последовательности, кодирующие выявленные моноклональные антитела. Затем с ними производили манипуляции в рамках рекомбинантных технологий, чтобы они могли продуцировать антитела в линии клеток млекопитающих.

Важный аспект функции G-белка свойственен секретируемой форме белка, s(G), созданной с помощью сайта альтернативного сплайсинга в районе остатка 50. Конструирование вируса, у которого отсутствует s(G), привело к снижению уровня легочной инфильтрации клеток (Maher, et al., Microbes Infect. (2004) 6:1049-1055). С другой стороны, примирование мышей посредством s(G) увеличивает продукцию IL-5 и эозинофилию легких (Johnson, et al., J. Virol. (1998) 72:2871-2880). Соответственно, супрессия активности s(G) важна для эффективного лечения RSV. Для достижения этой цели необходимо высокоаффинное антитело, что общеизвестно в данной области (например, патент США 7083950). Поскольку центральная консервативная область непосредственно причастна к функции s(G) как иммуномодулирующее средство, эффективные антитела против s(G) должны быть нацелены на этот мотив.

Наше исследование репертуара человеческих B-клеток субъектов, подвергнутых действию RSV, было безоценочным в поисках антител, которые связываются с G-белком обоих штаммов А и B (Ga/Gb перекрестно-реактивные антитела). Поскольку исследование было обширным (40 субъектов, от каждого ~500000 проверенных B-клеток), замечательной находкой является то, что все Ga/Gb перекрестно-реактивные антитела, связывающие линейные эпитопы, подходящие для картирования, распознают эпитопы в пределах нескольких остатков друг от друга внутри центральной консервативной области. Эта область, как известно, имеет низкую иммуногенность, как показано на фигуре 2B (Plotnicky-Gilquin, et al., Virology (2002) 303:130-137), что согласуется с низкой частотой высокоаффинных к этой области клонов, о чем здесь сообщалось. Авторы также далее охарактеризовали эту область путем изучения опубликованных последовательностей G-белков из >75 RSV изолятов. Большинство остатков белка показывают в данной выборке от нескольких до многих полиморфизмов. Две области поразительно свободны от полиморфизмов: сайт альтернативного сплайсинга, который создает s(G), и центральная консервативная область, с которой связываются все Ga/Gb перекрестно-реактивные антитела (фигура 2С). А именно, авторы обнаружили, что область, которая высококонсервативна, что служит признаком особо важной функциональности, также является низкоиммуногенной. Целый ряд механизмов может быть причиной такой низкой иммуногенности, например, отсутствие близлежащих сайтов протеолитического расщепления, подходящих для эффективного презентирования данной области совместно с антигенами гистосовместимости для экспозиции остальной части иммунной системы. Каким бы ни был механизм, этот неожиданный результат понятен: те вирусы, которые выжили, показывают низкую иммуногенность к этой области. Поэтому авторы предвидели, что увеличение активности иммунной системы против этой области путем пассивной трансплантации подходящих антител будет эффективным, и моделями на животных было подтверждено, что дело обстоит именно так. Сайт альтернативного сплайсинга, хотя и консервативен в равной степени, не является необычайно низкоиммуногенным, указывая на то, что его важность заключается только в отношении создания s(G), таким образом делая его плохой мишенью для пассивной иммунотерапии.

Получение человеческих или гуманизированных антител по данному изобретению осуществляется обычными рекомбинантными методами, такими как получение в клетках яичника китайского хомячка или в других эукариотических клеточных линиях, таких как клетки насекомых. В качестве альтернативы известны также методы получения рекомбинантных материалов, в том числе антител, в растениях и в трансгенных животных, например в молоке крупного рогатого скота, либо в системах единичных клеток, происходящих из микробов, или растений, или насекомых.

Кроме того, поскольку нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела, соответствующие фрагменты, связывающие тот же эпитоп, например Fab, F(ab') ₂ или F_v фрагменты, могут быть получены рекомбинантными методами (или протеолитической обработкой самого белка), и антитела могут быть получены в одноцепочечной форме. В данной области известны различные методы управления производством рекомбинантных антител.

Для использования в терапии полученные рекомбинантными методами антитела или фрагменты составляют в фармацевтические композиции при помощи соответствующих вспомогательных средств и вводят в соответствии со стандартными протоколами. Данные фармацевтические композиции могут иметь в качестве единственного активного ингредиента моноклональное антитело или фрагмент по данному изобретению, особенно моноклональное антитело или фрагмент, который перекрестно реактивен с G-белком как A, так и B штаммов. В качестве альтернативы два моноклональных антитела могут быть отдельными активными ингредиентами, когда один более сильно реагирует с G-белком штамма A, а другой - более сильно с G-белком штамма B. Во всех этих случаях могут присутствовать дополнительные терапевтические средства, в том числе одно или несколько антител, иммунореактивных с F-белком, либо другие лекарственные средства, которые являются эффективными против RSV или воспаления. Так, например, такие противовоспалительные средства, как стероидные и нестероидные противовоспалительные соединения, могут быть включены в данные композиции. Также данные соединения могут включать питательные вещества, такие как витамины, или любое другое полезное соединение, отличное от антитела.

В одном варианте осуществления, когда составы для введения используются в целях повышения резистентности к инфекции, применяют полные антитела, включающие комплемент-содержащую Fc область. Как правило, данные антитела вводят при уровнях дозировки 0,01-20 мг/кг массы человека, либо в количествах в пределах 0,01-5 мг/кг, либо в промежуточных количествах в указанных пределах. В одном варианте осуществления применяют количества в пределах 0,1-1,0 мг/кг. Может быть полезным повторное введение, разделенное несколькими днями, либо несколькими неделями, либо несколькими месяцами. Также могут быть предложены бустерные инъекции через 1 или 2, или 5, или 10 лет.

В других вариантах осуществления, для терапевтического эффекта в целях снижения вирусной нагрузки, также используются полные антитела, включающие комплемент-содержащую Fc область. Количества, вводимые в рамках таких протоколов, составляют порядка 0,001-50 мг/кг или промежуточные значения в этом диапазоне, такие как 0,01, 1 или 10 мг/кг. Также может быть применено повторное введение. Терапевтическое воздействие назначают как можно скорее после диагностики инфекции, хотя введение в течение нескольких дней также находится в рамках данного изобретения. Также может быть применено повторное введение. В целях уменьшения воспалительной реакции в легких необходимо использовать только иммуноспецифические фрагменты антител. Уровни дозировки аналогичны таковым для полных антител. Введение смесей иммуноспецифических фрагментов и целых антител также входит в сферу данного изобретения.

Введение композиций антител по данному изобретению, как правило, проводят в виде инъекций, в большинстве случаев внутривенных инъекций. Таким образом, предпочтительным является парентеральное введение. Однако включенным является любой применимый способ введения.

Данные составы изготавливают способами, широко известными в данной области для введения композиций антител. Подходящие составы могут быть найдены в стандартных фармакологических справочниках, таких как Remington's Pharmaceutical Sciences, самое последнее издание, Mack Publishing Co., Easton, PA, включенное в данный документ посредством ссылки. Данные составы, как правило, пригодны для парентерального введения, в том числе в виде изотонических растворов, которые включают буферы, антиоксиданты и т.д., а также эмульсий, которые включают средства доставки, такие как липосомы, мицеллы и наночастицы.

Желательные протоколы и составы зависят от решения лечащего практикующего врача, равно как и от конкретного состояния данного субъекта. Уровни дозировки при необходимости будут зависеть от возраста, общего состояния здоровья и тяжести инфекции субъекта.

Следующие примеры представлены, чтобы проиллюстрировать, но не ограничить данное изобретение.

Пример 1

Клонирование и гуманизация 131-2G

Клонирование и секвенирование mAb 131-2G . Тотальную мРНК экстрагировали из 131-2G гибридомы в соответствии с инструкцией производителя (RNeasy kit: Qiagen Santa Clarita, Ca). Семь специфичных для данных семейств 5' V FR1 праймеров, сконструированных для нацеливания на семейства генов Ig , с VH1 по VH7, и один консенсусный 3' C 1 праймер применяли для амплификации и секвенирования вариабельной области тяжелой цепи 131-2G. Один консенсусный 5' Vk праймер сконструировали для амплификации каждого из Vk семейств, и один обратный праймер, специфичный для каппа-константной области, применяли для амплификации и секвенирования каппа-легкой цепи. Транскрипты VH и VL амплифицировали из 100 нг тотальной РНК с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR).

Две реакции PCR проводили для 131-2G гибридомы: одну для каппа-легкой цепи ( ) и одну для гамма-тяжелой цепи ( 1). Для амплификации применяли набор QIAGEN^® OneStep RT-PCR kit, (Qiagen Catalog № 210212). Экстрагированные продукты PCR непосредственно секвенировали, применяя праймеры, специфичные для константной области. Выведенные последовательности сравнивали с известными последовательностями зародышевых ДНК V- и J-областей Ig с помощью V-BASE2 и выравнивания VH и VL генов в базе данных зародышевых линий мышей. Анализ последовательностей: исходя из информации по нуклеотидным последовательностям, были получены данные о V- и J-генных сегментах тяжелой и легкой цепи 131-2G. На основании данных о последовательностях сконструировали комплекты новых праймеров, специфичных к лидерной последовательности VH и VK цепей Ig 131-2G. Анализ последовательности и частоты использования V-генов: гены тяжелых цепей 131-2G происходили из семейства генов зародышевой линии VH1, зародышевый ген D-области представляет собой DSP2.2, а J-область была из зародышевой линии JH3. Гены легких цепей происходили из семейств генов зародышевых линий V 1(K1A5) и J 4.

Использование V-сегмента IgH-VJ558 семейства VH1 в 131-2G:

Использование V-сегмента подгруппы Ig V1 в 131-2G:

Гуманизация mAb 131-2G. Связывание антитела (Ab) со своим распознаваемым антигеном (Ag) представляет собой высокоспецифическое взаимодействие. Эта специфичность заключается в структурной комплементарности между сайтом связывания антител и антигенной детерминантой. Сайты связывания антител составлены из остатков, происходящих в основном из гипервариабельных или определяющих комплементарность областей (CDR); иногда остатки из негипервариабельных (или каркасных) областей влияют на общую структуру домена и, следовательно, сайта связывания.

Репертуар сегментов генов VH мыши в два раза больше такового у людей и содержит больше функциональных генов по сравнению с человеческим локусом IgH. Локусы мыши и человека не имеют высокой степени сходства друг с другом. Первые две CDR VH и VL доменов имеют немногочисленный репертуар структур конформации основной цепи, называемых каноническими структурами. Существование особой канонической структуры в основном определяется длиной CDR и присутствием ключевых остатков на конкретных местах в последовательности. Одинаковые комбинации канонических структур семейства VH1 (VH1 1-2) распределяются между представителями семейств VH1 человека и VH1 мыши. На основании анализа последовательностей тяжелых и легких цепей 131-2G и того факта, что 131-2G использует V-сегменты IgH-VJ558 семейства VH1 и семейства Ig 1, обе цепи выравнивали и сравнивали с представителями человеческих семейств VH1 и VK1. Было установлено, что гомология последовательностей составила 70% и 77% идентичности с последовательностью зародышевой линии человека VH1-8 и Vk1-18 соответственно. Эти зародышевые линии были выбраны в качестве человеческой общей схемы для гуманизированных mAb 131-2G.

Картирование эпитопа mAb 131-2G. Вестерн-блот анализ с использованием RSV лизата и очищенного белка Ga показал, что 131-2G распознает линейный эпитоп. Связывающий домен 131-2G картировали с помощью набора перекрывающихся пептидов, полученных из последовательности G-белка RSV-A2. На фигуре 2А приведена схема последовательности G-белка, включая локализацию консервативного мотива CX3C. Для того чтобы получить точное картирование эпитопа, осуществляли сканирование семейства пептидов, образованных из додекамеров Ga, каждый из которых сдвинут на один остаток. Матрицу таких пептидов зондировали посредством mAb 131-2G при 1 мкг/мл. Связывание 131-2G детектировали с помощью меченных пероксидазой антител козы против иммуноглобулинов мыши в сочетании с суперсистемой детекции хемилюминесцентного сигнала (Pierce, Rockford IL, USA). Как подытожено на фигуре 3, антитело 131-2G реагирует с 8 последовательными пептидами, покрывающими белок RSV-Ga с остатка 157 по 176. Эпитоп, распознаваемый 131-2G, находится внутри пептидных последовательностей (157) SKPNNDFHFEVF (169) и (169) HFEVFNFVPCSI (176). С учетом единой последовательности из данных 8 пептидов, связывающий домен 131-2G картировали остатками 164-168.

Для получения характеристик аффинности 131-2G и аналогичных mAb человека применяли три способа. В первом способе измеряли сигнал связывания от фиксированного количества антител, испытываемых против серийных разведений антигена в форме ELISA. Срединная точка этой кривой титрования является приближением аффинности. В случае 131-2G, эта срединная точка составила 4 нМ. Во втором способе, аффинность 131-2G измеряли путем анализа Biacore в коммерческой аналитической лаборатории; на основании отношения скорости ассоциации к скорости диссоциации рассчитанная аффинность составила 7 нМ. В третьем способе разбавление белка Ga на бусинах CellSpot сывороточным альбумином снижает шанс многочисленных копий белка взаимодействовать с «молекулярным отпечатком» антитела. Итоговое подавление эффектов мультидентатной авидности от необработанных сигналов позволяет ранжировать набор клонов по аффинности относительно известного стандарта. Это измерение аффинности может быть использовано для сравнения человеческих антител с 131-2G и эффективного отбора высокоаффинных клонов. Все эти способы улучшаются при наличии постоянного источника антигена G-белка. В ранних исследованиях антиген экстрагировали из инфицированных вирусом клеток. Из-за изменчивости качества антигена, полученного таким образом, авторы разработали рекомбинантную систему экспрессии для продукции G-белка, которая оказалась более надежной.

Пример 2

Выделение человеческих B-клеток, секретирующих антитело против RSV-Ga/Gb

Мононуклеарные клетки периферической крови 40 взрослых субъектов с подтвержденной инфекцией RSV обследовали на человеческие B-клетки, продуцирующие противовирусные антитела. Субъектов с желательными антителами против входящего в состав RSV G-белка использовали для клонирования mAb, специфичных против RSV-G. По результатам обследования у ~10% субъектов частота встречаемости желательных клеток была выше, чем 1 на 100000. Даже те, что с более низкой частотой встречаемости, однако, представляют интерес и к тому же антитела, у которых определена самая высокая аффинность, получены от донора с очень низкой частотой желательного типа B-клеток, ~1 м.д.

Чтобы довести до конца обследование и восстановление редких подходящих клеток, авторы использовали ранее описанные технологии CellSpot . Тест CellSpot эффективно миниатюризирует эквивалентный тест ELISA до мнимой лунки размером с единичную клетку, захватывая секретируемые единичной клеткой IgG в качестве «молекулярного отпечатка» в непосредственной близости от клеток. В результате можно легко проанализировать миллионы клеток. Далее, применяя реагенты для мультиплексирования микроскопии (комбинаторно окрашенные флуоресцентные латексные микросферы, ср. патент США 6642062), можно подробно охарактеризовать «молекулярный отпечаток» секретируемых каждым клоном антител на специфичность и/или аффинность, используя многоцелевые биохимические зонды. Достоверности количественного анализа вполне достаточно, чтобы сделать возможным изъятие крайне редких подходящих клеток у обследованного населения, причем клонированная экспрессирующая клетка показывает фенотип в соответствии с исходным идентификационным тестом.

Критериями отбора были: связывание с G-белком от обоих из двух основных семейств штаммов, обозначенных Ga и Gb, и несвязывание с F-белком (другим основным белком вирусной оболочки). Ранжирование клонов в зависимости от аффинности может быть достигнуто путем разбавления антигена на бусине сывороточным альбумином. Это снижает шансы мультидентатного связывания с «молекулярным отпечатком» секретируемых IgG (эффект «авидности»), тем самым отбирая по признаку более высокой собственной аффинности. G-белок очищали из клеток Vero, инфицированных тем или другим из этих двух штаммов RSV.

Применительно к человеческим B-клеткам, данный способ начинается истощением не-B-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови, используя стандартные способы магнитного разделения. Клетки ресуспендировали в IMDM/20% HI-FCS до 1e6/мл; EBV (прямо осажденные из супернатанта инфицированных B95-8 клеток) добавляли в разведении 1:100 и клетки инкубировали 2 ч при 37°C. Избыток вируса отмывали, и клетки: либо культивировали при 2e6/мл в IMDM, 20% HI-FCS, 20% кондиционированной гигантоклеточной опухолью среде, 2 мкг/мл CpG (ODN2006) и 10 нг/мл IL-10 только для обследования, либо далее селектировали на поверхностные IgG с использованием магнитно-позитивного отбора. Клетки культивировали при 200-300 клеток/лунку на облученных легочных клетках человека (MRC-5, 5000 клеток/лунку) в IMDM, 20% HI-FCS, 20% кондиционированной гигантоклеточной опухолью среде, 2 мкг/мл CpG (ODN2006) и 10 нг/мл IL-10. Среду восполняли добавками каждые 2-3 дня. Одну половину содержимого лунок тестировали CellSpot в день 6. Остальные клетки в небольшом количестве лунок, положительных по результатам аналитического обследования, затем разбавляли до 10, 5, 1 и 0,5 клеток/лунку теми же питающими клетками и при тех же условиях культивирования. Через 4-5 дней эти планшеты для ограниченных разведений снова тестировали методом ELISA или CellSpot .

Содержимое положительных в ограниченных разведениях лунок затем обрабатывали с помощью PCR с обратной транскриптазой, чтобы получить полинуклеотид, кодирующий тяжелые и легкие цепи данного антитела. Общее время от оттаивания мононуклеарных клеток периферической крови до получения кодирующей последовательности мРНК путем RT-PCR составило 10-12 дней.

На фигуре 4 показаны иллюстративные данные этого эксперимента. Примеры из CellSpot профилирования подходящих и неподходящих образцов донорской крови показано на панелях A и B. Профиль подходящего клона при первоначальной детекции показан на панели C, наряду с репликативными профилями на панели D антитела, секретируемого потомством НЕК293 клетки, трансформированной посредством кДНК клонированного антитела, полученного из этой клетки. Профили совпадают в пределах точности данного анализа, что свидетельствует об успешном восстановлении подходящего клона.

Как было показано на фигуре 1, большинство анти-RSV антител направлены против F-белка или антигенной детерминанты, общей для F и G (скорее всего, углеводной, поскольку последовательности этих двух белков не гомологичны). Из специфичных для G антител, большинство связывает только Ga или только Gb, что согласуется с известной высокой вариабельностью последовательности G-белка. В итоге были протестированы ~20 миллионов индивидуальных B-клеток. С помощью RT-PCR были обнаружены 12 самых перспективных антител. В общей сложности, частота подходящих клонов была ниже 1 на 1 млн, и потребовалось более 50 млн тестов, эквивалентных ELISA, чтобы найти эти редкие клоны. Технология CellSpot , таким образом, дала возможность более масштабного обследования клонов, чем в ином случае было бы осуществимо. Качество полученных клонов превосходит то, что найдено с помощью более ограниченного скрининга, и совокупные особенности такого высококачественного набора обнаружили непредвиденные свойства желательных антител.

Пример 3

Клонирование человеческих антител против RSV-Ga/Gb

Амплификация реаранжированных генов Ig Heavy и Ig Light из положительных лунок ELISA была достигнута с использованием «полувложенной» полимеразной цепной реакции (PCR). Для амплификации заранее неизвестных реаранжировок V-гена сконструировали коллекцию праймеров, специфичных для семейств V-генов, которые распознают почти все сегменты V-генов в Ig-локусе человека. Использовали 5'-праймеры вместе со смесью праймеров, специфичной для C , C и C сегментов гена. Клональные свойства B-клеток, специфичных для серийных разведений RSV-G, однозначно определяли сравнением последовательностей продуктов амплификации V-генов из индивидуальных клеток потомства и амплифицированные полноразмерные реаранжировки V-генов клонировали в векторы экспрессии IgG. Этот способ также является полезным для решения дополнительных проблем, таких как частота использования V-, D- и J-генов, а также наличие и шаблон соматических мутаций.

Способы. Тотальную мРНК из изолированных B-клеток человека экстрагировали с помощью имеющегося в продаже набора очистки РНК (RNeasy ; Qiagen (Germany)). PCR с обратной транскрипцией проводили с использованием препаратов тотальной РНК и олигонуклеотидов в качестве праймеров. Для каждого образца необходимо выполнить три реакции PCR: одну для каппа ( ) легкой цепи, одну для лямбда ( ) легкой цепи и одну для гамма ( ) тяжелых цепей. Для амплификации применяли набор QIAGEN ^® OneStep RT-PCR kit (Qiagen Catalog No. 210212). В сопряженных RT-PCR реакциях кДНК синтезировали с помощью уникальной смеси ферментов обратной транскрипции (Omniscript и Sensiscript ) с использованием специфичного для антисмысловой последовательности праймера, соответствующего C- , C- или консенсусу CH1 областей генов C , обратную траскрипцию проводили при 50°C в течение 1 часа, после чего следовала PCR-амплификация кДНК с помощью HotStarTaq ДНК-полимеразы для высокой специфичности и чувствительности. Для каждой реакции PCR использовали смесь 5' смысловых праймеров. Последовательности праймеров были основаны на лидерных последовательностях VH, VK и VL. PCR-реакции проводили при 95°С в течение 15 минут, начальный горячей старт с последующими 20 циклами при 95°С в течение 30 секунд (денатурация), 60°С в течение 45 секунд (отжиг) и 72°С в течение 1 минуты (элонгация).

«Вложенная» PCR для обнаружения и клонирования вариабельных фрагментов Ig в векторы экспрессии. Во второй цикл направляли аликвоту 5 мкл первой реакции амплификации. Использованные праймеры содержали сайты рестрикции 5'BgIII и 3' XbaI. Было проведено тридцать циклов PCR. Для первого и второго циклов амплификации применяли одинаковые условия. По пять мкл от каждой реакции наносили и разделяли на 1% агарозном геле и окрашивали бромистым этидием. V-C PCR продукт, по прогнозам, амплифицирует реаранжированные фрагменты VH и VL, 500 и 450 п.о., соответственно. Полосы PCR, соответствующие молекулярному размеру около 500 п.о., означали положительный результат. Продукты PCR очищали (набор Qiagen для очистки из геля, каталожный номер 28704) и экстрагированные продукты PCR непосредственно секвенировали с использованием специфичных для константной области праймеров. Последовательности клонированных фрагментов подтверждали секвенированием плазмид, приготовленных для рекомбинантного производства.

На фигуре 5A показаны аминокислотные последовательности тяжелых цепей антител по данному изобретению, выделенные из людей, а также гуманизированных 131-2G, включая вариабельную область, D- и J-области присоединения, каркас (FR) и определяющие комплементарность области (CDR). Все перечисленные антитела иммунореактивны по отношению к G-белку от обоих штаммов A и B, за исключением антитела 3F9, которое иммунореактивно только по отношению к G-белку штамма A. На фигуре 5B показана аналогичная информация по последовательностям легких цепей этих антител. Прочерки в распечатках последовательностей представляют собой поправки выравнивания в последовательностях генов различной длины.

PCR-фрагменты, описанные выше, расщепляли и клонировали в индивидуальные векторы экспрессии, содержащие константную область человеческой 1, или человеческой , или , для in vitro продукции антител в клетках млекопитающих. Векторы экспрессии, кодирующие тяжелые и легкие цепи, совместно трансфицировали в клеточную линию 293 (человеческой почки) (Invitrogen). Экспрессирующие плазмиды интродуцировали с использованием катионного трансфекционного реагента на липидной основе (293fectin ; Invitrogen). Для каждой реакции трансфекции 20 мкг очищенной плазмиды и 40 мкл 293fectin смешивали с 1 мл Opti-MEM^® (Invitrogen) и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре, прежде чем объединить и дать комплексам образоваться в течение 20 мин при комнатной температуре. Комплексы ДНК-293fectin добавляли к 3×10⁶ клеток, посеянных на 90-мм чашки Петри, и инкубировали при 37°C, 8% CO₂. Во время завершающей процедуры через 72 часа после трансфекции супернатант собирали путем центрифугирования (3000g, 15 мин при 4°C) для выделения секретируемых антител.

Пример 4

Картирование эпитопов антител по данному изобретению и определение аффинности

Применяя методику, описанную в примере 1 по картированию эпитопа антитела-прототипа 131-2G, были определены эпитопы соответствующих антител по данному изобретению. Аффинность антител по данному изобретению определяли с помощью способов, описанных в примере 1 по отношению к mAb 131-2G.

Как отмечается в таблице 1 ниже, трое из антител связывают конформационные эпитопы, то есть они не картируются связыванием перекрывающихся пептидов. Антитела по данному изобретению, которые картируются в специфические последовательности, приведены в таблице. Также приведены константы аффинностей, определенные с помощью стандартных тестов Biacore в отношении рекомбинантных Ga и Gb белков, выраженные в пМ, рассчитанные по измеренным скоростям ассоциации и диссоциации. Данные для двух этих антител показаны на фигуре 6. На панелях A, B и C показаны обязательные данные по связыванию для 3G12, а на панелях D, E и F показаны данные для 3D3. В верхнем ряду показана загрузка биосенсорного чипа антителами, в среднем ряду показан сигнал, получаемый при протекании белка Ga через чип с последующей промывкой буфером, а в нижнем ряду показано то же самое для белка Gb. Увеличение сигнала позволяет рассчитать скорость ассоциации, тогда как уменьшение во время снижения позволяет рассчитать скорость диссоциации. Отношение скорости ассоциации к скорости диссоциации представляет собой константу аффинности, Kd.

Таблица 1
Антитело	Химическая активность	Эпитоп, положение	Эпитоп, последовательность	KDxGa (пМ)	KDxGb (пМ)
1F12	Ga/Gb	166-172	EVFNFVP
3G12	Ga/Gb	167-176	VFNFVPCSIC	579	173

1A5	Ga/Gb	161-170	*HFEVF
3D3	Ga/Gb	164-172	FEVFNF	1,1	3
1G1	Ga/Gb	Конформационные
2B11	Ga/Gb	162-172	DFHFEVFNFVP	9	1,6
5D8	Ga/Gb	160-169	NNDFHFEVFN	4390	1
2D10	Ga/Gb	Конформационные
3F9	Ga	Только Ga
1D4	Ga/Gb		FEVFNFV	230	52
1G8	Ga/Gb	165-169	NDFHFEVFNF	24	141
6A12	Ga/Gb	Конформационные
10C6	Ga/Gb	164-169	*HFEVF	55	378
* тот же эпитоп, что и у 131-2G

Пример 5

Сравнение связывания с G-белком со связыванием с вирионами

На фигуре 7 показаны результаты анализа ELISA с использованием живого вируса и оценки связывания с помощью стандартного анализа пероксидазы хрена. Вирусные препараты из различных источников использовали для покрытия планшет при 10 ⁵ БОЕ/лунку или в более высоких концентрациях в карбонатном буфере при рН 9,6 в течение ночи при 4°C. Планшеты блокировали в 5% молоке с PBST в течение часа при комнатной температуре. Серийные разведения антител добавляли в лунки в блокирующем буфере на один час при комнатной температуре. Для детекции добавляли конъюгат Fc -HRP козы против человека (Jackson Immuno.) в разведении 1:2000 в блокирующем буфере на один час при комнатной температуре. Планшеты обильно промывали в PBST. Оборот субстрата TMB измеряли при 450 нм. Как показано на фигуре 7, 3D3 также хорошо связывают живой вирус, как это делают ряд других антител по данному изобретению. Антитело Synagis^®, аффинность которого значительно слабее, показывает слабое связывание с живым вирусом, даже при антительной нагрузке 10⁴ нг/мл. На фигуре 8 показана взаимозависимость связывания с рекомбинантным белком по сравнению со связыванием с вирусными частицами.

Фигуры 9A и 9B представляют собой графики, которые демонстрируют сравнительные способности антител по данному изобретению связываться со штаммами A2 по сравнению со штаммами A5, с помощью описанного выше анализа. На фигуре 9 показано, что 3D3 и 3G12 хорошо связываются со штаммом A2 по сравнению с Synagis^®. PAB является коммерческим поликлональным антителом козы против всех белков RSV (Chemicon, каталожный № AB1128).

На фигуре 9B показано, что эти антитела также связывают штамм A5; следует отметить, что единицы на оси Х здесь и на фигуре 9A отличаются. Аналогичные эксперименты показали, что антитела по данному изобретению связываются с большим разнообразием клинических изолятов.

Пример 6

Тесты на нейтрализацию

Способность отдельных антител по данному изобретению нейтрализовывать вирус in vitro найдена в стандартном анализе бляшкообразования. HEp2 клетки высевали в 12-луночных планшетах при 2×10 ⁵ клеток/лунку. На другой день в средах создавали серийные разведения антител. Около 200 БОЕ/лунку RSV добавляли к антителам в присутствии комплементированной сыворотки крови кролика в течение одного часа при комнатной температуре. Затем антительно-вирусную смесь добавляли к клеткам HEp2 при 200 мкл/лунку в течение 2 часов при комнатной температуре, чтобы обеспечить инфекцию. Вслед за периодом инфекции среды удаляли и среды, содержащие 1% метилцеллюлозу, добавляли во все лунки. Планшеты инкубировали при 35°С в течение 6 дней, после чего клетки фиксировали и окрашивали для определения числа бляшек, а именно: метилцеллюлозу удаляли из клеточных слоев и клетки фиксировали в 100% метаноле в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшеты промывали 3×5% молоком в PBS. Первичные антитела добавляли при 1:500 разведении (поликлональные антитела козы против RSV (Chemicon, каталожный № AB1128)) в PBS + 5% молочный белок на 1 час. Планшеты промывали снова трижды в 5% молоке в PBS. Вторичные антитела добавляли в 1:500 разведении в 5% молочном белке в PBS (ImmunoPure антитела кролика против IgG (H+L) козы, конъюгированные с пероксидазой) (Thermo Scientific, каталожный № 31402) в течение 1 часа. Планшеты промывают трижды однократным PBS. Бляшки визуализировали, добавляя одностадийный хлорнафтольный субстрат (Pierce, каталожный № 34012), 200 мкл на каждую лунку по 10 мин. Планшеты промывали водой и оставляли высохнуть на открытом воздухе. Бляшки пересчитывали в каждой лунке.

На фигуре 10 показаны результаты в виде абсолютного числа бляшек на мкг человеческих антител, и антитело Synagis^® входит в результаты. Эти данные показывают, что из протестированных антител 3D3 является наиболее эффективным. У 3G12 IC₅₀ составляет около 15 нг/мл или аффинность около 100 пМ в соответствии с этим анализом, в то время как у коммерческих антител Synagis^® IC₅₀ составляет около 300 нг/мл, что соответствует аффинности около 2 нМ. Кроме того, было установлено, что Synagis ^® и анти-G антитела по данному изобретению не давали синергетического эффекта в этих условиях.

На фигуре 11 показана вируснейтрализующая активность антител 3G12 по отношению к штамму B по сравнению с Synagis^® . Нормированные данные (в % от контроля) основаны на абсолютном числе бляшек 160-180 в эксперименте. Антитела по данному изобретению с in vitro аффинностями от 1 пМ до 5 нМ (табл. 1) имели значения EC₅₀ между 10-100 нг/мл.

Пример 7

Анти-G профилактика у мышей

Антитела по данному изобретению, Synagis ^® и IgG1 человека, проверяли на их способность предотвращать RSV инфекцию у мышей. В день -1 до инфекции мышам в контрольной группе вводили интраперитонеально среду и PBS. В экспериментальных группах инъекции составляли 0,15, 1,5 и 15 мг/кг антител hIgG1 (неиммунный изотипический контроль), либо 3G12, либо 3D3, либо Synagis^®. Это составляет около 3 мкг, 30 мкг и 300 мкг на мышь.

В день 0 мышам инокулировали 1×10⁶ БОЕ «длинного» штамма RSV путем интраназального введения. В дни 0 и 5 легкие, бронхоальвеолярные выделения (BAL) и сыворотку крови собирали и определяли массу тела, вес легких, БОЕ в срезе доли легкого, вирусную нагрузку (с помощью qPCR), гистологию легких, суммарные лейкоциты, клеточную сортировку с активацией флуоресценции и IFN в BAL.

На фигуре 12 показаны результаты, основанные на вирусной нагрузке легких с помощью анализа бляшкообразования из предыдущего списка. Данные на фигуре 12 показывают, что 3G12 и 3D3 столь же эффективны, как Synagis^®, в этом анализе. (Типичная человеческая доза Synagis^® составляет 15 мг/кг для человека.)

Пример 8

Терапевтическая эффективность антител против RSV-Ga/Gb

Показано, что антитела против консервативного мотива у RSV-G обладают терапевтической эффективностью. Мышей инфицировали в день 0 интраназально, 10⁶ БОЕ от RSV, затем в день 3 обрабатывали 3 мг/кг антител, вводимых интраперитонеально, и в дни 5 и 7 анализировали на вирусную нагрузку в бронхоальвеолярных выделениях. В этой модели инфекция естественным образом очищается гораздо легче, чем у людей. Тем не менее, обработка антителами приводит к ускорению элиминации вируса дозозависимым образом по сравнению с контрольным антителом, которое не связывает RSV (фигура 13A). Каждая экспериментальная группа состояла из 5 животных, и результаты были статистически значимыми.

Как описано в WO 00/43040, антитела против субстанции P полезны в борьбе с воспалением легких, вызванным RSV, животной модели продолжительных осложнений, которые являются клинически важной особенностью инфекции RSV. Повышающая регуляция субстанции P зависит от активного G-белка (Haynes, L. M., et al., J. Virol. (2003) 77:9831-9844). Также отмечалось сокращение масштаба воспаления легких после введения антител по данному изобретению, в том числе уменьшение воспалительных NK и суммарных PMN клеток (фигура 13B), а также сокращение цитокинов, например, IFN (фигура 13C).

В дополнительном тесте в день 0 мышам инокулировали 10⁶ БОЕ RSV «длинного» штамма типа A путем интраназального введения.

На 3-й день различные группы по 4-5 мышей обрабатывали следующим образом:

Группа 1: контрольная группа, которая не получала инфекции в день 0 и которую обрабатывали PBS.

Группа 2: отрицательный контроль, который получил инокуляцию RSV в день 0 и обработку PBS в день 3.

Группа 3: RSV инокуляция в день 0 и антитела Synagis^® интраперитонеально в физиологическом растворе в количествах 1, 10 или 100 мкг на мышь либо 0,05, 0,5 или 5 мг/кг.

Группа 4: RSV инокуляция в день 0 и введение mAb 3D3 по тому же протоколу, что и группе 3.

Группа 5: получили RSV инокуляцию в день 0 и введение 3G12 в тех же количествах, что и группы 3 и 4.

Легкие и жидкие выделения BAL были собраны в дни 0, 3, 5, 7 и 10. Кроме того, определяли массу тела, вес легких, БОЕ в долях легких, вирусную нагрузку с помощью qPCR, гистологию легких, суммарные лейкоциты, клеточную сортировку с активацией флуоресценции, равно как и IFN в BAL. Результаты qPCR в группах, которым введены по 10 мкг mAb, показаны на фигуре 14.

Как видно, вирусный титр у обработанных и необработанных Synagis^® мышей ведет себя аналогичным образом при этих относительно низких дозах антител, в то время как обработанные и 3D3, и 3G12 мыши имели значительно более низкие титры на пике инфекции в день 5. Этот эксперимент подтверждает, что более высокая аффинность in vitro коррелирует с более высокой активностью in vivo.

На фигуре 15 показана кривая зависимости «доза-эффект», демонстрирующая, что 3G12 и 3D3 способны снизить количество копий RSV, что определено с помощью qPCR в день 7 при более низких концентрациях, чем Synagis^® . 3D3 было особенно активным, опять в соответствии с тем, что их аффинность in vitro выше.

Аналогичным образом, когда вирусные счета при qPCR измеряли в день 10, хотя вирусные титры на данных сроках в природе очень низки за счет естественной элиминации вируса с помощью иммунной системы мыши, 3D3 примерно в 100 раз более активны, чем Synagis^® при различных концентрациях дозы, как показано на фигуре 16. Этот опыт подчеркивает пригодность высокоаффинных антител, которые продолжают быть эффективными даже тогда, когда концентрации антигена падают. Течение заболевания у человека значительно более продолжительно, чем у мышей, что обеспечивает явный стимул использования антител, которые продолжают нейтрализовывать вирус в течение более продолжительного времени.

В еще дальнейших экспериментах мышей обрабатывали анти-G mAb мыши или анти-F mAb мыши в группах по четыре особи, каждый эксперимент повторяли три раза. Мышей иммунизировали в день 0 и обрабатывали антителами в день 3, а различные проявления эффективности отмечали в дни 3, 5 и 7.

В качестве одного показателя эффективности измеряли количество воспалительных клеток в бронхоальвеолярных выделениях (BAL) в трех группах, результаты чего показаны на фигуре 17. Число BAL клеток в пересчете на легкое нанесено на оси Y от 0 до 140·10³. Результаты показывают, что анти-F mAb снижают число BAL клеток в легких на 5-й день по сравнению с изотипическими контрольными неиммунными антителами, в то время как анти-G mAb снижают число BAL клеток значительно сильнее. На 7 сутки инфекция проходила.

На фигурах 18A и 18B показано сравнение эффективности анти-G mAb (131-2G мыши) по сравнению с анти-G F(ab') ₂, полученных из этого антитела пепсинолизом и удалением Fc фрагментов с помощью иммобилизованного белка А. Было показано, что комплемент имеет важное значение для противовирусного эффекта анти-G антител in vitro. Это подтверждается фигурой 18A, где противовирусный эффект измеряется в БОЕ/г легочной ткани. Анализы проводили, как указано в примере 6. F(ab')₂ фрагмент анти-G антител, у которого отсутствует Fc область IgG, необходимая для комплемент-опосредованной активности, несколько лучше, чем контроль, для снижения вирусной нагрузки, в то время как анти-G mAb очень эффективны. Однако когда в качестве меры результатов используется воспаление, как показано на фигуре 18B, F(ab')₂ фрагмент анти-G mAb является столь же эффективным, как и целое антитело. Этот эксперимент предусматривает, что нейтрализация G-белка имеет решающее значение для снижения воспаления дыхательных путей. Поскольку вирус активно секретирует растворимую форму G-белка и высокоаффинное связывание важно для нейтрализации растворимых факторов, высокоаффинные антитела по данному изобретению должны иметь особую полезность для противовоспалительного эффекта.

На фигурах 19A, B и C показан эффект анти-G mAb на продукцию IFN в BAL в зависимости от времени введения, при этом цитокины выступают в качестве маркера воспаления дыхательных путей. Контрольные неиммунные антитела во всех случаях не могли уменьшить рост продукции IFN , который сопровождает воспаление дыхательных путей. Однако, независимо от того, вводят ли анти-G mAb в день -1 (панель А), в день +3 (панель B) или даже в день 5 (панель C), происходит резкое снижение уровня IFN в день 7. Этот эксперимент определяет полезность антител против центрального консервативного мотива G-белка RSV для лечения воспаления далеко за пределами пика вирусной нагрузки.

Пример 9

Специфичность эндогенных антител у инфицированных субъектов

Образцы сыворотки от 4 пожилых взрослых с тяжелой формой связанного с RSV заболевания и от шести пожилых взрослых с умеренной формой связанного с RSV заболевания были проверены на иммунореактивность с синтетическим пептидом:

(показаны дисульфидные мостики)

который представляет собой консервативную область G-белка штамма А2 RSV. Анализ проводили с использованием протокола ELISA, описанного в примере 5. Уровни антител, иммунореактивных по отношению к этому пептиду, коррелируют с тяжестью заболевания, при котором субъекты с легкими формами заболевания показывают значительно более высокие титры, чем субъекты с более тяжелыми проявлениями инфекции (см. фигуру 20). Эти результаты показывают, что антитела, иммунореактивные по отношению к этой области G-белка, являются эффективными в смягчении инфекции.