композиция для белкового фармацевтического препарата без добавления человеческого сывороточного альбумина (hsa)

Формула изобретения

1. Композиция для стабилизации белковых агентов в фармацевтических препаратах, не содержащая человеческий сывороточный альбумин и содержащая следующие компоненты:

а) поверхностно-активное вещество, и

б) смесь двух аминокислот, представляющих собой аспарагиновую кислоту (Asp) и аспарагин (Asn),

где поверхностно-активное вещество представляет собой неионный детергент,

где концентрация отдельных аминокислот в каждом случае составляет 50 мМ.

2. Композиция по п.1, дополнительно содержащая по меньшей мере один из следующих компонентов:

в) дисахарид, предпочтительно сахарозу (тростниковый сахар), трегалозу или лактозу,

г) этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) предпочтительно в форме одной из ее солей, такой как Na ₄-ЭДТА.

3. Композиция по п.2, где дисахарид представляет собой сахарозу (тростниковый сахар), трегалозу или лактозу.

4. Композиция по п.1, содержащая компоненты (а), (б) и (в), компоненты (а), (б) и (г) или компоненты (а), (б), (в) и (г).

5. Композиция по п.1, где указанная композиция либо растворима в водных средах, либо представлена в виде водного раствора.

6. Композиция по любому из пп.1-5, дополнительно содержащая глутаминовую кислоту.

7. Композиция по п.6, где концентрации отдельных аминокислот в каждом случае составляют 50 мМ.

8. Композиция по п.7, где неионный детергент представляет собой полисорбат 80.

9. Композиция по п.7 или 8, где дисахарид представляет собой сахарозу (тростниковый сахар).

10. Композиция по п.9, где pH композиции в растворе составляет 6,5.

11. Композиция по любому из пп.1-5, дополнительно содержащая глутаминовую кислоту и глутамин.

12. Композиция по п.11, где неионный детергент представляет собой полисорбат, такой как полисорбат 20 или полисорбат 80, или полоксамер, такой как полоксамер 184 или 188.

13. Композиция по п.11, где дисахарид представляет собой сахарозу, трегалозу или лактозу.

14. Композиция по п.11, где pH композиции в растворе составляет от 5,0 до 8,5, в частности от 6,0 до 8,0, предпочтительно от 6,0 до 7,0, и 6,5 соответственно.

15. Фармацевтическая композиция, содержащая белковый агент и композицию для стабилизации по любому из пп.1-14, где концентрация отдельных аминокислот в каждом случае составляет 50 мМ.

16. Фармацевтическая композиция по п.15, где указанная фармацевтическая композиция присутствует в виде порошка сублимационной или вакуумной сушки, который растворим в водных средах.

17. Фармацевтическая композиция по п.15, где указанный белковый агент представляет собой коагулирующий фактор, такой как фактор VIII (антигемофильный глобулин), цитокин, такой как интерферон, в частности интерферон-альфа, -бета или -гамма, фермент, такой как урокиназа или стрептокиназа, активатор плазминогена или чистый, свободный от белков комплекса нейротоксин и нейротоксиновый комплекс, соответственно, из Clostridium botulinum, в частности из Clostridium botulinum типа А или В.

18. Фармацевтическая композиция по любому из пп.15-17, дополнительно содержащая глутаминовую кислоту.

19. Фармацевтическая композиция по п.18, где концентрации индивидуальных аминокислот составляют в каждом случае 50 мМ.

20. Фармацевтическая композиция по п.19, где неионный детергент представляет собой Полисорбат 80.

21. Фармацевтическая композиция по п.19 или 20, где дисахарид представляет собой сахарозу (тростниковый сахар).

22. Фармацевтическая композиция по п.21, где pH композиции в растворе имеет значение 6,5.

23. Фармацевтическая композиция по п.15, где

а) поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20,

б) аминокислоты Asp и Asn присутствуют в концентрации 50 мМ,

в) дисахарид представляет собой сахарозу (тростниковый сахар), и

г) pH имеет значение 7,5.

24. Фармацевтическая композиция по п.15 или 16, дополнительно содержащая глутаминовую кислоту и глутамин.

25. Фармацевтическая композиция по п.24, где указанный неионный детергент представляет собой полисорбат, такой как полисорбат 20 или полисорбат 80, или полоксамер, такой как полоксамер 184 или 188.

26. Фармацевтическая композиция по п.24, где указанный дисахарид представляет собой сахарозу, трегалозу или лактозу.

27. Фармацевтическая композиция по п.24, где pH указанной композиции в растворе имеет значение от 5,0 до 8,5, в частности от 6,0 до 8,0, предпочтительно от 6,0 до 7,0, и 6,5 соответственно.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к композиции, состоящей из низкомолекулярных непептидных веществ, которая стабилизирует белковые агенты, изготавливаемые в виде фармацевтических препаратов, и которая в силу этого позволяет отказаться от применения HSA. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит помимо указанного белкового агента также композицию, состоящую из низко молекулярных непептидных веществ.

Развитие методов генной инженерии дает множество новых фармацевтических препаратов, агенты которых представляют собой белки. По сравнению с традиционными фармацевтическими препаратами, агенты которых состоят из низкомолекулярных веществ, высокомолекулярные белки проявляют высокую эффективность при низких количествах вещества и поэтому используются в очень низких концентрациях и, соответственно, дозах.

При таких низких концентрациях и, соответственно, дозах производители фармацевтических препаратов сталкиваются с проблемой. А именно, белки обладают способностью прилипать к твердым поверхностям. Вследствие этой адсорбции большая часть внесенного белкового агента может быть потеряна. Конечно, указанный эффект в силу этого тем значительнее, чем ниже концентрация белка, который должен быть использован. В отсутствие подходящего препарата указанный белковый агент может быть даже полностью потерян.

Другая проблема указанных фармацевтических препаратов и, соответственно, белковых агентов состоит в высокой нестабильности белков. Например, они могут легко подвергаться окислению (остатки цистеина, остатки метионина) и дезаминированию (аспарагин), соответственно, или они могут быть расщеплены на фрагменты и могут агрегировать в комплексы более высокого порядка, соответственно. В эффективных препаратах следует избегать таких потерь белкового агента и обеспечивать стабильный продукт.

Так как связывание белков на поверхностях является неспецифическим, потерю агента можно предотвратить путем добавления в большом избытке другого (неспецифического) белка. Так как этот дополнительный белок предпочтительно вообще не должен обладать никакой фармакологической активностью и также не должен стимулировать продуцирование антител, в настоящее время для этих целей применяют человеческий сывороточный альбумин (HSA), который к тому же может быть приобретен по низким ценам, так как его используют в больших количествах в качестве заменителя плазмы. Так, в настоящее время в продаже имеется несколько фармацевтических препаратов (различных интерферонов, ростовых факторов, коагулирующих факторов, ботулинических токсинов и вакцин), которые содержат HSA в качестве стабилизатора.

HSA представляет собой продукт, получаемый из крови человека, который, соответственно, может быть контаминирован (например, вирусами), несмотря на обязательную проверку, и который может обуславливать передачу заболевания реципиенту фармацевтического препарата, содержащего HSA (особенно когда время от времени появляются (могут появляться) новые патогены, которые не могут быть своевременно зарегистрированы с помощью анализов). Поэтому органы, ответственные за одобрение фармацевтических препаратов, настаивают заменять HSA во вновь одобряемых фармацевтических препаратах. По этой причине HSA не следует использовать в составе фармацевтических препаратов при условии, что он может быть заменен другими веществами.

По различным причинам человеческий сывороточный альбумин (HSA) является особенно полезным в композициях с белковым агентом. Он является белком и поэтому может ингибировать и, соответственно, нейтрализовать все неспецифические реакции на белковом агенте. Это особенно касается реакций на границах раздела (жидкость-твердое тело, жидкость-газ), которые могут приводить к денатурации указанного агента (Henson et al. (1970), Colloid Interface Sci 32, 162-165). Присутствие HSA защищает от денатурации. Кроме того, белки обладают сродством к поверхностям, с которыми они неспецифически связываются путем гидрофобных взаимодействий (Norde W. (1995) Cells Mater 5, 97-112). Сайты связывания на поверхностях могут быть насыщены с помощью избыточного количества HAS, так чтобы белковый агент оставался в растворе, что является в особенности обязательным, когда доза белкового агента является слишком низкой.

Более того, присутствие HSA защищает от денатурирующих процессов во время заполнения и, возможно, лиофилизации, а также во время хранения фармацевтического препарата (например, от процессов окислительной деградации или от дезаминирования аспарагина).

Белок, защищающий таким способом указанный агент, не должен, естественно, проявлять никакой собственной фармакологической активности, необходимое условие, которому удовлетворяет HSA. HSA, являющийся белком человека, не должен быть антигеном, то есть не должен стимулировать выработку антител. Однако, так как HSA получают из крови и очищают физико-химическими методами, невозможно абсолютно исключить, что во время процесса очистки возникнут неоэпитопы, под которыми подразумевают новые антигенные структуры, к которым реципиент смеси HSA и белкового агента вырабатывает антитела. Это может приводить к нежелательным побочным реакциям. Вследствие возможных побочных реакций использование различных белков и, соответственно, смеси олигопептидов является нежелательным.

В принципе, желатин также можно рассматривать в качестве стабилизатора. Он представляет собой белок животного происхождения, который вызывает иммунологические реакции и который также может быть носителем патогенных агентов.

Применение HSA и, соответственно, другого подходящего стабилизатора белкового агента является также особенно важным для фармацевтических препаратов, которые содержат белковые агенты, которые вводят в очень низких дозах, так как белки являются крайне нестабильными, в частности при низких концентрациях, и, более того, сразу же связываются с доступными неспецифическими сайтами связывания. В результате, они утрачиваются для терапевтического использования. В качестве примеров белкового агента, который применяют в очень низких дозах, следует отметить нейротоксины Clostridium botulinum. Эти высокоактивные белки являются активными в наименьших количествах (из всех разработанных к настоящему времени фармацевтических препаратов они и, соответственно, нейротоксин Clostridium botulinum типа А, представляют собой препарат, который вводят в наименьших дозах (500 пг/ампулу)). Такое очень низкое количество белка теряется, если не использовать защищающий агент.

Из предшествующего уровня техники, где HSA описывают главным образом в качестве такого защищающего агента, можно заключить, что существует потребность в том, чтобы предложить альтернативы HSA в качестве стабилизатора белковых агентов в фармацевтических препаратах. В соответствии с этим авторы настоящего изобретения поставили задачу разработать композицию, защищающую/стабилизирующую белковые агенты в фармацевтических препаратах, которая по меньшей мере не хуже, чем HSA.

Поставленную задачу авторы настоящего изобретения решили путем разработки композиции, состоящей из низкомолекулярных непептидных веществ, которая стабилизирует белковые агенты, изготавливаемые в виде фармацевтических препаратов, и которая таким образом позволяет отказаться от использования HSA. Эта композиция названа композицией для стабилизации, как указано ниже.

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к композиции, свободной от чужеродного белка, которая может быть изготовлена в виде фармацевтических препаратов с белковыми агентами. Указанная композиция для стабилизации предпочтительно основана на низкомолекулярных веществах, которые произведены в соответствии с Европейской Фармакопеей (Ph. Eur.) и которые одобрены в качестве фармацевтических адъювантов. В частности, указанная композиция позволяет отказаться от HSA и обеспечивает не только стабильное хранение белковых агентов и, соответственно, фармацевтического препарата без потерь агента, но также устраняет риск того, что введенный соответствующий фармацевтический препарат контаминирован инфекционными агентами. Неожиданно оказалось, что такие низкомолекулярные и «простые» вещества как те, которые применяют согласно настоящему изобретению в композиции для стабилизации, проявляют требуемые характеристики и могут заменять HSA.

В композиции для стабилизации по настоящему изобретению HSA заменяют комбинацией различных низкомолекулярных веществ, не имеющих побочных реакций, которые защищают от потери белкового агента в результате адсорбции на поверхностях, а также в результате процессов денатурации и химического разложения растворенных или лиофилизированных белковых агентов. Более того, указанная композиция для стабилизации предотвращает разложение данного агента при его хранении на протяжении периода времени более 6 месяцев при повышенной температуре.

В композиции для стабилизации по настоящему изобретению представлены компоненты, указанные в пункте 1 формулы изобретения, которые представляют собой:

а) поверхностно-активное вещество, в частности неионный детергент (поверхностно-активное вещество), и

б) смесь по меньшей мере двух аминокислот, где указанные по меньшей мере две аминокислоты представляют собой либо глутаминовую кислоту (Glu) и глутамин (Gln), либо аспарагиновую кислоту (Asp) и аспарагин (Asn).

Согласно другому предпочтительному воплощению композиция для стабилизации по настоящему изобретению содержит один или более чем один из следующих дополнительных компонентов:

в) дисахарид, предпочтительно сахарозу (тростниковый сахар), трегалозу или лактозу,

г) этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), предпочтительно в форме одной из ее солей, такой как Na₄-ЭДТА.

Предпочтительные композиции для стабилизации по настоящему изобретению содержат либо компоненты (а), (б) и (в), либо компоненты (а), (б) и (г), либо компоненты (а), (б), (в) и (г). Все указанные предпочтительные композиции либо растворимы в водных средах, либо представлены в виде водных растворов.

Предпочтительно, чтобы все вещества, применяемые в указанной композиции для стабилизации, были одобрены как адъюванты для фармацевтических препаратов и, таким образом, были тщательно проверены в токсикологическом отношении, что означает, что они могут быть смешаны с композицией для стабилизации по настоящему изобретению без дополнительных проверок. Неожиданно оказалось, что в точности определенное объединение этих простых веществ привело к проявлению требуемых характеристик, а именно обеспечило стабильную, свободную от сывороточного альбумина композицию для белковых агентов.

Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей белковый агент и вышеупомянутую композицию для стабилизации, содержащую компоненты (а) и (б), или одну из вышеупомянутых предпочтительных композиций для стабилизации.

Указанный агент и, соответственно, указанный белковый агент готовят предпочтительно в водном растворе (растворяют), который содержит компоненты (а) и (б) и возможно также (в) и/или (г). Затем указанный раствор может быть лиофилизирован. Если указанный раствор действительно должен быть лиофилизирован, предварительное добавление компонента (в) является особенно предпочтительным. После лиофилизации фармацевтическая композиция находится в виде порошка, который может быть разведен (предпочтительно водой для инъекционных целей (WFI)).

Соответственно, фармацевтическая композиция предпочтительно находится в форме порошка сублимационной или вакуумной сушки, растворимого в водных средах. Перед терапевтическим применением указанная лиофилизированная композиция и, соответственно, указанный порошок предпочтительно разводят водой для инъекционных целей (WFI). Указанная фармацевтическая композиция, тем не менее, может находиться также в жидкой форме, предпочтительно в виде водного раствора.

Предпочтительные фармацевтические композиции по настоящему изобретению наряду с вышеупомянутыми компонентами (а) и (б) содержат в качестве белка коагулирующий фактор, такой как фактор VIII (антигемофильный глобулин), цитокин, такой как интерферон, в частности такой как интерферон альфа, бета или гамма, фермент, такой как урокиназа или стрептокиназа, активатор плазминогена или сверхчистый нейротоксин (определение «сверхчистого нейротоксина» смотри ниже) и, соответственно, нейротоксиновый комплекс из Clostridium botulinum, в частности из Clostridium botutinum типов А, В, С, D, Е, F или G. Поскольку клостридиальные токсины изготавливают в фармацевтических препаратах в наименьших количествах, в частности их сверхчистую форму, они являются предпочтительными белками. Особенно предпочтительными являются сверхчистые нейротоксины типа А и В.

Другие предпочтительные фармацевтические композиции по настоящему изобретению дополнительно содержат, помимо вышеупомянутых компонентов (а) и (б) и указанного агента, определенный выше компонент (в), определенный выше компонент (г) или два этих компонента вместе.

В обеих композициях по настоящему изобретению присутствуют по меньшей мере две аминокислоты: (1) аспарагиновая кислота и аспарагин или (2) глутаминовая кислота и глутамин. Однако предпочтительно указанные композиции содержат по меньшей мере три (аспарагиновую кислоту, аспарагин, глутаминовую кислоту; аспарагиновую кислоту, аспарагин, глутамин; аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, глутамин; аспарагин, глутаминовую кислоту, глутамин) из этих четырех аминокислот или даже все четыре (аспарагиновую кислоту, аспарагин, глутаминовую кислоту и глутамин). Предпочтительно отдельные аминокислоты применяют в концентрациях от 20 до 200 мМ, предпочтительно от 20 до 100 мМ, в частности 50 мМ. Это соответствует, в случае заполнения 0,5 мл исходного раствора, количеству от 1,3 мг до 14,7 мг и от 1,3 мг до 7,4 мг, соответственно, предпочтительно приблизительно 3,7 мг на аминокислоту в порошке после сушки.

В другом предпочтительном воплощении обоих композиций по настоящему изобретению указанное поверхностно-активное вещество (tenside) представляет собой неионный детергент, предпочтительно полисорбат (такой как полисорбат 20 или полисорбат 80) или полоксамер (такой как полоксамер 184 или полоксамер 188). Если фармацевтическая композиция находится в жидкой форме, доля полисорбата предпочтительно составляет от 0,01 до 0,5% по массе, предпочтительно составляет 0,2% по массе. Это соответствует количеству полисорбата от 0,05 до 2,5 мг, предпочтительно 1 мг, например, после процесса лиофилизации 0,5 мл исходного раствора.

В другом предпочтительном воплощении обеих композиций по настоящему изобретению указанный дисахарид представляет собой сахарозу, трегалозу или лактозу. Сахароза является особенно предпочтительной. Если фармацевтическая композиция по настоящему изобретению предложена в виде раствора, указанный раствор содержит предпочтительно от 2 до 10% по массе, более предпочтительно 5% по массе, указанного дисахарида, в частности сахарозы.

Как уже описано, применение компонента (г), комплексообразующего вещества (хелатирующего агента), проявляющего дополнительный стабилизирующий эффект, является дополнительно предпочтительным. Предпочтительно, чтобы концентрация этилендиаминтетрауксусной кислоты в исходном растворе фармацевтической композиции составляла от 0,1 до 1,0 мМ, в частности 5 мМ.

Предпочтительно, оба типа композиций по настоящему изобретению имеют значение pH от 5,0 до 8,5, более предпочтительное значение pH от 6,0 до 8,0, в частности от 6,0 до 7,0 и, соответственно, 6,5. Если необходимо и желательно, значение pH возможно подводят, соответственно, с помощью NaOH.

Уже упомянутые в начале нейротоксины Clostridium botulinum, в частности нейротоксины Clostridium botulinum типа А и В, должны быть изготовлены в виде препаратов для фармацевтических назначений в очень низких дозах. Соответственно, качество композиции для стабилизации по настоящему изобретению может быть проконтролировано особенно тщательно по этому агенту, который является чрезвычайно сложным в обращении. Другие белковые агенты изготавливают в виде препаратов в значительно более высоких количествах; поэтому HSA может быть легко заменен композициями для стабилизации по настоящему изобретению.

Токсин Clostridium botulinum типа А (товарный знак Botox , Allergan; Dysport , Ipsen) в течение многих лет применялся для лечения различных форм дистоний (например, блефароспазмов, кривошеи), спастических состояний мышц, для лечения гипергидроза, а также в косметической области для удаления морщин лица. Данный агент является белковым комплексом, который синтезируют анаэробно растущие бактерии (Clostridium botulinum). Активный агент этого белкового комплекса представляет собой белок с молекулярной массой 150 кД, ботулинический нейротоксин (BoNT). Указанный токсин и, соответственно, нейротоксин действует на концевую пластинку двигательного нерва и ингибирует передачу нервного импульса мышце и поэтому приводит к параличу данной мышцы. Этот механизм действия позволяет применять указанный нейротоксин при заболеваниях, в которых передача сигнала возбуждения патологически изменена, то есть имеет место повышенное высвобождение ацетилхолина.

Все ботулинические токсины и, соответственно, нейротоксины, продаваемые в настоящее время, основаны на токсиновом комплексе из Cfostridium botulinum, то есть нейротоксине. По существу, активная молекула внедрена в ансамбль белков с разными молекулярными массами; эти белки представляют собой различные гемагглютинины (15 кД, 19 кД, 35 кД, 52 кД), а также нетоксический негемагглютинирующий белок (NTNH, 120 кД). Без этих так называемых защитных белков выделенный нейротоксин является очень нестабильным и легко разлагается протеазами. Поэтому защитные белки и, соответственно, белки, образующие комплекс, являются несущественными для функционирования нервной клетки, но играют некоторую роль в стабилизации чувствительного нейротоксина. С другой стороны, имеются указания на то, что эти белки, образующие комплекс, могут оказывать влияние на иммуностимулирующую функцию, которая может быть ответственной за продуцирование антител у 5-10% пациентов, что неизбежно приводит к прекращению терапии этим типом нейротоксина («вторичный нереспондер»). Кроме того, следует принимать во внимание, что пациенты испытывают нагрузку чужеродным белком (белками, образующими комплекс), которые фармакологически не являются абсолютно необходимыми. Поэтому имеет смысл применять в качестве агента чистый, свободный от белков комплекса нейротоксин, но из-за его низкой дозы и лабильности это требует особо эффективной композиции.

Таким образом, необходимым условием для применения в качестве агента в фармацевтическом препарате нейротоксина, свободного от белков комплекса (нейротоксин, свободный от белков комплекса, иногда называют также сверхчистым нейротоксином), являлась разработка фармацевтической композиции, которая обеспечивает стабильность биологической функции указанного сверхчистого нейротоксина в течение более длительного периода времени. Указанному необходимому условию соответствует изготовленная авторами изобретения композиция для стабилизации по настоящему изобретению.

Два фармацевтических препарата на основе нейротоксина типа А, продаваемые в настоящее время, содержат в качестве необходимого стабилизатора HSA (Botox содержит на 100 единиц агента 0,5 мг HSA и дополнительно 0,9 мг хлорида натрия, тогда как Dysport содержит на 500 единиц агента 0,125 мг HSA и, кроме того, 2,5 мг лактозы). Neurobloc , на основе токсинового комплекса типа В, в случае 2000 единиц состоит из раствора, содержащего 500 мкг/мл HSA, 0,01 М сукцината натрия и 0,1 М хлорида натрия. Как описано выше, HSA, в частности, удовлетворяет задаче предотвращения адсорбции указанного токсина на стенках ампул (стеклянных ампул, шприцов, канюль) и защиты от денатурации. Без сывороточного альбумина (или без веществ, которые заменяют этот эффект) указанный токсин неизбежно будет потерян. Это обусловлено главным образом тем фактом, что количество нейротоксина в указанных фармацевтических препаратах очень мало (Botox содержит 5 нг, Dysport - 20 нг токсинового комплекса на единицу упаковки («ампулу»)). При условии, что не присутствует никакой другой белок, имеющиеся в значительном количестве неспецифические сайты связывания белков заняты токсином. В присутствии большого избытка HSA (более чем 50000-кратного), как в упомянутых фармацевтических препаратах, данные сайты связывания заняты HSA, так что нейротоксиновый комплекс остается в растворе. Вероятность того, что сверхчистый, свободный от комплекса нейротоксин адсорбируется на твердой поверхности контейнера значительно выше, так как количество белка чистого нейротоксина для дозы 100 единиц составляет только 500 пг.

В заявке на патент WO 01/58472 описан препарат для комплекса из Clostridium botulinum типа А, который состоит по существу из гидроксиэтилированного крахмала. Приведены примеры, в которых указанный препарат является стабильным в течение одного года. Никаких исследований со сверхчистым, соответственно свободным от белков комплекса нейротоксином не описано. Однако указано, что «токсиновый белок проявляет заметную нестабильность при удалении гемагглютинирующего белка». Более того, в случае сверхчистого ботулинического токсина отмечено, что «чистый ботулинический токсин является тоже лабильным, но он имеет ограниченное практическое использование при изготовлении фармацевтической композиции». Однако нигде не упомянуто, что описанный препарат на основе гидроксиэтилированного крахмала также является эффективным для стабилизации указанного сверхчистого нейротоксина.

HSA-содержащий препарат сверхчистого нейротоксина описан в патентах США 5512547 и 5756468. В первом патенте описан препарат, содержащий HSA, а также трегалозу и мальтотриозу или родственную сахарозу. Во втором патенте описан препарат, который в дополнение к указанным сахаридам содержит метионин и цистеин. Необходимость применения HSA в препарате для указанного сверхчистого нейротоксина также показана в публикации (Goodenough et al. (1992) AppI Environm Microbiol 58 3426-3428).

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть изготовлена, например, следующим образом: раствор агента (например нейротоксина из Clostridium botulinum) разбавляют композицией для стабилизации (в форме жидкого раствора) до концентрации 1,0-1,2 нг/мл (=200 единиц/мл) и затем стерильно фильтруют 0,5 мл этого раствора заполняют в ампулы, лиофилизируют или сушат в вакууме и хранят до терапевтического применения. Следовательно, одна ампула с лиофилизированной композицией или порошком вакуумной сушки содержит приблизительно 100 единиц указанного нейротоксина. Для введения пациенту указанную лиофилизированную композицию или порошок разбавляют 2-8 мл WFI, в зависимости от показания. Описанная композиция для стабилизации по настоящему изобретению обеспечивает полное восстановление белкового агента (нейротоксина) после разбавления, стерильной фильтрации, заполнения и лиофилизации. Лиофилизированная композиция при 37°С остается стабильной в течение более чем 6 месяцев.

Пример 1

Необходимо было проверить, обеспечивает ли применение композиции для стабилизации по настоящему изобретению более значительное восстановление по сравнению с фосфатным буфером и композицией из фосфатного буфера и полисорбата соответственно.

Все использованные эксципиенты фармацевтического уровня качества получены от производителей. Нейротоксин типа А из Clostridium botulinum может быть приобретен в List Biological Laboratories, Inc. Campell, California, USA и, соответственно, может быть получен согласно DasGupta, B.R. (1984) Toxicon 3, 415-424.

Раствор нейротоксина типа А из Clostridium botulinum (168 мкг/мл) разбавляли композицией для стабилизации по настоящему изобретению до концентрации 0,5 мкг/мл. Концентрация данной композиции составляла 50 мМ в отношении аспарагиновой кислоты, аспарагина, глутаминовой кислоты и глутамина, и она содержала 0,05% по массе полисорбата 20 и имела значение рН 7,5.

Дополнительное разбавление до 1,2 нг/мл ( 200 LD₅₀ (средняя летальная доза, при которой погибает 50%)/мл) осуществляли с помощью различных растворов (см. таблицу 1). После фильтрации через фильтр с размером пор 0,22 мкм, 0,5 мл этих дополнительно разведенных растворов заполняли в стеклянные ампулы (6 R, Munnerstadt) и хранили при 37°С. Данные ампулы герметически закрывали резиновыми пробками. После хранения в течение 15 часов определяли концентрацию нейротоксина в индивидуальных растворах с помощью традиционного специфичного иммуноферментного анализа (EIA).

Таблица 1
Композиция	Концентрация и содержание, соответственно	Восстановление (%)
1. Раствор Фосфат натрия	50 мМ	0
2. Раствор	50 мМ	62,5
Фосфат натрия
Полисорбат 20	0,05% по массе
3. Раствор
Аспарагиновая кислота	50 мМ
Аспарагин	50 мМ	111
Глутаминовая кислота	50 мМ
Глутамин	50 мМ
Полисорбат 20	0,05% по массе
ЭДТА	0,5 мМ

Выбранная композиция приводила к полному восстановлению после инкубации при 37°С.

Пример 2

Необходимо было исследовать, является ли стабильной на протяжении длительного периода времени фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая 200 единиц нейротоксина типа А/мл (1,2 нг/мл).

Из исходного раствора с 0,5 мкг/мл нейротоксина типа А из Clostridium botulinum получали разведение с концентрацией 1,2 нг/мл путем использования перечисленных в таблице 2 композиций согласно примеру 1. После стерильного фильтрования 0,5 мл этих композиций заполняли в ампулы, которые затем герметически закрывали резиновыми пробками. После хранения в течение 15 часов при 4°С и 37°С количество нейротоксина типа А определяли с помощью ELISA (иммуноферментного твердофазного анализа).

После хранения в течение 8 месяцев при 4°С определяли биологическую активность в данных ампулах посредством ex vivo анализа. Так, активность указанных композиций определяли с помощью теста на диафрагме мыши (Wohlfahrt К. etal. (1997) Naunyn-SchmiedebergsArch. Pharmcol. 355, 225-340).

Таблица 2
Композиция	Концентрация и содержание, соответственно	15 часов		Восстановление (%) через 8 месяцев (4°С)
		4°С	37°С
Аспарагиновая кислота	50 мМ	100	21	100
Аспарагин	50 мМ
Глутаминовая кислота	50 мМ
Глутамин	50 мМ
Полисорбат 80	0,05% по массе
Аспарагиновая кислота	50 мМ	12	0	-
Аспарагин	50 мМ
Глутаминовая кислота	50 мМ
Глутамин	50 мМ

Раствор, состоящий из аминокислот Asn, Asp, Gin и Glu (каждая в концентрации 50 мМ) и полисорбата 80, являлся стабильным при 4°С в течение 8 месяцев.

Пример 3

Необходимо было исследовать, какой стабилизирующий эффект проявляют различные смеси аминокислот. Фармацевтические композиции снова доводили до концентрации 1,2 нг нейротоксина типа А из Clostridium botulinum/Mn (200 единиц/мл) (разведения выполняли согласно примеру 1 и с использованием растворов, перечисленных в таблице 3, соответственно) и хранили при 4°С после стерильной фильтрации через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Результаты определения нейротоксина с помощью иммуноферментного анализа показаны в таблице 3.

Таблица 3
Композиция	Концентрация и содержание, соответственно	pH-значение	Восстановление (%)
Аспарагиновая кислота	50 мМ	7,5	65
Аспарагин	50 мМ
ЭДТА	0,5 мМ
Полисорбат 20	0,05% по массе
Сахароза	1% по массе
Глутаминовая кислота	50 мМ	7,5	12
Глутамин	50 мМ
ЭДТА	0,5 мМ
Полисорбат 20	0,05% по массе
Сахароза	1% по массе
Глутаминовая кислота	50 мМ	7,5	10
ЭДТА	0,5 мМ
Полисорбат 20	0,05% по массе
Сахароза	1% по массе
Аспарагиновая кислота	50 мМ	7,5	106
Аспарагин	50 мМ
Глутаминовая кислота	50 мМ
Глутамин	50 мМ
ЭДТА	0,5 мМ
Полисорбат 20	0,05% по массе
Сахароза	1% по массе

Смесь всех четырех аминокислот приводила к полному восстановлению данного агента.

Пример 4

Необходимо было исследовать, при каком значении pH разработанные композиции обеспечивают наиболее значительное восстановление. Приготавливали композицию со значением pH от 6,0 до 8,0 с концентрацией нейротоксина типа А из Clostridium botulinum 1,2 нг/мл и после фильтрации через фильтр с размером пор 0,22 мкм хранили при 37°С. Результаты определения нейротоксина с помощью иммуноферментного анализа показаны в таблице 4.

Таблица 4
Композиция	Концентрация и содержание, соответственно	pH-значение	Восстановление через
			2 суток	9 суток	21 сутки
Аспарагиновая кислота	50 мМ	6,0	100	95	78
Аспарагин	50 мМ
Глутаминовая кислота	50 мМ
Глутамин	50 мМ
ЭДТА	0,5 мМ
Полисорбат 20	0,05% по массе
Сахароза	1% по массе
Аспарагиновая кислота	50 мМ	6,5	100	92	83
Аспарагин	50 мМ
Глутаминовая кислота	50 мМ
Глутамин	50 мМ
ЭДТА	0,5 мМ
Полисорбат 20	0,05% по массе
Сахароза	1% по массе
Аспарагиновая кислота	50 мМ	7,0	100	85	75
Аспарагин	50 мМ
Глутаминовая кислота	50 мМ
Глутамин	50 мМ
ЭДТА	0,5 мМ
Полисорбат 20	0,05% по массе
Сахароза	1% по массе
Аспарагиновая кислота	50 мМ	7,5	100	61	55
Аспарагин	50 мМ
Глутаминовая кислота	50 мМ
Глутамин	50 мМ
ЭДТА	0,5 мМ
Полисорбат 20	0,05% по массе
Сахароза	1% по массе
Аспарагиновая кислота	50 мМ	8,0	85	17	6
Аспарагин	50 мМ
Глутаминовая кислота	50 мМ
Глутамин	50 мМ
ЭДТА	0,5 мМ
Полисорбат 20	0,05% по массе
Сахароза	1% по массе

Наилучшие восстановления были достигнуты при значениях pH от 6,0 до 6,5.

Пример 5

Необходимо было исследовать, при каких концентрациях четырех аминокислот, аспарагиновой кислоты, аспарагина, глутаминовой кислоты и глутамина, достигается наиболее значительное восстановление. Начиная с разбавления нейротоксина типа А из Clostridium botulinum 0,5 мкг/мл, делали дополнительное разбавление до 1,2 мкг/мл и после фильтрации через фильтр с размером пор 0,22 мкм вносили в 6R-ампулы в дозах 0,5 мл на ампулу. После герметизации резиновыми пробками их хранили при 4°С в течение 15 часов и затем определяли количество нейротоксина на ампулу.

Таблица 5а
Композиция	Концентрация и содержание, соответственно	pH-значение	Восстановление (%)
Аспарагиновая кислота	200 мМ
Аспарагин	200 мМ
Глутаминовая кислота	200 мМ
Глутамин	200 мМ	7,5	19
Полисорбат 20	0,01% по массе
ЭДТА	0,5 мМ
Сахароза	5% по массе
Аспарагиновая кислота	100 мМ
Аспарагин	100 мМ
Глутаминовая кислота	100 мМ
Глутамин	100 мМ	7,5	56
Полисорбат 20	0,01% по массе
ЭДТА	0,5 мМ
Сахароза	5% по массе
Аспарагиновая кислота	50 мМ
Аспарагин	50 мМ
Глутаминовая кислота	50 мМ
Глутамин	50 мМ	7,5	93
Полисорбат 20	0,01% по массе
ЭДТА	0,5 мМ
Сахароза	5% по массе

Таблица 5б
Композиция	Концентрация и содержание, соответственно	pH-значение	Восстановление (%)
Аспарагиновая кислота	50 мМ
Аспарагин	50 мМ
Глутаминовая кислота	50 мМ
Глутамин	50 мМ	6,5	79
ЭДТА	0,5 мМ
Полисорбат 20	0,2% по массе
Сахароза	5% по массе
Аспарагиновая кислота	50 мМ
Аспарагин	50 мМ
Глутаминовая кислота	50 мМ
Глутамин	50 мМ	6,5	86
ЭДТА	0,5 мМ
Полисорбат 20	0,2% по массе
Сахароза	5% по массе
Аспарагиновая кислота	20 мМ
Аспарагин	20 мМ
Глутаминовая кислота	20 мМ
Глутамин	20 мМ	6,5	0
ЭДТА	0,5 мМ
Полисорбат 20	0,2% по массе
Сахароза	5% по массе
Аспарагиновая кислота	10 мМ
Аспарагин	10 мМ
Глутаминовая кислота	10 мМ
Глутамин	10 мМ	6,5	0
ЭДТА	0,5 мМ
Полисорбат 20	0,2% по массе
Сахароза	5% по массе

Доказано, что в случае жидкой композиции концентрация аминокислот 50 мМ является эффективной для восстановления агента.

Пример 6

Необходимо было исследовать, какая композиция аминокислот приводит к наиболее значительному восстановлению после лиофилизации, когда в этом подходе не используют ЭДТА. Заполненный раствор (0,5 мл) лиофилизировали и хранили в течение ночи при 4°C. Лиофилизированные композиции разводили в 0,5 мл воды для инъекционных целей. Концентрацию нейротоксина определяли с помощью иммуноферментного анализа.

Таблица 6
Композиция	Концентрация и содержание, соответственно	pH-значение	Восстановление (%) в лиофилизованных композициях
Аспарагиновая кислота	100 мМ	6,5	0
Аспарагин	100 мМ
Сахароза	5% по массе
Полисорбат 80	0,2% по массе
Аспарагиновая кислота	50 мМ	6,5	20
Аспарагин	50 мМ
Сахароза	5% по массе
Полисорбат 20	0,2% по массе
Аспарагиновая кислота	100 мМ	6,5	9,3
Глутаминовая кислота	100 мМ
Аспарагин	100 мМ
Сахароза	5% по массе
Полисорбат 80	0,2% по массе
Аспарагиновая кислота	50 мМ	6,5	56
Глутаминовая кислота	50 мМ
Аспарагин	50 мМ
Сахароза	5% по массе
Полисорбат 80	0,2% по массе
Аспарагиновая кислота	100 мМ	6,5	20
Глутаминовая кислота	100 мМ
Сахароза	5% по массе
Полисорбат 80	0,2% по массе
Аспарагиновая кислота	50 мМ	6,5	87
Аспарагин	50 мМ
Глутаминовая кислота	50 мМ
Глутамин	50 мМ
Сахароза	5% по массе
Полисорбат 80	0,2% по массе

Наиболее значительного восстановления агента в лиофилизированных композициях достигли, когда в композиции все четыре аминокислоты присутствовали в концентрации 50 мМ.

Пример 7

Начиная с предварительного разбавления нейротоксина типа А из Clostridium botulinum в растворе (который содержал аспарагиновую кислоту, аспарагин, глутаминовую кислоту и глутамин в концентрации 50 мМ каждой аминокислоты и ЭДТА в концентрации 0,5 мМ, и который, кроме того, содержал 0,2% по массе полисорбата 80 и 5% по массе сахарозы, и который имел значение pH 6,5), конечное разбавление с концентрацией нейротоксина типа А 1,26 нг/мл (200 единиц/мл) делали в растворе той же композиции и фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. По 0,5 мл вносили пипеткой в стеклянные ампулы 6R и затем лиофилизировали. Лиофилизированные композиции растворяли в WFI. Содержание агента (нейротоксина типа А) определяли с помощью иммуноферментного анализа. Было обнаружено 96% по массе агента. Для подтверждения биологической активности восстановленного агента лиофилизированные композиции растворяли и тестировали на диафрагмах. Лиофилизированная композиция одной из ампул содержала 110 единиц (соответствуя 110% восстановления).

Пример 8

По аналогии с примером 7 готовили лиофилизированные композиции и затем их хранили при 37°С. После трех месяцев хранения содержание агента определяли с помощью иммуноферментного анализа. Было обнаружено 94% по массе от внесенного агента. Подтверждение активности/ампулу в биологическом тесте (тест на диафрагмах) показало в результате содержание 102 единицы/ампулу.

Пример 9

Начиная с предварительного разбавления интерферона бета в растворе (который в одном подходе не содержал ЭДТА, в другом подходе содержал 0,5 мМ ЭДТА), который содержал аспарагиновую кислоту, аспарагин, глутаминовую кислоту и глутамин в концентрации 50 мМ каждой аминокислоты, и который, кроме того, содержал 0,2% по массе полисорбата 80 и 5% по массе сахарозы, и который имел значение pH 7, конечные разбавления с концентрацией 20 мкг/мл (4 Mio международные единицы/мл) делали в растворах с соответствующей композицией и фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. По 1 мл каждого фильтрата вносили пипеткой в стеклянные ампулы 6R и затем лиофилизировали. Лиофилизированные композиции растворяли в WFI. Содержание агента (интерферона бета) определяли с помощью иммуноферментного анализа. Было обнаружено 18,8 (без ЭДТА) и 19,6 мкг (0,5 мМ ЭДТА) агента соответственно. Для подтверждения биологической активности восстановленного агента лиофилизированные композиции растворяли и активность тестировали с помощью традиционного биоанализа (ингибирование цитопатического эффекта на VERO-клетках по сравнению с контролем). Было восстановлено 94% и 95%, соответственно, от внесенной биологической активности.

Пример 10

Начиная с предварительного разбавления фактора свертывания крови VIII в растворе (который содержал аспарагиновую кислоту, аспарагин, глутаминовую кислоту и глутамин в концентрации 50 мМ каждой аминокислоты и 0,5 мМ ЭДТА, и который, кроме того, содержал 0,2% по массе полисорбата и 5% по массе сахарозы, и который имел значение pH 7), делали конечное разбавление с концентрацией 250 международных единиц/мл в растворе той же композиции и фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. В одном подходе использовали полисорбат 20, в другом полисорбат 80. По 1 мл каждого из полученных фильтратов вносили пипеткой в стеклянные ампулы 6R и затем лиофилизировали. Лиофилизированные композиции растворяли в WFI. Содержание агента (фактора свертывания крови VIII) определяли с помощью традиционного теста на коагуляцию. Было обнаружено 238 (Р 20 (полисорбат 20)) и 245 (Р 80 (полисорбат 80)) международных единиц на ампулу соответственно.

Пример 11

Начиная с предварительного разбавления стрептокиназы в растворе (который содержал аспарагиновую кислоту, аспарагин, глутаминовую кислоту и глутамин в концентрации 50 мМ каждой аминокислоты и 0,5 мМ ЭДТА, и который, кроме того, содержал 0,2% по массе полисорбата 80 и 2,5, 5 и 7,5% по массе сахарозы соответственно, и который имел значение pH 7), делали конечное разбавление с концентрацией 250000 международных единиц/мл в растворах соответствующей композиции и фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. По 1 мл каждого фильтрата вносили пипеткой в стеклянные ампулы 6R и затем лиофилизировали. Лиофилизированные композиции растворяли в WFI. Содержание агента (стрептокиназы) определяли с помощью стандартного анализа фибринолиза. Было обнаружено 236500, 247000 и 242500 международных единиц на ампулу соответственно.