штамм бактерий bacillus subtilis 8a в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis 8A, депонированный в коллекции ГНУ ВНИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ под номером RCAM 00876, в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма эндофитных бактерий Bacillus subtilis 8A для растениеводства в качестве средства для повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов.

Известно и описано изобретение «Биопрепарат Фитоспорин для защиты растений от болезней» по патенту РФ № 2099947 с приоритетом от 15.11.1996 г. на имя Института Микробиологии и вирусологии НАН Украины (UA) и Научно-производственного объединения «Башкирское» (RU), МПК A01N 63/00; C12N 1/20; C12R 1:125, публикация 27.12.1997 г. (прототип).

Основу биопрепарата «Фитоспорин» составляет штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 с концентрацией клеток 10⁹ -10¹⁰ на 1 мл физраствора в количестве 92-98 об.% и наполнитель в количестве 2-8 об.%.

При этом штамм Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий и грибов, что позволяет использовать его для защиты различных видов сельскохозяйственных, декоративных, древесных растений.

Задачей изобретения является выявление штамма, пригодного для использования в сельском хозяйстве в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов, позволяющего расширить арсенал подобных средств.

Указанная задача решается за счет того, что в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов в сельском хозяйстве используется штамм эндофитных бактерий Bacillus subtilis 8A, позволяющий расширить арсенал подобных средств.

Штамм эндофитных бактерий Bacillus subtilis 8A был выделен из зерна озимой пшеницы с.Нота, произрастающей в Ростовской обл., Веселовском районе, и депонирован 14.11.2011 г. в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) в ГНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM 00876.

Среда культивирования: питательный агар (готовая питательная среда производства ООО «Биокомпас-С», ТУ 10-02-02-789-176-94). Оптимальная температура для роста 28°С. Культивирование в течение 48 часов.

Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.

Клетки имеют форму правильных палочек с закругленными концами и монополярным перитрихиальным расположением жгутиков. Размер клеток составляет (2,3-2,7)×(1,0-1,4) мкм. Штамм образует споры, расположенные в центре клетки, положительно окрашивается по Граму. Рост в жидкой и полужидкой питательной среде микроаэрофильный, метаболизм дыхательный.

На питательном агаре образует сухие колонии кремового цвета, пастообразной консистенции с неровными изрезанными краями. Диаметр колоний 10-15 мм. Оптимальная температура для роста 28°С. При температуре более 45°С и менее 15°С рост замедленный. Оптимальное значение рН среды 7,1, рост происходит также при рН от 4,5 до 8,0.

В качестве единственного источника углерода штамм 8A использует с образованием кислоты арабинозу, ксилозу, маннит, глюкозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, сорбит, глицерин, декстрин, крахмал и с образованием щелочи рамнозу и дульцит. Использует минеральные формы азота - соли аммония и нитраты, аминокислоты и белки. Штамм Bacillus subtilis 8A гидролизует казеин, желатину, крахмал и лакмусовое молоко. Лакмус при этом обесцвечивался. Штамм обладает сильной каталазной активностью и не обладает липазной активностью. Штамм способен расти при 45°С, 5% NaCl и 0,001% лизоцима.

Выявлено и экспериментально установлено, что штамм Bacillus subtilis 8A обладает фунгицидной активностью против фитопатогенных грибов Alternaria alternata, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium sporotrichioides, фитопатогенных бактерий Clavibacter michiganens ss. sepedonicum, Erwinia carotovora ss. atroseptica, Pseudomonas syringae и фитостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам (например, яровая и озимая пшеница, лен, подсолнечник).

В таблице 1, 2 представлены сравнительные результаты по антагонистической активности двух штаммов бактерий: Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 - (продуцента биопрепарата Фитоспорин) - прототипа и заявляемого штамма Bacillus subtilis 8A, по отношению к фитопатогенным микроорганизмам.

Бактерицидную активность проверяли на 4-х штаммах фитопатогенных бактерий: Pseudomonas syringae (штамм 213), Pseudomonas syringae (штамм 8511), Erwinia carotovora var. atroseptica (штамм 822), Clavibacter michiganense subs sepedonicus (штамм 6028). Вначале высевали бактерии бактериологической петлей сплошным газоном на поверхности питательного агара и культивировали 48 часов при 28°С. В день проверки на бактерицидную активность высевали сплошным газоном на голодном картофельном агаре штаммы указанных фитопатогенных бактерий. Затем переносили на поверхность только что засеянной среды вырезанные стерильным пробочным сверлом агаровые блочки со зрелой культурой тестируемых бактерий. Перенос осуществляли с помощью стерильного скальпеля и прокаленного пинцета. Чашки с блочками культивировали в течение 24 часов при температуре 28°С, после чего замеряли диаметр зоны ингибирования вокруг блочков.

Результаты измерений представлены в таблице 1.

Таблица 1
Антагонистическая активность штаммов бактерий по отношению к фитопатогенным бактериям
Штамм	Зона ингибирования роста, мм
	Pseudomonas syringiae (штамм 213)	Pseudomonas syringiae (штамм 8511)	Erwinia carotovora var. atroseptica (штамм 822)	Clavibacter michiganense subs sepedonicus (штамм 6028)
Bacillus subtilis 128 (Фитоспорин) - прототип	12,5±1,0	13,1±0,7	20,1±1,6	10,9±1,3
Bacillus subtilis 8A (заявленный)	20,0±1,5	21,7±1,1	25,5±1,5	23,5±1,9

Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus subtilis 8A обладает большей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным бактериям по сравнению с прототипом -штаммом Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ - продуцентом биопрепарата Фитоспорин.

Для определения фунгицидной активности двух штаммов бактерий: Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 - (продуцента биопрепарата Фитоспорин) - прототипа и заявляемого штамма Bacillus subtilis 8A был использован метод «колодцев». Для испытания были отобраны следующие фитопатогенные грибы:

Fusarium sporotrichioides, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Rhizoctonia solani. В разогретый и остывший до температуры 37°С картофельно-декстрозный агар добавляли суспензию спор грибов (10⁵ КОЕ/мл) из расчета 1 мкл суспензии на 1 мл среды. Полученную смесь разливали по чашкам Петри, после застывания в ней делали прокаленным пробочным сверлом 4 ровных сквозных отверстия, расположенных квадратом. В эти отверстия заливали по 100 мкл бактериальной суспензии с титром клеток 10 ⁸ КОЕ/мл. Одна чашка была оставлена с пустыми «колодцами» как контрольный вариант. Все чашки с «колодцами» культивировали в течение 72 часов при температуре 28°С. Фунгицидную активность определяли как зоны ингибирования роста фитопатогенного гриба вокруг «колодцев».

Результаты измерений представлены в таблице 2.

Таблица 2
Антагонистическая активность штаммов бактерий по отношению к фитопатогенным грибам
Штамм	Зона ингибирования роста, мм
	Fusarium culmorum	Fusarium graminearum	Fusarium sporotrichioides	Rhizoctonia solani
Bacillus subtilis 128 (Фитоспорин) - прототип	11,3±0,9	10,7±0,5	13,5±1,0	15,48±1,1
Bacillus subtilis 8A (заявленный)	16,5±1,1	17,3±1,0	21,7±1,3	29,5±1,9

Из данных, приведенных в таблице 2, видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus subtilis 8A обладает большей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ - продуцентом биопрепарата Фитоспорин.

Оценку ростостимулирующей активности штаммов Bacillus subtilis 8A и прототипа - Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 проводили на кресс-салате сорта «Витаминный». Для этого семена салата обрабатывали суспензиями указанных штаммов бактерий с титром 10⁵ КОЕ/мл и раскладывали по чашкам Петри с увлажненной до полной влагоемкости ватой и фильтровальной бумагой. Контрольный вариант обрабатывали стерильной водой. Опыт проводили в 2-кратной повторности, на каждой повторности использовали по 50 семян. Чашки культивировали в течение 72 часов при температуре при 28°С, после чего измеряли длину проростков салата.

Результаты измерений представлены в таблице 3.

Таблица 3
Ростостимулирующая активность бактерий, определенная в отношении проростков салата
Вариант	Средняя длина корня, мм	Средняя длина зеленой части ростка, мм
Контроль	4,4±1,1	12,0±1,0
Bacillus subtilis 128 (Фитоспорин) - прототип	9,9±2,2	10,3±1,1
Bacillus subtilis 8A (заявленный)	20,1±2,1	15,3±1,0

Из данных, приведенных в таблице 3, видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus subtilis 8A обладает более сильной ростостимулирующей активностью по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ - продуцентом биопрепарата Фитоспорин.

Высокая ростостимулирующая активность заявляемого штамма эндофитных бактерий Bacillus subtilis 8A вызвана способностью создавать с растением микробно-растительную систему путем колонизация эндофитными бактериями корневой системы и внутренних тканей (ризосферы) растения, что было подтверждено опытным путем. Для исследований использовали следующие материалы. В качестве растительного материала использовали редис сорта «Дуро» и озимую мягкую пшеницу Triticum aestivum сорта «Веда».

Были отобраны по четыре грамположительных бактерий из лаборатории: две бактерии Bacillus subtilis 128 и две бактерии Bacillus subtilis 8A.

Бактерии выращивали на среде LC (г/л) - триптон 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; NaCl - 8,0; MgSO₄·7H ₂O - 2,5; агар - 18, 1 мл 1М Tris буфера.

Колонизацию корней редиса и пшеницы бактериями изучали в гнотобиотических системах (Simon et. al. 1996), содержащих стерильный кварцевый песок с добавлением 15% питательного раствора (PNS) следующего состава (на 1 л): 5 mM KNO₃, 5 mM Са(NO₃ )₂, 2 mM MgSO₄, 1 mM KH₂PO ₄.

Семена пшеницы стерилизовали 30 сек - 70% раствором этилового спирта, затем 6 мин - 0,1% сулемы (HgCl ₂).

Семена редиса стерилизовали 30 сек - 70% раствором этилового спирта, затем 5 мин - 3% раствором гипохлорита (HClO).

После стерилизации все семена тщательно отмывали стерильной водой, меняя воду 5-6 раз, и 30 минут на качалке.

Затем семена раскладывали в стерильные чашки Петри на увлажненные фильтровальные бумажки (5 мл на чашку) и проращивали при температуре 28°С в течение суток.

Для инокуляции использовали ночную (20-часовую) культуру микроорганизмов, выращенную на качалке на жидкой среде LC при температуре 28°С. Клетки бактерий отделяли от ростовой среды центрифугированием и отмывали 0,85% раствором NaCl. Для инокуляции стерильные проростки редиса и пшеницы замачивали в течение 30 мин в суспензии с титром бактериальных клеток 10⁵ КОЕ/мл.

Инокулированные проростки растений высаживали в кварцевый песок (на глубину 5-6 мм) в гнотобиотические системы по 1 растению на каждую систему. Повторность опыта - шестикратная.

Растения пшеницы и редиса выращивали в фитотроне при 21°С в течение 5 суток, после чего их извлекали из системы и определяли приживаемость бактерий путем измерения их количества в ризосфере и на корнях растений.

Результаты измерений приведены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4
Приживаемость бактерий в ризосфере и на корнях пшеницы с. «Веда»
Штамм бактерий	Численность бактерий			Отношение числа бактерий на корне к числу бактерий в ризосфере, %
	Ризосфера		Корень
	105 KOE/растение	105 КОЕ/г ризосферы	105 КОЕ/корень
Bacillus subtilis 128	32±8	27±7	11±2	34,3
Bacillus subtilis 8A	55±14	38±10	15±4	27,3

Таблица 5
Приживаемость бактерий в ризосфере и на корнях редиса с. «Дуро»
Штамм бактерий	Численность бактерий			Отношение числа бактерий на корне к числу бактерий в ризосфере, %
	Ризосфера		Корень
	105 КОЕ/растение	105 KOE/г ризосферы	105 КОЕ/корень
Bacillus subtilis 128	183±31	376±32	5,1±1,2	2,8
Bacillus subtilis 8A	144±23	301±48	14,5±3,0	10,1

Результаты опытов по изучению приживаемости эндофитных бактерий, выделенных из семян озимой пшеницы, в ризосфере и на корнях растений пшеницы и редиса, приведенные в таблицах 4, 5, показали, что штаммы эндофитов способны эффективно колонизировать ризосферу и корневую систему как однодольных (пшеница), так и двудольных растений (редис).

При использовании заявляемого штамма бактерии Bacillus subtilis 8A в составе биопрепаратов важным является также и то, что бактерии образуют споры, что позволяет сохранять эти препараты без потери жизнеспособности бактерий в течение длительного срока, не менее 12 месяцев после получения.

Концентрация (количество жизнеспособных клеток и спор) штамма бактерии Bacillus subtilis 8A для его эффективного использования в составе различных биопрепаратов должна составлять 10⁶-10⁸ клеток в 1 мл культуральной жидкости, так как экспериментально установлено, что использование штамма в концентрации менее 10⁶ кл/мл ведет к снижению антагонистического эффекта, а увеличение концентрации свыше 10⁹ кл/мл не приводит к увеличению эффективности защитного и ростостимулирующего действия.

Ниже приведен пример получения жидкой формы биопрепарата на основе заявляемого штамма эндофитных бактерий Bacillus subtilis 8A.

Маточная культура

Для получения маточной культуры штамма бактерий Bacillus subtilis 8A использовали жидкую питательную среду КСБ, приготовленную следующим образом. Сначала приготовили картофельный отвар, нарезав 200 г очищенного картофеля ломтиками и отварив его в 800 мл дистиллированной воды в течение 20 минут, затем отвар отфильтровали через ватно-марлевый фильтр и добавили в него 10 г сахарозы. Значение рН смеси довели до 7,0.

Полученную жидкую питательную среду разлили в 750-мл качалочные колбы по 100 мл и стерилизовали при 1 атм. 30 минут. Затем провели инокуляцию питательной среды в колбах стерильно микробиологической петлей из пробирки со скошенным питательным агаром (состав среды см. выше), содержащим чистую культуру Bacillus subtilis 8A. После этого колбы поместили на качалку (220 об/мин) и культивировали в течение 48 часов при температуре 28°С. Таким образом, в колбах была получена маточная культура Bacillus subtilis 8A с титром бактерий около 5·10⁹ КОЕ/мл, которую хранили в холодильнике до 1 месяца при температуре 4-6°С для последующего засева бутылей или ферментеров.

Рабочая культура

Для промышленного культивирования штамма бактерий Bacillus subtilis 8A рабочую культуру получали в бутылях или ферментерах на аналогичной указанной выше среде, при этом допускается разбавление питательной среды в 2 раза. Норма инокуляции маточной культурой 2-5%, продолжительность культивирования - 48 часов при температуре 28-30°С. При выращивании рабочих культур допускается повышение температуры до 33°С. Так получили концентрат бактериальной суспензии на основе штамма Bacillus subtilis 8A с титром бактерий не менее 10 КОЕ/мл.

Жидкая форма биопрепарата на основе штамма Bacillus subtilis 8A

Полученный концентрат бактериальной суспензии на основе штамма Bacillus subtilis 8A разводят стерильной водой в соотношении 1:10 или 1:20. Полученную жидкую форму выдерживают в течение 3-5 дней при температуре 20-25°С до получения титра бактерий не менее 10⁸ КОЕ в 1 мл препарата, после чего препарат можно применять для обработки сельскохозяйственных культур. Жидкий препарат стерильно разливают в полиэтиленовые бутылки или канистры емкостью 0,25; 0,5; 1,0 и 10,0 литров, которые предварительно ополаскивают спиртом.

Благодаря относительно высокой биологической активности используемого штамма и высокой скорости его роста, жидкий препарат в готовом виде, а также в производстве практически не заражается посторонней микрофлорой. Тем не менее, необходим постоянный контроль всех этапов получения биопрепарата на основе штамма Bacillus subtilis 8A.

Эффективность биопрепарата, полученного на основе штамма бактерий Bacillus subtilis 8A указанным выше способом, была проверена на полевых опытах в Ивановской области в отношении продуктивности яровой пшеницы районированного сорта «Приокская». Полевой опыт с пшеницей проводили на дерново-среднеподзолистой среднесуглинистой почве (рН - 5,6; гумус - 1,7%; Hr -1,7 мгэкв/100 г; P₂O₅ - 190 мг/кг; К₂О - 156 мг/кг) опытного поля Ивановской ГСХА.

Полевой опыт проводили согласно методике проведения исследований в Географической сети опытов ВИУА (Оценка эффективности микробных препаратов в земледелии / Под ред. Завалина А.А. - М.: Россельхозакадемия, 2000 г. - 82 с.). Посевная площадь делянки 40 м², учетная - 30 м². Повторность опыта четырехкратная. Посев пшеницы проводили на участке, предшественником которой был картофель.

В день посева часть семян пшеницы ничем не обрабатывали (контроль), другую часть семян обрабатывали жидким биопрепаратом Фитоспорин на основе штамма-прототипа Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ, а последнюю часть семян обрабатывали жидким препаратом на основе штамма бактерий Bacillus subtilis 8A, полученным описанным выше способом. При этом инокуляцию семян пшеницы проводили из расчета 1 л препарата на 9 л воды с добавлением 20-30 г Na-КМЦ - натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы. Опрыскивание растений в фазу трубкования проводили вручную с помощью ранцевого опрыскивателя из расчета 2 л препарата на 200 л воды на гектар.

Агротехника выращивания пшеницы соответствовала зональной технологии. Уборку урожая проводили комбайном Сампо.

Варианты опыта предполагали посев пшеницы без дополнительного внесения в почву минеральных удобрений и при дополнительном внесении частично и полностью азотных, фосфорных и калийных удобрений.

Причем минеральные удобрения в виде аммиачной селитры, двойного суперфосфата и хлористого калия вносили вручную под предпосевную культивацию согласно схеме опыта. Результаты приведены в таблицах 6, 7, 8.

Таблица 6
Урожай зерна яровой пшеницы с. Приокская на фоне без удобрений
Вариант опыта - без удобрений	Урожай зерна, ц/га	Прибавка урожая
		ц	%
Контроль (без обработки)	6,1	-	-
Bacillus subtilis 128 (Фитоспорин)	7,4	1,3	21,3
Bacillus subtilis 8A	8,1	2,0	32,8

Таблица 7
Урожай зерна яровой пшеницы с. Приокская на фоне внесения фосфорных и калийных удобрений
Вариант опыта - с РК (фосфор + калий)	Урожай зерна, ц/га	Прибавка урожая
		ц	%
РК + Контроль (без обработки)	10,4	-	-
РК + Bacillus subtilis 128 (Фитоспорин)	10,5	0,1	1,0
РК + Bacillus subtilis 8A	13,0	2,6	25,0

Таблица 8
Урожай зерна яровой пшеницы с. Приокская на фоне внесения азотных, фосфорных и калийных удобрений
Вариант опыта -с NPK (азот + фосфор + калий)	Урожай зерна, ц/га	Прибавка урожая
		ц	%
NPK+Контроль (без обработки)	14,3	-	-
NPK + Bacillus subtilis 128 (Фитоспорин)	14,8	0,5	3,5
NPK + Bacillus subtilis 8A	16,4	2,1	14,7

Сравнение данных по урожаю пшеницы, приведенных в таблицах 6, 7 и 8, позволяют сделать вывод, что биопрепарат, полученный на основе заявленного штамма бактерий Bacillus subtilis 8A, обладает более сильным воздействием на урожайность (продуктивность) пшеницы во всех вариантах опыта (как без внесения минеральных удобрений, так и с дополнительным их внесением) по сравнению с воздействием биопрепарата Фитоспорин на основе штамма - прототипа Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ.

Эффективность биопрепарата, полученного на основе штамма бактерий Bacillus subtilis 8A, была проверена на полевых опытах в Казахстане (Костанайская область, Карабалыкский район) в отношении урожайности подсолнечника масличного и льна масличного. Полевые опыты по сравнению эффективности биопрепаратов проводили на почве-черноземе, среднегумусном, тяжелосуглинистом, гумус 3-4%, рН-7,1 Карабалыкской СХОС.

Агротехника: предшественник яровая мягкая пшеница, подсолнечник и лен высевали в четырехпольном севообороте последней культурой, проводили предпосевную обработку почвы на глубину 8-10 см; посев проводили сеялкой точного высева СКС-610 с порционным высевающим агрегатом.

Варианты опыта предполагали посев семян льна и подсолнечника без обработки (контроль) и с обработкой семян биопрепаратами: Фитоспорином (на основе штамма - прототипа Bacillus subtilis 128) и препаратом на основе заявляемого штамма Bacillus subtilis 8A из расчета 2,0 л/т, а также с обработкой этими биопрепаратами растений по вегетации из расчета 1,0 л/га.

Опыт мелкоделяночный, площадь делянок - 25 м² в трехкратной повторности. Уборку семян льна и подсолнечника проводили малогабаритным комбайном «Винтерштайгер» и определяли урожай во всех вариантах опыта.

Результаты опытов приведены в таблицах 9 и 10.

Таблица 9
Урожайность масличного льна в Казахстане
Вариант опыта (штамм бактерий)	Урожай семян льна, ц/га	Прибавка урожая
		ц	%
Контроль (без обработки)	4,5	-	-
Bacillus subtilis 128 (Фитоспорин)	5,2	0,7	15,6
Bacillus subtilis 8A	5,6	1,1	24,4

Таблица 10
Урожайность подсолнечника в Казахстане
Вариант опыта (штамм бактерий)	Урожай семян подсолнечника, ц/га	Прибавка урожая
		ц	%
Контроль (без обработки)	8,9	-	-
Bacillus subtilis 128 (Фитоспорин)	10,3	1,4	15,7
Bacillus subtilis 8A	12,7	3,8	42,7

Из данных, приведенных в таблицах 9 и 10, следует, что биопрепарат, полученный на основе заявленного штамма бактерий Bacillus subtilis 8A, обладает более сильным воздействием на урожайность (продуктивность) льна масличного и подсолнечника масличного по сравнению с биопрепаратом Фитоспорин на основе штамма - прототипа Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ.

То есть результаты проведенных опытов подтверждают высокое качество биопрепарата на основе штамма Bacillus subtilis 8A и его соответствующую активность при возделывании сельскохозяйственных культур.

Таким образом, штамм эндофитных бактерий Bacillus subtilis 8A является пригодным для использования в сельском хозяйстве в качестве эффективного средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов и расширяет арсенал подобных средств.