модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения

Формула изобретения

1. Модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических констукций на основе пептидных лигандов клеточных рецепторов, включающий лигандную и катионную составляющие, соединенные через гидразоновое производное оксокарбоновой кислоты формулы



где лигандная составляющая представляет собой пептид

X-R¹-His-R³-Ser-R⁵ -D-Lys-Leu-Arg-Pro-R¹⁰, где R¹ - pGlu; R³ - Trp, D-Trp, Pro, или D-Pal(3); R⁵ - Tyr, или Arg; R¹⁰ - Gly-NH₂, D-Ala-NH ₂, или NH-CH₂-CH₃; X - атом водорода, или низшая алкильная группа (С₂-С₅),

или пептид Arg-GIy-Asp-Phe-OH, и катионная составляющая представляет собой пептид H-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val.

2. Способ получения модульного молекулярного конъюгата по п.1, заключающийся в синтезе пептидной лигандной составляющей и пептидной катионной составляющей с использованием твердофазного пептидного синтеза на полимере Ванга с применением Fmoc/But стратегии, к пептидному лиганду присоединяют оксокарбоновую кислоту, в качестве которой берут пировиноградную или левулиновую кислоту, после чего в водном растворе трифторуксусной кислоты проводят отделение кето-пептида от полимерного носителя, одновременно проводят синтез пептидной катионной составляющей на 2-хлортритильном полимере с содержание Сl 1.55 ммоль/г с использованием Fmoc/But-стратегии, после чего пептидную катионную составляющую модифицируют в реакционной смеси, содержащей растворитель ДМФА, DIEA в количестве 2 экв., Boc-NH-NH₂ в количестве 2 экв. и HCTU в количестве 1.1 экв., в течение 3 час при непрерывном перемешивании, после проводят выпаривание в роторном испарителе, полученный остаток растирают с водой, отфильтровывают и высушивают в эксикаторе над парами Р₂O₅, после чего на защитные группы кето-пептида воздействуют смесью, содержащей растворитель TFA, TIS и Н₂O в соотношении 95:2.5:2.5 в течение не менее 3 час до их полного удаления, после этого растворитель упаривают на роторном испарителе, а оставшийся маслянистый остаток пептидной катионной составляющей заливают диэтиловым эфиром, осадок фильтруют, промывают диэтиловым эфиром и высушивают в вакуумном эксикаторе, затем проводят реакцию конъюгации полученных лигандного кето-пептида и гидразидового производного катионной составляющей в водном растворе с использованием пятикратного избытка N-гидроксисукцинимидного эфира, а образование соответствующих гидразонов отслеживают с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии может быть использовано как эффективное средство адресной доставки комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами в определенные органы и ткани млекопитающих. Основной проблемой генотерапии опухолевых заболеваний является разработка эффективных средств доставки (далее: СД) генетических конструкций в клетки-мишени. Важно, чтобы СД обладали адресованным действием, не были токсичны и иммуногенны для организма, а также не вызывали побочных эффектов. На данный момент не существует оптимальных СД «лечащих» генов, полностью соответствующих вышеперечисленным требованиям. Как показывают результаты фундаментальных и прикладных исследований, удачным может явиться использование для доставки в клетки чужеродных генетических конструкций невирусных носителей, которые могут применяться неоднократно, поскольку, в отличие от вирусных СД, они менее токсичны и практически не вызывают иммунного ответа.

Наиболее популярным подходом в этой области является использование молекулярных конъюгатов, состоящих из катионного носителя для конденсации ДНК за счет электростатических взаимодействий и лигандной части, взаимодействующей с клеточными рецепторами и обеспечивающей адресность доставки комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами в определенные органы и ткани млекопитающих [1].

Описываемое в данном патенте техническое решение состоит в разработке модульного подхода к созданию молекулярных конъюгатов, позволяющего независимо синтезировать катионную и лигандную составляющие (модули) с последующим их объединением через гидразоновые производные оксокарбоновых кислот (например, ливуленовой или пировиноградной). Применение модульного подхода позволяет существенно повысить скорость разработки новых конъюгатов, отличающихся лигандными модулями и, как следствие, имеющими тропность к разным клеткам-мишеням, за счет применения комбинаторного подхода, позволяющего быстро тестировать различные варианты лигандных модулей без повторного синтеза катионной части конъюгата. Кроме того, раздельный синтез катионного и лигандного модулей с последующей их конъюгацией приводит к существенному снижению стоимости разработки конъюгатов. Эффективность предложенного подхода продемонстрирована на примере создания модульного молекулярного конъюгата на основе синтетического аналога люлиберина.

Рецепторы к люлиберинам представлены в норме на очень ограниченном числе тканей человека (гипофиз, гонады). Вместе с тем показано, что целый ряд опухолей человека, преимущественно карцином, синтезируют значительное количество рецепторов люлиберина. Данное обстоятельство делает эти рецепторы привлекательными для адресной доставки биологически активных молекул в клетки опухолей [2]. Использование люлиберинов для направленной химиотерапии гормон-чувствительных опухолей широко применяется в клинической практике ряда стран.

Известно использование конъюгатов аналогов люлиберина с различными цитотоксическими агентами (мелфалан, дауномицин, ингибиторы рибосом) для стерилизации животных и борьбы с гормон-зависимыми заболеваниями человека (в том числе, гормон-чувствительными опухолями) [3] в качестве адресной доставки биологически активных молекул в клетки с высоким уровнем рецепторов GnRH. К недостаткам описанного решения следует отнести невозможность формирования комплексов плазмидной ДНК с молекулярными конъюгатами на основе аналогов люлиберина и их адресной доставки в опухолевые клетки.

Известно изобретение [4], в котором рассматриваются вопросы разработки структур аналогов люлиберина - агонистов и антагонистов рецепторов люлиберинов, ковалентно сцепленных с различными цитотоксическими агентами, в том числе с доксорубицином. В рамках данного подхода оказались нереализованными возможности, связанные с осуществлением синтеза молекулярных конъюгатов NLS-GnRH, способных формировать комплексы с плазмидной ДНК и адресно доставлять ее в опухолевые клетки, экспрессирующие рецепторы люлиберина.

Известен конъюгат аналогов люлиберина [5], который используется совместно с цитотоксическим агентом доксирубицином и его производным в целях терапии гормон-чувствительных опухолей. Однако известный конъюгат с агентами имеет сравнительно невысокую эффективность воздействия на клетки опухоли.

Известны молекулярные конъюгаты с поликатионным участком и лигандом для доставки в клетку и ядро клетки ДНК и РНК, использующие в качестве лигандной составляющей пептидные лиганды к трансферриновому рецептору [6]. Однако известные конъюгаты имеют недостаточно высокую адресность доставки в опухолевые клетки, поскольку в данных конъюгатах отсутствует модульная структура и широкая распространенность трансферриновых рецепторов в клетках различных тканей и органов организма.

Известен молекулярный конъюгат на основе синтетических аналогов люлиберина и его применение в качестве средства доставки ДНК в клетки гормон-чувствительных опухолей, наиболее близкий к предлагаемому изобретению [7].

Недостатками известного молекулярного конъюгата является недостаточно высокая эффективность доставки ДНК в опухолевые клетки за счет сложного синтеза, обусловленного немодульной структурой их вариантов, а также усложнение возможностей модификации лигандной их части.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение эффективности доставки ДНК в опухолевые клетки и упрощение синтеза молекулярных конъюгатов за счет применения модульного подхода и возможности быстрой смены лигандных составляющих в целях изменения тропности конъюгата к различным опухолевым и нормальным клеткам организма, а также удешевление и сокращение времени синтеза модульного конъюгата.

Указанный технический результат в предлагаемом изобретении достигается за счет раздельного синтеза пептидных катионной и лигандной составляющей, модификации лигандного модуля путем присоединения к его свободной аминогруппе оксокарбоновой кислоты с помощью карбодиимидного или сукцидиимидного метода, модификации катионного пептидного модуля путем получения гидразидового производного с последующей конъюгацией гидразида катионного модуля с модифицированным оксокарбоновой кислотой лигандным модулем.

Описанный новый технологический подход позволяет синтезировать серии модульных молекулярных конъюгатов на основе общего катионного модуля, отличающиеся лигандными составляющими. Эффективность такого нового подхода продемонстрирована на примере синтеза заявляемого модульного молекулярного конъюгата на основе синтетических аналогов люлиберина и на основе лиганда интегриновых рецепторов. Заявляемый конъюгат содержит в качестве катионной составляющей модифицированный сигнал ядерной локализации Т-антигена вируса SV40, а в качестве лигандного модуля - синтетический агонист люлибериновых рецепторов LHRH, либо последовательность Arg-Gly-Asp-Phe-OH, связывающуюся с интегриновыми рецепторами. Лигандная и катионная составляющие объединены через гидразоновое производное оксокарбоновой (в частности, пировиноградной) кислоты. Такие конъюгаты образуют комплексы с плазмидной ДНК за счет электростатических взаимодействий и способны обеспечивать эффективную и специфическую доставку плазмидной ДНК в опухолевые клетки, экспрессирующие значительные количества люлибериновых рецепторов (условно - конъюгат I), либо в клетки с интегриновыми рецепторами (условно - конъюгат II). Эффективность переноса плазмидной ДНК в опухолевые клетки у разработанного модульного конъюгата на основе лиганда люлиберинового рецептора оказалась сравнимой с молекулярным конъюгатом, описанном ранее [7], при этом стоимость и время синтеза этого модульного конъюгата существенно меньше, как показывают результаты многочисленных исследований, проведенных в лабораторных условиях Санкт-Петербургского государственного университета.

Указанный технический результат достигается заявляемым молекулярным конъюгатом.

Указанный технический результат достигается новым способом его получения, заключающимся в том, что синтез пептидных катионного и лигандного модулей проводится параллельно с применением Fmoc/But стратегии. Присоединение кетокислот можно проводить карбодиимидным способом в присутствии 1-гидрокси-6-хлорбензотриазола либо с использованием пятикратного избытка соответствующего N-гидроксисукцинимидного эфира. Способ с использованием пятикратного избытка соответствующего N-гидроксисукцинимидного эфира является более эффективным. Отщепление полученного кетопептида от полимерного носителя проводится под действием трифторуксусной кислоты в воде в отсутствие триизопропилсилана (стандартный скавенджер), так как в его присутствии наблюдается восстановление кетогруппы в ходе реакции деблокирования. Для получения гидразидовых производных пептидных катионных носителей к раствору защищенного пептида в ДМФА добавляется DIEA (2 экв.), Boc-NH-NH₂ (2 экв.) и HCTU (1.1 экв.). Реакционная смесь перемешивается в течение 3 час и растворитель упаривается на роторном испарителе. Остаток растирается с водой, отфильтровывается и высушивается в эксикаторе над Р₂O₅. Защитные группы удаляются под действием смеси TFA:TIS:Н₂O (95:2.5:2.5) в течение 3 час и растворитель упаривается на роторном испарителе. Маслянистый остаток заливается диэтиловым эфиром, осадок фильтруется, промывается диэтиловым эфиром и высушивается в вакуумном эксикаторе. Реакция конъюгации лигандного кетопептида и гидразидового производного катионного носителя проводится в водном растворе, образование соответствующих гидразонов отслеживается с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. В случае аналога, содержащего остаток пировиноградной кислоты, полнота прохождения реакции значительно увеличивается при понижении pH раствора от 7 до 5.5 и практически не меняется в интервале 5.5-4.5. Аналог, модифицированный левулиновой кислотой, оказался значительно менее реакционноспособным. В данном случае не удалось зафиксировать образования сколько-нибудь значительных количеств гидразона ни в водном растворе при различных значениях pH, ни при проведении реакции в безводном метаноле в присутствии каталитического количества трифторуксусной кислоты. В то же время, пептид вступает во взаимодействие с 2,4-динитрофенигидразином, используемым для определения карбонильных соединений.

Оптимальными условиями для синтеза гидразона на основе пировиноградной кислоты являются следующие:

Реакция проводится в водном растворе при pH 4.5 в течение 24 ч, контроль за ходом процесса осуществляется с помощью аналитической ВЭЖХ. Структура полученных модульных молекулярных конъюгатов подтверждается масс-спектрометрическим анализом.

Указанный технический результат достигается тем, что с помощью вышеописанного подхода синтезирован модульный молекулярный конъюгат на примере лигандной и катионной составляющих, которые соединены через гидрозоновое производное оксокарбоновой кислоты:

конъюгат I, включающий катионную составляющую, представляющую собой модифицированный сигнал ядерной локализации Т-антигена вируса SV40 со структурой H-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val, используемый для конденсации плазмидной ДНК, и лигандную составляющую для взаимодействия с опухоль-специфическими рецепторами, в соответствии с заявленным изобретением, в качестве лигандной составляющей используют синтетические аналоги люлиберина с формулой X-R ¹-His-R³-Ser-R⁵-D-Lys-Leu-Arg-Pro-R ¹⁰, где R¹ - pGlu; R³ - Trp, D-Trp, Pro или D-Pal(3); R⁵ - Tyr, или Arg; R¹⁰ - Gly-NH₂, D-Ala-NH₂ или NH-CH₂ -CH₃; Х - атом водорода, или низшая алканоильная группа (C₂-C₅), обладающие активностью агонистов люлибериновых рецепторов;

конъюгат II, включающий катионную составляющую, представляющую собой модифицированный сигнал ядерной локализации Т-антигена вируса SV40 со структурой H-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val, используемый для конденсации плазмидной ДНК, и лигандную составляющую со структурой Arg-Gly-Asp-Phe-OH, представляющей собой лиганд интегриновых рецепторов.

Соединение лигандной и катионной составляющих у конъюгатов I и II проведено через гидразоновое производное пировиноградной кислоты, как описано выше.

Помимо этого, указанный технический результат достигается тем, что полученные молекулярные конъюгаты применяют в качестве средства доставки ДНК в клетки гормон-чувствительных опухолей.

Заявляемое изобретение было апробировано в Санкт-Петербургском государственном университете на кафедре эмбриологии и по результатам проведенных испытаний ниже приведены конкретные примеры реализации, которые проиллюстрированы Фиг.1-7.

На Фиг.1 отражено образование побочного продукта в процессе деблокирования пептида, модифицированного левулиновой кислотой.

На Фиг.2 представлены данные ВЭЖХ анализа пептида (6) при проведении деблокирования в отсутствии этандитиола.

На Фиг.3 и 4, соответственно, представлены масс-спектр RGDF-пептида, содержащего остаток пировиноградной кислоты, синтезированного на полимере Ванга, и масс-спектр RGDF-пептида, содержащего остаток левулиновой кислоты, синтезированного на полимере Ванга.

На Фиг.5 иллюстрировано формирование комплексов ДНК/конъюгат I и ДНК/конъюгат II при разном соотношении зарядов ДНК: пептид: 1 - ДНК/конъюгат I 1:0.15; 2 - ДНК/конъюгат I - 1:0.25; 3 - ДНК/конъюгат I - 1:0.7; 4 - ДНК/конъюгат I - 1:0.9; 5 - ДНК/конъюгат I - 1:1; 6 - ДНК/конъюгат I - 1:1.5; 7 - свободная ДНК pCMVluc; 8 - ДНК/конъюгат II 1:0.15; 9 - ДНК/конъюгат II - 1:0.25; 10 - ДНК/конъюгат II - 1:0.7; 11 - ДНК/конъюгат II - 1:0.9; 12 - ДНК/конъюгат II - 1:1; 13 - ДНК/конъюгат II - 1:1.5.

На Фиг.6 представлена зависимость уровня трансфекции клеток HepG2 от молярных избытков свободных молекулярных конъюгатов I и II.

На Фиг.7 отражено сравнение трансфекционной эффективности и специфичности синтезированных модульных молекулярных конъюгатов с классическими: pCMVluc - вектор экспрессии гена-репортера, кодирующего люциферазу; LHRH-NLS - классический конъюгат; LHRH-X-NLS - модульный молекулярный конъюгат I.

Примеры конкретной реализации.

Синтезированы молекулярные конъюгаты NLS-X-LHRH:

где NLS имеет структуру H-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val, a GnRH имеет структуру pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH ₂;

NLS-X-RGDF:

где NLS имеет структуру H-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val.

Пример 1.

Способ модификации пептидов оксокарбоновыми кислотами.

Для введения кетогруппы в структуру пептидного носителя были использованы два варианта модификации N-концевой аминогруппы - путем присоединения пировиноградной (3) или левулиновой (4) кислоты:

,

При этом исследовали влияние структуры кетокислоты на ее реакционную способность в условиях пептидного синтеза, природу образующихся побочных продуктов, а также простоту получения и стабильность соответствующих гидразонов.

Для получения соединений (5) и (6) был использован метод твердофазного пептидного синтеза. С целью оптимизации условий проведения реакции и повышения выхода конечных кетопептидов синтез проводили на различных полимерных носителях с применением Boc/Bzl или Fmoc/Bu ^t стратегии. В первом случае используется комбинация защитных групп, удаляемых в кислых условиях, а отщепление пептида от полимерного носителя проводится под действием сильных кислот. Во втором случае применение щелочнолабильной флуоренилметоксикарбонильной (Fmoc) защиты делает возможным отщепление и деблокирование конечного продукта в мягких кислых условиях.

,

Синтез аналогов (5) и (6) с применением Boc/Bzl стратегии проводили на полимере Меррифилда.

Полученные пептиды очищали с помощью гель-фильрации на сефадексе G-15 в 50%-ной уксусной кислоте и анализировали с помощью масс-спектрометрии и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Сопоставление результатов анализа показывает, что процесс отщепления от полимерного носителя сопровождается образованием значительного количества дитиокеталя в результате взаимодействия кетогруппы пептида с присутствующим в реакционной смеси этандитиолом (Фиг.1).

Удаление из реакционной смеси этандитиола приводит к значительному повышению выхода кетопептида (Фиг.2) и полному исчезновению пика, соответствующего дитиокеталю, что является дополнительным подтверждением структуры побочного продукта. Тем не менее, использование Boc/Bzl стратегии приводит к образованию примесей, обладающих близким временем удерживания, что значительно осложняет очистку пептида с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Поэтому в ходе дальнейшей работы был проведен синтез аналогов [5] и [6] на полимере Ванга с применением Fmoc/Bu^t стратегии.

На стадии присоединения кетокислот вместо карбодиимидного метода в присутствии 1-гидрокси-6-хлорбензотриазола использовали пятикратный избыток соответствующего N-гидроксисукцинимидного эфира. Это связано с низкой скоростью ацилирования аминогруппы активированными производными кетокислот и более высокой стабильностью N-гидроксисукцинимидных эфиров в условиях проведения реакции.

Первоначально отщепление пептида от полимерного носителя проводили под действием трифторуксусной кислоты в воде, в присутствии триизопропилсилана в качестве скавенджера. Однако в данном случае ВЭЖХ анализ свидетельствовал о значительном снижении содержания целевого продукта в результате восстановления кетогруппы в условиях деблокирования. Удаление триизопропилсилана из реакционной смеси устраняет возможность протекания побочной реакции и позволяет получить аналог [6] с высокой степенью чистоты. Разработанная схема синтеза была успешно использована также в случае пептида [5], содержащего остаток пировиноградной кислоты. Структура и индивидуальность полученных продуктов подтверждена данными масс-спектрометрического анализа и аналитической ВЭЖХ (Фиг.3 и Фиг.4).

Пример 2.

Синтез катионного модуля NLS.

Синтез проводили на 4-метилбензгидриламино-полимере (0.3 г, содержание аминогрупп 0.62 ммоль/г) при использовании BOC/Bzl стратегии. Отщепление пептида от полимера с одновременным деблокированием проводили с помощью TFMSA. Полученный продукт обессоливали на колонке 10×600 мм с сефадексом G-15 в 50% растворе АсОН. Дальнейшую очистку проводили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выход: 44 мг (27%). Масс-спектр, найдено, m/z: 881.62 [М+H] ⁺. C₄₀H₇₉N₁₅O₇ . Вычислено: М 881.63.

Пример 3. Получение гидразида пептида NLS

Защищенный пептид Boc-Pro-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Val-Gly-OH синтезировали на 2-хлортритильном полимере (содержание Cl 1.55 ммоль/г) с использованием Fmoc/Bu^t-стратегии.

Присоединение первого аминокислотного остатка проводили путем встряхивания полимера в растворе Fmoc-Gly-OH (1.2 экв.) в CH ₂Cl₂ в присутствии 4-кратного избытка DIEA в течение 2 ч. Отщепление защищенного пептида от полимерного носителя проводили под действием смеси АсОН:TFE:CH₂Cl₂ (20:20:60) в течение двух часов. Полимер отфильтровывали, промывали деблокирующей смесью и объединенный фильтрат упаривали. Остаток кристаллизовали путем растирания с водой, полученный осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме.

К раствору защищенного пептида в ДМФА добавляли DIEA (2 экв.), Boc-NH-NH₂ (2 экв.) и HCTU (1.1 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч и растворитель упаривали на роторном испарителе. Остаток растирали с водой, отфильтровывали и высушивали в эксикаторе над P₂O₅. Защитные группы удаляли под действием смеси TFA:TIS:H₂O (95:2.5:2.5) в течение 3 ч и растворитель упаривали на роторном испарителе. Маслянистый остаток заливали диэтиловым эфиром, осадок фильтровали, промывали диэтиловым эфиром и высушивали в вакуумном эксикаторе.

Пример 4.

Синтез кетопроизводного LHRH

Синтез проводили в ручном варианте на полимере Rink Amide-AM (250 мг, содержание аминогрупп 0.9 ммол/г) с использованием Fmoc/Bu ^t-стратегии. При этом в положение 6 последовательности люлиберина вводили остаток D-Lys(Mtt).

Для конденсации использовали двукратные избытки активированных 6-хлор-1-оксибензотриазолиловых эфиров соответствующих Fmoc-производных аминокислот. Для удаления Mtt защиты пептидил-полимер обрабатывая смесью TFA:TIS:CH ₂Cl₂ (2:5:93) до исчезновения окраски реакционной смеси (6 раз). Пептидил-полимер промывали CH₂Cl ₂ (3×1 мин), DMF (1 мин), DIPEA (2×1 мин), DMF (3×1 мин).

Введение пирувоильной защиты осуществляли путем добавления 3-кратного избытка N-гидроксисукцинимидного эфира пировиноградной кислоты, полученного in situ. Полноту реакции ацилирования оценивали с помощью теста Кайзера.

Отщепление пептида с одновременным деблокированием проводили при перемешивании в смеси фенол:H₂O:тиоанизол:TFA (5:5:5:85) в течение 2.5 ч при комнатной температуре. Далее реакционную смесь заливали метил-трет-бутиловым эфиром и промывали метил-трет-бутиловым эфиром. Конечный продукт растворяли в TFA, отфильтровывали и упаривали на роторном испарителе. Остаток обессоливали на колонке с Sephadex G 15 (элюент - 2% уксусная кислота) и очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Пример 5.

Реакция конъюгации с образованием модульного конъюгата I

Реакцию конъюгации проводили в ацетатном буфере при pH 4.3 в течение 24 ч. В ходе реакции использовали 2-кратный избыток H-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-NH-NH₂, контроль за полнотой превращения осуществляли с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Растворитель упаривали на роторном испарителе и конечный продукт очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ в ацетатном буфере. Масс-спектр, найдено, m/z: 2259.31 [М+Н]⁺. Вычислено: М2258.30.

Пример 6.

Реакция конъюгации с образованием модульного молекулярного конъюгата II

В ходе дальнейшей работы было исследовано влияние структуры используемой кетокислоты и pH реакционной среды на ход процесса конъюгации с соединениями, содержащими гидразогруппу. Реакцию кетопептидов с гидразидами проводили в водном растворе, образование соответствующих гидразонов отслеживали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. При этом было показано, что в случае аналога, содержащего остаток пировиноградной кислоты, полнота прохождения реакции значительно увеличивается при понижении pH раствора от 7 до 5.5 и практически не меняется в интервале 5.5-4.5.

Аналог, модифицированный левулиновой кислотой, оказался значительно менее реакционно-способным. В данном случае не удалось зафиксировать образования сколь-нибудь значительных количеств гидразона ни в водном растворе при различных значениях pH, ни при проведении реакции в безводном метаноле в присутствии каталитического количества трифторуксусной кислоты. В то же время, пептид вступает во взаимодействие с 2,4-динитрофенигидразином, используемым для определения карбонильных соединений.

Полученные данные позволили выбрать условия для синтеза гидразона на основе аналога, модифицированного пировиноградной кислотой. Реакцию проводили в водном растворе при рН 4.5 в течение 24 ч, контроль за ходом процесса осуществляли с помощью аналитической ВЭЖХ.

Пример 7.

Стабильность модульных молекулярных конъюгатов в зависимости от значений pH методом обращенно-фазовой ВЭЖХ

Было проведено исследование стабильности полученного гидразона по отношению к гидролизу в водном растворе при различных значениях рН. Полученные результаты свидетельствует о высокой устойчивости гидразона при рН, большем 5, и его существенном гидролизе при pH 3.

pH	Степень гидролиза за 24 ч
3	40%
4	10%
5	<5%
6.86	<5%

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования пептидов, модифицированных остатком пировиноградной кислоты при синтезе носителей, состоящих из отдельных функциональных блоков. Наличие близкорасположенной карбонильной группы способствует стабилизации образующихся гидразонов. Это позволяет повысить выход конечного продукта и значительно упрощает его очистку с помощью традиционных способов. Простота получения полифункциональных носителей для адресной доставки лекарственных препаратов, высокий выход реакции конъюгации и хорошая стабильность препаратов в условиях хранения являются основными преимуществами используемого подхода.

Пример 8.

Формирование комплексов модульных молекулярных конъюгатов I и II с плазмидной ДНК

Формирование комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами проводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) при различном соотношении зарядов ДНК и пептида в реакционной среде согласно [8]. Образование комплексов ДНК/конъюгат контролировали методом гель-ретардации в агарозном геле (Фиг.5). Оба модульных молекулярных конъюгата эффективно связывали плазмидную ДНК при изотонических значениях ионной силы реакционной среды. Формирование комплексов ДНК/конъюгат I и ДНК/конъюгат II на Фиг.5 представлено при разном соотношении зарядов ДНК: пептид: 1 - ДНК/конъюгат I 1:0.15; 2 - ДНК/конъюгат I - 1:0.25; 3 - ДНК/конъюгат I - 1:0.7; 4 - ДНК/конъюгат I - 1:0.9; 5 - ДНК/конъюгат I - 1:1; 6 - ДНК/конъюгат I - 1:1.5; 7 - свободная ДНК pCMVluc; 8 - ДНК/конъюгат II 1:0.15; 9 - ДНК/конъюгат II - 1:0.25; 10 - ДНК/конъюгат II - 1:0.7; 11 - ДНК/конъюгат II - 1:0.9; 12 - ДНК/конъюгат II - 1:1; 13 - ДНК/конъюгат II - 1:1.5.

Пример 9.

Трансфекционная активность комплексов плазмидной ДНК с конъюгатами I и II

Для проверки трансфекционной активности комплексов плазмидной ДНК с модульными молекулярными конъюгатами I и II клетки гепатомы человека HepG2 (экспрессируют значительные количества люлибериновых и интегриновых рецепторов) трансфецировали комплексами pCMVluc (представляет собой вектор экспрессии гена-репортера, кодирующего люциферазу, под контролем промотора ранних генов цитомегаловируса человека) с молекулярными конъюгатами I и II. Комплексы готовили при разных соотношениях зарядов ДНК-пептид. Трансфекцию клеток HepG2 препаратами комплексов выполняли, как описано ранее [8]. Клетки высевали с плотностью 10⁴ клеток/см² на чашки Петри (диаметром 30 мм) и выращивали до состояния 60-70% монослоя в среде DMEM, с добавлением 10% эмбриональной сыворотки телят («Биолот», Россия), при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Комплексы ДНК/пептид с разными соотношениями зарядов ДНК и пептида готовили из расчета 12 мкг ДНК на чашку Петри в 500 мкл PBS. При добавлении к клеткам в среду вводили CaCl₂ до концентрации 4 мМ. После инкубации клеток с комплексами в течение 2 ч клетки отмывали от не интернализовавшихся комплексов раствором гепарина (58 мкг/мл в PBS) и инкубировали в среде DMEM с 10% сывороткой 24 ч. Активность люциферазы измеряли с использованием коммерческой системы оценки активности люциферазы производства компании Promega (Luciferase Assay System, кат. номер Е4030) в соответствии с протоколом производителя. Измерения люминисценции производили на люминометре «Тurnеr Biosystem 20/20». Определение концентрации белка в клеточных лизатах проводили по методу Брэдфорд. Активность люциферазы выражали в относительных световых единицах (RLU), представляющих собой число вспышек в минуту в расчете на 1 мг тотального белка клеточных экстрактов. Фоновые значения люминесценции не превышали 120 RLU. Результаты представлены на Фиг.6. Установлено, что в отличие от комплексов ДНК с катионными пептидами Tat и К8, избытки свободных конъюгатов I и II не оказывают стимулирующего действия на уровень трансфекции клеток. Полученные результаты, как показывают результаты исследований, объясняются разными путями интернализации комплексов ДНК с катионными пептидами (адсорбционный эндоцитоз) и молекулярными конъюгатами (рецептор-опосредованный эндоцитоз). При этом транфекционная активность конъюгата, созданного на основе антагониста люлиберинового рецептора (IV), была примерно в три раза ниже, чем у конъюгата, содержащего в качестве лигандной составляющей агонист люлиберинового рецептора.

Пример 10.

Сравнение эффективности модульных молекулярных конъюгатов с классическими. Основное преимущество модульного подхода к синтезу молекулярных конъюгатов - более быстрая и дешевая разработка, а также возможность быстро менять клеточные мишени, либо доставляемые вещества за счет смены лигандных и катионных модулей. Вместе с тем, представляется интересным провести сравнение эффективности специфичности и эффективности доставки генов с помощью модульного и классического конъюгатов, созданных на основе одного и того же лиганда (синтетический аналог люлиберина). Трансфекцию клеток HepG2 и VH10 (фибробласты человека, не экспрессируют рецепторы люлиберина) вектором экспрессии гена-репортера, кодирующего люциферазу, проводили с помощью классического молекулярного конъюгата LHRH-NLS (лигандная и катионная составляющие соединены пептидной связью, см. отчет за первый этап НИР) и модульным молекулярным конъюгатом LHRH-X-NLS (те же лигандная и катионные составляющие соединены через гидразоновое производное пировиноградной кислоты). Эффективность трансфекции оценивали по уровню активности люциферазы. Клетки высевали с плотностью 10⁴ клеток/см² на чашки Петри (диаметром 30 мм) и выращивали до состояния 60-70% монослоя в среде DMEM, с добавлением 10% эмбриональной сыворотки телят («Биолот», Россия), при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Комплексы ДНК/пептид с разными соотношениями зарядов ДНК и пептида готовили из расчета 12 мкг ДНК на чашку Петри в 500 мкл PBS. При добавлении к клеткам в среду вводили CaCl₂ до концентрации 4 мМ. После инкубации клеток с комплексами в течение 2 ч клетки отмывали от не интернализовавшихся комплексов раствором гепарина (58 мкг/мл в PBS) и инкубировали в среде DMEM с 10% сывороткой 24 ч. Активность люциферазы измеряли с использованием коммерческой системы оценки активности люциферазы производства компании Promega (Luciferase Assay System, кат. номер Е4030) в соответствии с протоколом производителя. Измерения люминисценции производили на люминометре «Тurner Biosystem 20/20». Определение концентрации белка в клеточных лизатах проводили по методу Брэдфорд. Активность люциферазы выражали в относительных световых единицах (RLU), представляющих собой число вспышек в минуту в расчете на 1 мг тотального белка клеточных экстрактов. Фоновые значения люминесценции не превышали 120 RLU. Результаты апробации по сравнению трансфекционной эффективности и специфичности синтезированных модульных молекулярных конъюгатов с классическими представлены на Фиг.7: pCMVluc - вектор экспрессии гена-репортера, кодирующего люциферазу; LHRH-NLS - классический конъюгат; LHRH-X-NLS - модульный молекулярный конъюгат I.

Установлено, что оба конъюгата обеспечивали эффективный перенос плазмидной ДНК в клетки гепатомы человека HepG2, тогда как в трансфецированных фибробластах регистрировалась только фоновая люциферазная активность. Существенных различий в эффективности трансфекции клеток классическим и модульным молекулярными конъюгатами выявлено не было. Таким образом, модульный молекулярный конъюгат I обладает сравнимой с описанным ранее конъюгатом NLS-LHRH [7] трансфекционной активностью и специфичностью, выгодно отличаясь от него временем и стоимостью синтеза.

Как показывают результаты апробации, представленные в примерах 1-10, в заявляемом изобретении значительно повышается эффективность доставки ДНК в опухолевые клетки и существенно упрощается, удешевляется и сокращается время синтеза молекулярных конъюгатов за счет применения модульного подхода, а также появившейся возможности быстрой смены лигандных составляющих для изменения тропности конъюгата к различным опухолевым и нормальным клеткам организма.

Заявленное изобретение позволяет решать проблему генотерапии опухолевых заболеваний, поскольку полученный модульный пептидный конъюгат является, как показали результаты многочисленных испытаний в режиме реального времени, эффективным средством адресной доставки и, что особенно важно, не токсичны, иммуногенны для организма, и не вызывают побочных эффектов.

Литература

1. Molas М., Gomez-Valades A. G., Vidal-Alabro A., Miguel-Turu М., Bermudez J., Bartrons R., Perales J. C. Receptor-mediated gene transfer vectors: progress towards genetic pharmaceuticals (2003) Curr. Gene Ther. 3 (5): 468-485.

2. Schally A.V. Luteinizing hormone-releasing hormone analogs: their impact on the control of tumorigenesis (1999) Peptides 20 (10): 1247-1262.

3. Патент US 5378688.

4. Патент US 6214969.

5. Международная заявка PCT/EP96/05029 (номер международной публикации WO 97/19954); патент US 6184374 В.

6. Заявка на изобретение 2009125973/10, 08.07.2009.

7. Патент РФ № 2377247, заявка на изобретение № 2007148383/04, 27.12.2007.

8. Диже Э.Б., Игнатович И.А., Буров С.В., Акифьев Б.Н., Ефремов А.М., Перевозчиков А.П., Орлов С.В. Комплексы ДНК с катионными пептидами: условия формирования и факторы, влияющие на эффективность проникновения в клетки млекопитающих (2006). Биохимия 71 (12): 1659-1667.

Перечень последовательностей вариантов модульного молекулярного конъюгата

Молекулярный конъюгат состоит из катионной составляющей, ответственной за электростатическое взаимодействие с плазмидной ДНК, и лигандной составляющей, способной взаимодействовать с клеточными рецепторами. Во всех вариантах в качестве катионной составляющей использован модифицированный сигнал ядерной локализации Т-антигена вируса SV40. Последовательность катионной составляющей:

H-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val

Первый вариант молекулярного конъюгата содержит в качестве лигандной составляющей следующую последовательность:

Gly-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH ₂, являющуюся синтетическим аналогом люлиберина.

Катионная составляющая присоединена к -аминогруппе 6-го D-Lys через гидразоновое производное пировиноградной кислоты:

о

Последовательность лигандной составляющей является частным случаем множества пептидов, описываемых следующей формулой:

X-R¹-His-R³-Ser-R ⁵-D-Lys-Leu-Arg-Pro-R¹⁰-NHs, где R¹ - pGlu; R² - His, или D-Phe(4Cl); R³ - Trp, D - Trp, или D-Pal(3); R⁵ - Tyr, или Arg; R ¹⁰ - Gly, или D - Ala; X - атом водорода, или низшая алкильная группа (C₂-C₅).

Второй вариант молекулярного конъюгата содержит в качестве лигандной составляющей следующую последовательность:

Arg-Gly-Asp-Phe-OH, являющуюся лигандом интегриновых рецепторов. Катионная составляющая присоединена к аминогруппе аргининового остатка через гидразоновое производное пировиноградной кислоты:

Приложение

СД - средства доставки

GnRH - гонадотропин-рилизинг факторы, люлиберины

NLS - сигнал ядерной локализации

Fmoc - 9-флуоренил-метоксикарбонил

But- трет-бутил

ДМФА - диметилформамид

DIEA - диизопропилэтиламин

Boc - трет-бутилоксикарбонил

HCTU - 2-(6-хлор-1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиний гексафторфосфат

TFA - трифторуксусная кислота

TIS - триизопропилсилан

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

Bzl - бензил

АсОН - уксусная кислота

TFE - трифторэтанол

PBS - фосфатно-солевой буфер