способ микроклонального размножения подвоев яблони

Формула изобретения

Способ микроклонального размножения подвоев яблони, отличающийся тем, что на этапах введения в культуру и собственно микроразмножения в среду Мурасиге-Скуга в качестве стимулятора роста добавляется препарат фуролан в концентрации 0,004 мг/л.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к микроклональному размножению сельскохозяйственных культур.

Наиболее часто в технологии микроклонального размножения с.-х. растений используют природные фитогормоны и их синтетические аналоги: цитокинины: природный - зеатин, синтетический - 6-бензиламинопурии (БАП), гиббереллины (ГК).

Известен способ клонального микроразмножения яблони, при котором для повышения относительного количества побегов длиной более 15 мм экспланты культивируют на средах, содержащих пониженные концентрации 6-бензиламинопурина (0,1-0,2 мг/л) [Высоцкий В.А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала и селекции плодовых и ягодных растений: автореф. дис. д-ра с.-х. наук: 06.01.07 и 03.00.12 / Высоцкий Валерий Александрович. - М., 1998. - 44 с.].

Недостатком способа является дороговизна используемого стимулятора 6-БАП.

Известен другой способ клонального микроразмножения плодовых культур, при котором на этапах введения в культуру и собственно микроразмножения вводятся в среду 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 1,5 мг/л и гиббереллиновая кислота (ГК) в концентрации 10 мг/л [Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными культурами/ под ред. Е.Н. Джигадло - Орел: ГНУ ВНИИСПК - 2005. - 51 с.].

Недостатками способа являются высокая себестоимость размноженных таким образом растений из-за высокой стоимости использованных препаратов, а также низкое качество оздоравливаемых растений (до 21% укорененных растений со стеблем более 15 мм, высокое каллусообразование и др.).

Техническим результатом изобретения является повышение при микроклональном размножении подвоев яблони, ряда показателей качества эксплантов; уменьшение стоимости этапа введения в культуру и собственно микроразмножения; снижение себестоимости оригинального посадочного материала, полученного с помощью технологии in vitro.

Технический результат достигается тем, что на этапах введения в культуру меристем в среду субстрата Мурасиге-Скуга в качестве стимулятора роста добавляется препарат фуролан, полученный на основе доступного и возобновляемого сырья - продукта фурфурольного производства и нефтехимии [Создание ресурсосберегающей технологии получения экологически чистого регулятора роста растений фуролан [Электронный ресурс]/ Косулина Т.П., Сухоцкий С.А., Саенко А.Г., Василии В.К. // Программа по сближению научной общественности Российской Федерации. - 2009. - Режим доступа: http:/www.rfcontact.ru/text/1214].

Для улучшения качества эксплантов размножаемых подвоев яблони обоснована концентрация фуролана - 0,004 мг/л. Фуролан в полевых условиях применяют как рострегулирующее вещество, повышающее урожай и качество сельскохозяйственной продукции, и как эффективное средство, повышающее устойчивость растений к неблагоприятным условиям произрастания: к засухе, засолению почвы, поражению грибковыми заболеваниями [Высокоэффективные, экологически чистые регуляторы роста растений, улучшающие качество сельскохозяйственной продукции / Косулина Т.П., Калашникова В.Г., Барчукова А.Я., Маслов С.В., Лукаш P.M. - Краснодар: Кубанский государственный технологический университет., 2010. - 8 с.]. В культуре in vitro данный препарат еще не был испытан.

В результате проведенного исследования и сравнения с контролем было установлено, что на средах с добавлением фуролана в указанной концентрации экспланты по комплексу показателей качества значительно превосходят контроль.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1 (контроль). Способ заключается в том, что приготавливают питательную среду по прописи Мурасиге-Скуга (Состав среды, мг/л: NH₄NO₃ - 1650, KNO₃ - 1900, CaCl₂, 2H₂O - 440, MgSO₄·7H ₂O - 370, KH₂PO₄ - 170, H₃ BO₃ - 6,2, MnSO₄·4H₂O - 22,3, CoCl₂·6H₂O - 0,025, CuSO ₄·5H₂O - 0,025, ZnSO₄·7H ₂O - 8,6, NaMoO₄·7H₂O - 0,25, KI - 0,83, FeSO₄·7H₂O - 27,8, Тиамин хлорид - 0,5, Пиридоксин хлорид - 0,5, Никотиновая кислота - 0,5, Мезоинозит - 100, Агар - 5000, вода до 1 л), в среду добавляют регуляторы роста 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 1,5 мг/л и гиббереллиновую кислоту (ГК) в концентрации 10 мг/л, pH раствора доводят до 5,6. Приготовленный раствор нагревают до 95°C, разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 1 атм, 120°C в течение 15-20 минут. После этого в ламинарбоксе высаживают на питательную среду простерилизованные апексы терминальных участков однолетних побегов (верхушек) или пазушных почек подвоя ММ 106, изолированных с отрезком стебля.

Пример 2. Использование на этапе введения в культуру и собственно микроразмножения среды Мурасиге-Скуга (аналогично примеру 1) с добавлением фуролана в концентрации 0,004 мг/л вместо 6-БАП и ГК. Препарат испытывали при микроклональном размножении среднерослого подвоя яблони ММ 106 на этапах введения в культуру и собственно микроразмножения. Повторность опыта 5-кратная, по 10 пробирок с эксплантами в повторности.

Пример 3. Аналогично примеру 2, карликовый подвой СК 4 (селекция СКЗНИИСиВ).

Экспланты на среде с фуроланом в концентрации 0,004 мг/л по всем показателям качества значительно превосходят контроль.

На данной среде микрорастения в среднем образуют на 2 листа больше, чем в контрольном варианте, причем больше (на 18,3-20%) листьев имеют здоровую интенсивно зеленую окраску; на 33-39,5% больше эксплантов образуют стебель, длиной более 15 мм, такие экспланты лучше укореняются на следующем этапе микроразмножения; коэффициент размножения на 4 единицы превышает контроль; практически отсутствует явление зарастания эксплантов каллусом (0 и 3,7% микрорастений образовали каллус, в контрольном варианте 45%); по качественному состоянию микропобеги на 0,8-1,0 балла превосходят контроль.

Таблица
Состояние эксплантов на средах с различными ростовыми веществами после 1-го пассажа
Ростовое вещество	Число листьев на одном экспланте	Коэффици ент размноже ния	Общее состояние микрорастений по 5-балльной шкале	Число растений с интенсив ной зеленой окраской листьев, %	Число растений со стеблем более 15 мм, %	Число растений с каллусом, %
Пример 1 (контроль)	4,0	1:3	3,5	40,0	21,0	45,0
Пример 2 Фуролан 0,004 мг/л, ММ 106	7,1	1:7	4,3	58,3	54,0	3,7
Пример 3 Фуролан 0,004 мг/л, подвой СК 4	7,5	1:7	4,5	60,0	60,5	0,0

Сортовые особенности подвоев проявились незначительно, главным фактором, определяющим качество микрорастений, оказалось присутствие и концентрация стимулятора роста (см. табл.).

Таким образом, фуролан в концентрации 0,004 мг/л можно использовать для получения качественных, здоровых, хорошо укореняющихся в дальнейшем микропобегов подвоев яблони длиной более 15 мм, то есть данный препарат можно использовать вместо 6-бензиламинопурина (6-БАП) и ГК, что позволит значительно удешевить технологию, так как стоимость препарата фуролан (1 г - 10 р.) в 20 раз меньше стоимости 6-БАП (1 г - 198,9 р.) и в 50 раз меньше стоимости ГК (1 г - 500 р.)