способ стерилизации питательных сред

Формула изобретения

1. СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, включающий термическую обработку среды, отличающийся тем, что перед термической обработкой среду подкисляют минеральными или органическими кислотами или их сочетанием, а после термической обработки нейтрализуют посредством щелочных растворов до значения pH, оптимального для последующего использования, при этом кислоты и соответствующие щелочи выбирают, исходя из условия полного или частичного защемления той или иной соли, входящей в состав среды.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что среду подкисляют до значения pH 1 5.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что среду подкисляют до значения pH 2,7 3,5.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что термическую обработку подкисленной среды проводят при 70 120^oС.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что термическую обработку ведут при 90 100^oС.

6. Способ по пп. 1, 4 и 5, отличающийся тем, что термическую обработку ведут в течение 30 120 мин.

7. Способ по пп. 1, 4 и 5, отличающийся тем, что термическую обработку ведут в течение 40 60 мин.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для нейтрализации используют стерильные растворы гидроокисей, карбонатов и гидрокарбонатов щелочных и щелочноземельных металлов и аммиака.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам стерилизации питательных сред, предназначенных для культивирования микробных и других продуцентов.

Предлагаемый метод может быть использован для стерилизации питательных сред разнообразного состава, используемых в микробиологических и других производствах, а также для дезинфекции органических отходов животноводческих, птицеводческих ферм, отходов микробиологических производств, сточных вод, почвы и т.д. Кроме того, метод может быть использован в пищевой промышленности для стерилизации фруктовых и овощных соков, пюре, вин и т.д.

Хорошо известно, что органические и неорганические компоненты питательных сред в значительной степени обсеменены посторонней микрофлорой. В частности, высокой обсемененностью отличаются мелассы, крахмал и крахмалсодержащее сырье (мука различного происхождения) автолизаты дрожжей, БВК, кукурузный экстракт, кислотные и ферментативные гидролизаты белков и т.д.

Для микробиологических производств особую опасность представляет микробная контаминация, т.е. присутствие в средах вегетативных клеток и спор (в особенности термоустойчивых спор). Несколько меньшее значение может иметь вирусная контаминация. Что касается органических отходов сельскохозяйственных ферм, сточных вод, почвы, то здесь наибольшую опасность представляют клетки патогенных микроорганизмов, вирусов, клетки Protozoa, яйца гельминтов а также зародыши (семена) сорных растений.

Существующие методы стерилизации питательных сред основаны главным образом на использовании высоких температур (автоклавирование при 120-160^оС. Недостатками этого способа являются высокие затраты тепловой энергии на стерилизацию и частичное разрушение органических компонентов питательных сред, в особенности сахаров, идущее при высоких температурах. Так, при стерилизации в автоклаве при 120^оС и выше идут реакции карамелизации сахаров (меланинообразования) а также реакции сахаров с аминокислотами (меланоидинообразования). Визуально это проявляется в том, что среды после автоклавирования изменяют окраску (буреют). В результате разрушения сахаров снижается выход конечных продуктов ферментации. При достаточно жесткой температурной обработке в некоторых случаях могут образовываться соединения, ингибирующие рост культуры продуцента.

Делались многократные попытки разработать и внедрить в микробиологическое производство альтернативные методы стерилизации. В частности, описаны способы так называемой химической стерилизации питательных сред. В качестве биоцидов (или деконтаминантов), т.е. химических агентов, обладающих способностью убивать вегетативные клетки и споры микроорганизмов а также вирусы, наиболее известны окислители (перекись водорода, озон, этиленоксид, пропиленоксид), галогенсодержащие соединения, альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид), азид натрия, бета-пропиолактон, гидроксиламин, гидразин, соединения четвертичного аммония и др. Перечисленные соединения широко используются как по отдельности, так и в виде смесей в качестве дезинфектантов.

Как показано в эксперименте, бактериальные споры в 100-1000 раз более резистентны к теплу и к химическим агентам, чем вегетативные клетки. При действии окиси этилена эта разница не наблюдается. Окись этилена очень активный деконтаминант. С помощью окиси этилена можно стерилизовать агар, пептон, крахмал, различные сахара, декстрин, гликоген (Матвеев В.Е. Смирнов Е.В. Термическая стерилизация растворов сахаров. ОНТИТЭИ. Главмикробиопром, 1976). Весьма эффективным деконтаминантом является также бета-пропиолактон. Это вещество в 25 раз эффективнее формальдегида и в 4000 раз окиси этилена (цит. по Матвеев, 1981).

Вышеперечисленные бактерициды в настоящее время тем не менее не используются для стерилизации питательных сред в микробиологических производствах. Основными причинами этого являются высокая токсичность этих соединений для человека и животных, трудности, связанные с полной инактивации биоцидов после стерилизации (что предполагает внесение в среду дополнительных реагентов, инактивирующих биоциды), а также в связи с тем, что биоциды взаимодействуют с компонентами среды и изменяют ее состав (так, альдегиды взаимодействуют с аминогруппами белков и пептидов, окислители изменяют окислительно-восстановительный потенциал среды и т.д.).

Известно, что бактерицидными свойствами обладают также органические и неорганические кислоты. В частности отмечалось, что при кислых значениях рН стерилизация питательных сред идет более эффективно. В отличие от многих других биоцидов, кислоты не являются токсичными соединениями, при их нейтрализации щелочами образуются безвредные соли.

Szepessy at all. 1983 (Патент США, N 4817333) описывают процесс кислотно-основной дезинфекции семян. С целью борьбы с нематодами и патогенными микроорганизмами, поражающими растения риса, семена последнего обрабатывают при комнатной температуре раствором минеральной или органической кислот в концентрации 1-10 г/л в течение нескольких часов (обычно 3 ч). Кислоту затем нейтрализуют порошком щелочи или карбонатом щелочных или щелочноземельных элементов. При такой обработке полностью погибают как нематоды, так и патогенные микроорганизмы. Семена растений при этом не теряют всхожести.

Ueno et all. 1983 (Патент США, N 4647458) для стерилизации некоторых пищевых продуктов (ветчины, колбас, цыплят и др.), а также машин и оборудования для пищевой промышленности предлагают бактерицид, состоящий из синергической смеси этилового спирта и органической плюс фосфорной кислот. В предлагаемых смесях концентрация этанола варьирует от 1 до 14% органической кислоты от 0,3 до 13% фосфорной кислоты от 0,03 до 0,7% Бактерицидные смеси достаточно эффективны и полностью убивают используемые тест-культуры (клетки E. coli) в течение 30 с. Важно отметить, что в предлагаемых смесях концентрация кислот должна обеспечить рН раствора ниже 4,0. При рН больше 4,0 эффективность бактерицидной смеси снижается. В цитируемой работе авторы, однако, не исследовали активность предлагаемых синергических смесей по отношению к бактериальным спорам. Несмотря на то, что в литературе неоднократно отмечалось улучшение эффективности стерилизации сред при подкислении, однако глубоко и систематически этот вопрос не был изучен. Методы стерилизации, использующие подкисление сред для смягчения температурных режимов тепловой обработки не известны.

Таким образом, несмотря на большое количество исследований, посвященных разработке методов химической (термохимической) стерилизации, ни один из предлагаемых способов в настоящее время не нашел применения в микробиологическом производстве. Стерилизация питательных сред на микробиологических заводах по прежнему осуществляется путем нагрева нейтральной (в смысле рН) среды под избыточным давлением, т.е. при температуре, превышающей 120^оС.

Цель изобретения разработка метода стерилизации, дающего возможность снизить температуру тепловой обработки питательных сред и обеспечивающего абсолютную стерильность сред при практически полной сохранности питательных компонентов.

Вышеуказанная цель может быть достигнута путем подкисления среды до значений рН от 1 до 3,5.

Метод термохимической стерилизации заключается в следующем.

В сочетании с температурным фактором, органические и неорганические кислоты, наряду с бактерицидной, обладают спороцидной активностью. При этом спороцидная активность при данной температуре пропорциональна концентрации водородных ионов, т. е. возрастает с понижением рН. Так, при рН 3,0 полная стерилизация питательных сред различного состава достигается при 90^оС в течение 40 мин. При последующей нейтрализации кислоты стерильной щелочью можно получить среды пригодные для культивирования микроорганизмов. Таким образом, путем подкисления питательных сред минеральными или органическими кислотами можно снизить температуру их стерилизации на 30-40^оС, по сравнению со стерилизацией при нейтральных значениях рН, при том же времени температурной обработки.

Предлагаемый метод мягкой стерилизации является по своей сущности разновидностью термохимической стерилизации, т. е. сочетает в себе два способа стерилизации тепловую и химическую.

Допустимая кислотность, при которых тепловая обработка достаточна для стерилизации и не влияет на ферментацию, зависит от природы штамма-продуцента, температуры тепловой обработки и выбранной кислоты (щелочи). рН сред, подвергаемых стерилизации, в общем случае может варьировать от 1 до 4,0, а температура от 70^о до 100^оС при времени обработки от 30 мин до 2 ч. Оптимальные значения рН, достаточные для полной стерилизации сред при 90-100^оС в течение 40-60 мин, расположены в области от 2,7 до 3,5. Расход кислот для достижения указанных рН зависит от состава питательных сред и варьирует от 0,1 до 2-3% В вышеуказанном интервале рН ферменторное оборудование микробиологических производств обладает достаточной коррозионной устойчивостью.

Стерилизация при кислых значениях рН в допустимых пределах кислотности не сопровождается разрушением органических компонентов среды (в частности, сахаров и аминокислот) и не приводит (что очень важно) при последующей нейтрализации кислоты щелочью, к замедлению скорости роста культуры продуцента или к снижению выхода конечных продуктов ферментации. Среды, повергнутые кислотной стерилизации при 70-100^оС, визуально не изменяют своей пигментации. Действительно, согласно литературным данным стерилизация водных растворов глюкозы а также фруктозы, мальтозы, арабинозы при кислых значениях рН (при рН 3-4) способствует большему сохранению сахара, чем при нейтральном значении рН среды (Матвеев, 1981). Что касается сахарозы, то этот сахар при тепловой обработке наиболее устойчив при рН 8,5. Однако, даже если при рН 3,0 и происходит частичный гидролиз сахарозы, то продукты этого гидролиза фруктоза и глюкоза, устойчивы к разрушению и наравне с сахарозой одинаково хорошо утилизируются различными продуцентами. При значениях рН 2,7-3,5 и температуре ниже 100^оС не происходит также заметного разрушения аминокислот. Действительно, на примере аланина и глицина показано, что скорость разложения аминокислот при температурной обработке (130^оС) максимальна при рН 5-7, а при кислых и щелочных значениях рН резко понижается (Матвеев В.Е. Научные основы микробиологической технологии. М. Агропроиздат, 1958). Режим кислотной стерилизации является также щадящим по отношению к витаминам.

Важным моментом в изобретении является выбор кислоты и соответствующего основания для стерилизации. При мягкой (кислотной) стерилизации во многих случаях не изменяется минеральный состав среды, поскольку выбор соответствующих кислот (и щелочей) для стерилизации производится, исходя из состава конкретной среды, а именно, замещая частично или полностью ту или иную соль, входящую в среду, на соответствующую кислоту и основание. Для кислотной стерилизации могут быть использованы следующие кислоты: соляная, серная, фосфорная, азотная, муравьиная, уксусная, молочная, пропионовая и другие кислоты, а также их сочетания. В том случае, если в прописи питательной среды соли отсутствуют, выбор кислоты для мягкой стерилизации производится экспериментальным путем, т.е. берутся те кислоты, соли которых при соответствующих концентрациях не ингибируют рост культуры продуцента и не влияют отрицательным образом на выход продуктов ферментации.

Нейтрализация кислот после температурной обработки производится стерильными растворами щелочей: NaOH, KOH, NH₄OH, Ca(OH)₂, Mg(OH)₂, либо карбонатами щелочных или щелочноземельных элементов: Na₂CO₃, K₂CO₃, CaCO₃, MgCO₃, (NH₄)₂CO₃ и др. рН среды доводится до нужного значения оптимального для развития того или иного продуцента. Сначала вносится расчетное количество щелочи, эквивалентное количеству внесенной ранее кислоты, затем производится тонкая доводка рН с помощью цветных индикаторов или рН-метра.

Согласно полученным данным при значениях рН по крайней мере выше 2,5, и при комнатной температуре споры многих микроорганизмов могут весьма продолжительное время не терять своей жизнеспособности. Вегетативные клетки при кислых значениях рН (ниже 3,5), наоборот, погибают достаточно быстро. Среды с кислыми значениями рН, таким образом, самоочищаются от клеток многих неспорообразующих микробов. Это свойство водородных ионов может быть использовано для кратковременного (в течение нескольких суток) хранения еще нестерильных питательных сред на микробиологических заводах. Достаточно быстрая гибель спор в интервале рН 2,5-3,5 происходит лишь при 70-100^оС.

Спороцидная активность кислот связана со способностью ионов Н⁺ вызывать апуринизацию ДНК. Этот процесс, как известно из литературных данных, эффективно идет при рН ниже 4,0. Отсутствие спороцидного эффекта разбавленных кислот при комнатной температуре, по видимому, связано с тем, что ионы Н⁺ не могут быть при этой температуре проникнуть сквозь дегидратированную белковую оболочку спор. При 70-100^оС происходит гидратация оболочки спор и ионы Н⁺ достигают ДНК. Если механизм действия кислот именно такой, то это означает, что биоцидная активность кислот крайне велика и распространяется на вирусы. Protozoa, яйца гельминтов, семена сорняков и т.д.

П р и м е р 1. Мягкая стерилизация среды для продуцента лизина.

В опытах по ферментации продуцента лизина Соrynebacterium glutamicum штамм ВНИИгенетика 95-10, использовали среду следующего состава:

Меласса свекловичная 26 мас.

Кукурузный гидролизат 6 об.

К₂НРО₄ 0,2%

MgSO₄ 7H₂O 0,15%

(NH₄)₂ SO₄ 2%

NH₄ Cl 1,5%

CaCO₃ 3%

рН среды 6,9 7,1, доводится до нужного значения с помощью 40%-ного NaOH перед стерилизацией. Принятый режим стерилизации 0,8 атм, 30 мин. При стерилизации автоклавированием меласса разводится водопроводной водой в 1,5 раза и стерилизуется вместе с СаСО₃. Остальные компоненты стерилизуются вместе.

Для опыта по ферментации в колбах приготовили три порции среды по 200 мл. Одну порцию среды стерилизовали в автоклаве (контроль). Две другие порции стерилизовали при 90^оС в присутствии соляной кислоты. Для этого все компоненты среды (за исключением СаСО₃, который стерилизовали отдельно) объединяли в одной колбе, доводили объем до 195 мл водопроводной водой. Количество вносимого в среду NH₄Cl уменьшали с учетом количества HCl, идущего на стерилизацию среды. К полученной смеси добавляли различные количества конц. HCl (33% ) до рН 2,7, в одном варианте и рН 3,0 в другом варианте. рН среды контролировали с помощью рН-метра. Расход конц. НСl составлял около 2 об.

После подкисления и проверки рН растворы аккуратно переносили в стерильные флаконы (на 500 мл) с ватными пробками и прогревали в водяном термостате при 90^оС в течение 40 мин. (без учета времени, необходимого для нагрева содержимого флакона до 90^оС, составляющего 15-20 мин). Периодически флаконы со средой перемешивали. После температурной обработки среды охлаждали, затем проводили нейтрализацию кислоты стерильным раствором аммиака (25%). рН среды доводили до 6,9-7,0 с помощью рН-метра. Проверку на стерильность проводили путем высева нейтрализованной среды на чашки с питательным агаром (обычно использовали агар Хоттингера). Чашки инкубировали при 37^оС в течение 3 сут. Во всех случаях стерильность была полной.

Стерильную среду разливали по 20 мл в стерильные качалочные колбы с предварительно внесенным СаСО₃. В колбы со средой вносили культуру штамма продуцента. Выращивание клеток проводили на качалке при 30^оС в течение 96-ти ч. Концентрацию лизина в среде определяли хроматографически. В проведенных экспериментах на средах, подвергнутых мягкой стерилизации, выход лизина был на уровне контроля и составлял около 70 г/л.

П р и м е р 2. Мягкая стерилизация питательной среды для молочно-кислых бактерий.

Для культивирования клеток молочно-кислых бактерий Streptococcus faecium и Bifidum bacterium использовали среду следующего состава,

Кукурузный экстракт 0,9 (V/V)

Меласса свекловичная 1,5 (V/V)

K₂HPO₄ 0,02 (W/V)

KH₂PO₄ 0,02

NaNO₃ 0,3

Микроэлементы:

MnSO₄, ZnSO₄, CoSO₄ по 0,0005

СаСО₃ 0,6

Молочная сыворотка до 100; рН среды 6,6-6,9.

Режим стерилизации нейтральной среды при избыточном давлении 0,8 атм в течение 30 мин. При стерилизации все компоненты среды могут находиться вместе. рН среды доводится до нужного значения перед автоклавированием.

Для опыта приготовили две порции среды по 300 мл. Одну порцию, содержащую все компоненты, разлили по 50 мл во флаконы с ватными пробками (на 200 мл) и стерилизовали в автоклаве (контроль). Вторую порцию, содержащую все компоненты, за исключением СаСО₃, стерилизовали в присутствии соляной кислоты. Для этого с помощью конц. НСl рН среды доводили до значения 2,7 в одном случае, и 3,0 в другом случае. Подкисленную среду разливали в стерильные флаконы (на 200 мл) с ватными пробками, по 50 мл в каждый флакон. Флаконы прогревали в водяном термостате при 90^оС в течение 60 мин. (20 мин нагрев до 90^оС и 40 мин инкубировали при этой температуре). Периодически флаконы со средой перемешивали. После инкубации при 90^оС среды охлаждали, кислоту нейтрализовали стерильным раствором NH₄OH (25%). рН среды доводили до нужного значения с помощью индикатора бромтимол голубого и проверяли на стерильность путем высева аликвот на чашки с агаром Хоттингеpа а также путем длительного инкубирования сред при 37^оС. Во всех случаях стерильность была полной. Приготовленные стерильные среды в течение 3-х суток находились в термостате при 37^оС и не прорастали.

Нейтрализованные стерильные среды разливали в стерильные флаконы по 50 мл, вносили стерильный мел (СаСО₃) и затем инкубировали свежей культурой молочнокислых бактерий. Выращивание клеток производили стационарно (без встряхивания) при 37^оС в течение 18 ч. Титр клеток определяли путем высева аликвот из соответствующих разведений на чашки с мясо-пептонным агаром (МПА) и инкубирования чашек при 37^оС в течение 18-24 ч. В проведенных опытах в жидких средах, подвергнутых мягкой стерилизации, титр клеток составлял: B. bifidum (1,09 1,30) x 10⁹; Str. faecium (4,12 5,95) x 10⁹. Близкие значения титра клеток были получены и в контроле, т.е. на средах, подвергнутых автоклавированию. Различий в скорости развития культур также не наблюдалось.

П р и м е р 3. Мягкая стерилизация среды для продуцента рибоксина.

Культивирование клеток Bacillus subtilis штамм ВНИИгенетика 265-76 продуцента рибоксина производили на среде следующего состава,

Глюкоза 12

БВК 2,5

NH₄NO₃ 2,0

MgCl₂ 0,5

СaСО₃ 2,0 рН среды 6,8-7,0, подводится добавлением 40%-ного КОН до автоклавирования. Принятый режим автоклавирования 0,8 атм. 30 мин. При стерилизации автоклавированием все компоненты среды, кроме СaСО₃, могут находиться вместе. СаСО₃ стерилизуется отдельно.

Для опыта приготовили 1000 мл среды. Из этого объема 200 мл стерилизации в автоклаве (контроль). В этом случае рН среды предварительно довели до нужного значения. Оставшиеся 800 мл среды разделили на 8 порций по 100 мл. Для подкисления сред использовали конц. НСl и конц. Н₂SO₄. Количество добавленной кислоты и установившаяся кислотность сред (рН) представлены в табл. 1.

После подкисления среды переносили в стерильные флаконы (на 200 мл) с ватными пробками. Флаконы прогревали в водяном термостате при 90^оС в течение 60 мин (20 мин нагрев до 90^оС и 40 мин. выдерживание при этой температуре). Периодически содержимое флаконов перемешивали встряхиванием. После температурной обработки среды охлаждали и нейтрализовали кислоту с помощью стерильного 40%-ного КОН. рН доводили до 6,8-7,0. После доведения рН среды проверяли на стерильность. Во всех случаях стерильность была полной. Среды по крайней мере в течение 2-х недель могли находиться при комнатной температуре и не прорастать.

Для ферментации в качалочные колбы вносили стерильный СаСО₃ и 25 мл стерильной среды. Среды затем инокулировали свежей культурой продуцента. Культивирование клеток осуществляли на качалке при 34^оС в течение 6 сут. Результат опыта представлен в табл. 1.

Как видно из представленной таблицы, на средах, подвергнутых мягкой стерилизации, выход рибоксина повышается на 3-5% по сравнению с контролем (в контроле выход рибоксина составлял 35 г/л). По всей видимости это связано с тем, что при мягкой стерилизации не разрушаются компоненты среды, в частности глюкоза.

Опыт по мягкой стерилизации среды для продуцента рибоксина был повторен с тем отличием, что тепловую обработку вели на кипящей водяной бане (при 98^оС), при том же времени обработки. Результат ферментации при этом был тот же выход рибоксина был выше контроля на 3-5%

П р и м е р 4. Мягкая стерилизация среды для продуцента инозиновой кислоты.

Продуцент инозиновой кислоты клетки Brevibacterium ammonoagenes штамм 79-5 (ВНИИгенетика) выращивали на среде следующего состава,

Глюкоза 12

Кукурузный экстракт 5

КН₂РО₄ 3,0

MgSO₄ 1,0

Мочевина 0,72

Принятый режим стерилизации автоклавированием при 0,8 атм 30 мин. Мочевина стерилизуется отдельно при 0,5 атм. 30 мин.

рН среды подводится после автоклавирования с помощью стерильного 40%-ного КОН до 7,0.

Для опыта приготовили 300 мл среды (все компоненты без мочевины). Одну порцию среды объемом 100 мл стерилизовали автоклавированием (контроль). Вторую порцию (200 мл) стерилизовали путем добавления соляной кислоты. Для этого к раствору добавили конц. НСl из расчета 1 мл кислоты на 100 мл среды. рН среды при этом составил 2,33. Подкисленную смесь перенесли в стерильные флаконы с ватными пробками и прогревали в течение 1 ч в водяном термостате при 90^оС. После температурной инкубации флаконы охлаждали и кислоту нейтрализовали стерильным раствором 40%-ной КОН. К нейтрализованной смеси (рН около 6,0) добавляли стерильную мочевину, и лишь затем рН среды доводили щелочью до 7,0.

Полученные среды были абсолютно стерильны и не прорастали при хранении в течение двух недель при комнатной температуре.

Культивирование клеток продуцента инозиновой кислоты проводили в качалочных пробирках. В пробирку вносили по 10 мл среды и инокулировали культурой клеток продуцента. Выращивание осуществляли на качалках при интенсивной аэрации при 34^оС в течение 6 сут.

Определение концентрации инозиновой кислоты в КЖ проводили хроматографически. Как оказалось, выход инозиновой кислоты на средах, подвергнутых мягкой стерилизации, на 3-5% превышал уровень инозиновой кислоты в контроле.

П р и м е р 5. Мягкая стерилизация среды для продуцента рибофлавина.

Продуцент рибофлавина штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика 1-304/рМХ45. В опытах по ферментации в качалочных колбах использовали среду следующего состава, БВК 2 Сахароза 10 MgSO₄ 0,05 Мочевина 0,6

рН среды 6,5-7,0, доводится с помощью 40%-ного КОН. Режим стерилизации нейтральной среды 0,8 атм. 30 мин. Мочевина (60%-ный раствор) стерилизуется отдельно.

Для опыта приготовили 1000 мл среды, содержащей все компоненты за исключением мочевины. Одну порцию среды (200 мл) стерилизовали автоклавированием (контроль). Остальную часть стерилизовали мягким способом. Для этого в отдельные порции среды объемом по 100 мл вносили различные количества конц. НСl или конц. Н₃РО₄. Количества вносимой кислоты и установившиеся при этом значения рН представлены в табл. 2.

Подкисленные растворы переносили в стерильные флаконы с ватными пробками. Флаконы со средой прогревали в течение 1 ч на кипящей водяной бане (т. е. при 98^оС). После температурной обработки флаконы со средой оставляли при комнатной температуре на ночь. Затем проводили нейтрализацию кислоты с помощью 40%-ного КОН. Перед нейтрализацией в подкисленную среду вносили стерильную мочевину (1 мл 60%-ного раствора на 100 мл среды). рН доводили до нужного значения с помощью индикатора бромтиол голубого. Готовую среду проверяли на стерильность и разливали затем в качалочные колбы (на 750 мл) по 25 мл в каждую колбу. В колбы вносили посевной материал. Культивирование клеток продуцента производили при 37^оС в течение трех суток.

Концентрацию рибофлавина в КЖ определяли спектрофотометрически.

Как оказалось (см. табл. 2), выход рибофлавина на среде, подвергнутой мягкой стерилизации, превышал таковой на среде, подвергнутой автоклавированию, на 3-4%

В другом эксперименте клетки штамма продуцента рибофлавина культивировали на лабораторном ферментере (фирмы Hitachi) объемом 1 л. В этом случае основная среда содержала, БВК 2 MgSO₄ 0,05 (NH₄)₂SO₄ 0,2 Пеногаситель 0,1

Среда для подпитки содержала: 1. Сахар 50 2. Кукурузный экстракт 6

Для опыта приготовили две порции основной среды по 700 мл и две порции подпитки по 250 мл. К 700 мл основной среды в одном случае добавили 0,45 мл конц. Н₂SO₄ до рН 2,30; в другом случае 0,4 мл конц. Н₂SO₄ до рН 2,95. К 250 мл подпитки также добавили конц. Н₂SO₄, в одном случае 0,45 мл до рН 2,3, в другом случае 0,35 мл до рН 2,65.

После подкисления среды перенесли в стерильные флаконы (на 1,5 и 0,5 л) с ватными пробками. Флаконы со средами прогревали в течение 60 мин на кипящей водяной бане. После температурной обработки флаконы остужали при комнатной температуре и производили проверку кислых сред на стерильность (высев 0,2-0,3 мл среды на чашки с агаром Хоттингера).

Во всех случаях стерильность была полной.

Для нейтрализации кислоты во флаконы вносили расчетное количество стерильного раствора 40% -ного NaOH. Тонкую доводку рН ферментационной среды (основной) производили в ферментере с помощью автоматической подачи 7%-ного раствора NH₄OH.

Ферментацию проводили в течение 3 сут с подпиткой и автоматической подтитровкой до рН 7,0 при интенсивной аэрации и перемешивании. В контрольном опыте ферментацию проводили на среде, подвергнутой автоклавированию.

В ходе проведенных ферментаций выход рибофлавина на средах с мягкой стерилизацией был несколько выше (на 3%) по сравнению с контролем.

П р и м е р 6. Мягкая стерилизация питательной среды для продуцента хлортетрациклина.

Опыты по ферментации штамма Streptomyces aureofaciens 737 (ВНИИгенетика) проводили на среде следующего состава, Кукурузная мука 8 Кукурузный экстракт 0,8 Кормобактерин 0,25 NH₄Cl 0,4 NH₄NO₃ 0,6 (NH₄)₂ HPO₄ 0,035 Жир (рыбий) 3,0 СаСО₃ 0,8 рН среды 6,7-6,9, подводится с помощью раствора NaOH перед стерилизацией. Режим стерилизации нейтральной среды автоклавирование при 0,8 атм. 30 мин. Перед стерилизацией среда заваривается при 95-100^оС в течение 5 мин, после этого для снижения вязкости в среду добавляется амилоризин в концентрации 0,001% При автоклавировании все компоненты за исключением СаСО₃ присутствуют вместе.

Для опыта приготовили 5 порций среды по 100 мл каждая. Одну порцию, содержащую все компоненты, но без мела, разлили в качалочные колбы по 25 мл и стерилизовали в автоклаве. (Мел стерилизовали отдельно). Остальные порции не содержали NH₄Cl и СаСО₃, их стерилизовали мягким способом. (Мел вносили в качалочные колбы и стерилизовали автоклавированием). Для стерилизации к отдельным порциям среды добавляли различные количества концентрированной НСl из расчета 1,5, 1,0, 0,75 и 0,5% Среды тщательно перемешивали, переносили в стерильные флаконы с ватными пробками и инкубировали в водяном термостате при 90^оС в течение 60 мин. После температурной обработки среды охлаждали до комнатной температуры и нейтрализовали кислоту добавлением стерильного 25% -ного аммиака. (При нейтрализации образуется NH₄Cl, который является компонентом среды). Стерильность определяли путем высева 0,4 мл среды на чашки с агаром Хоттингера и параллельно путем внесения 0,4 мл среды в пробирки с бульоном Хоттингера и последующего инкубирования пробирок при 37^оС в течение 3 сут. Во всех случаях стерильность была полной. Стерильные среды разливали затем (по 25 мл) в качалочные колбы, содержащие СаСО₃.

Выращивание производили при 32^оС на качалке при 240 об/мин в течение 144 ч. Определение концентрации хлортетрациклина производили после 2-х, 3-х сут инкубирования и в конце ферментации.

Как оказалось, при концентрации НСl, равной 1,5 и 1% имеет место замедление скорости споруляции по сравнению с контролем. Выход антибиотика также был снижен. При концентрации НСl, равной 0,75 и 0,5% развитие культуры и ее споруляция шли нормально. Выход хлортетрациклина также соответствовал контролю и составлял 1500 мкг/мл.

П р и м е р 7. Мягкая стерилизация среды для культуры клеток женьшеня.

Среда для культивирования культуры клеток женьшеня включала следующие компоненты, мг/л: Гидролизат казеина 500 Сахароза 30 Мезоинозит 80 NH₄NO₃ 820 KNO₃ 950 CaCl₂ (безводн.) 220 MgSO4 185 КН₂РО₄ 85

Набор микроэлементов:

Fe-хелат (FeSO₄7H₂O

плюс трилон Б) Тиаминхлорид 0,4 Альфа-нафтилуксусная к-та 2 Кинетин 2

Исходный рН среды 7,15; после стерилизации 6,6-6,7.

Принятый режим стерилизации автоклавирование при 0,8 атм в течение 30 мин.

Приготовление питательной среды.

Отдельно готовятся и стерилизуются 1) раствор солей (компоненты 4-8), 2) раствор микроэлементов, 3) раствор Fe-хелата, 4) раствор тиаминхлорида, 5) раствор нафтилуксусной кислоты, 6) раствор кинетина. Перед стерилизацией компоненты смешиваются, доводится объем дистиллированной водой до 1 л, смесь разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют в автоклаве.

Для опыта приготовили 1000 мл среды. Из этого количества 400 мл среды разлили в колбы по 100 мл и стерилизовали автоклавированием (контроль). Оставшиеся 600 мл среды стерилизовали мягким способом. Для этого отдельные порции среды по 100 мл подкисляли с помощью концентрированных соляной, серной или фосфорной кислот или смеси этих кислот. Количество добавленных в среду кислот и рН сред представлены в табл. 3.

Подкисленные среды переносили в стерильные флаконы с ватными пробками и прогревали на кипящей водяной бане 60 мин. После этого флаконы со средами охлаждали при комнатной температуре и кислоту нейтрализовали стерильным раствором 10% -ной NaOH. рН сред контролировали индикатором бромтимол голубым.

Готовые среды хранились при комнатной температуре в течение 2-х недель. Стерильность была полной среды не прорастали. Стерильные среды после этого были использованы для выращивания культуры клеток женьшеня. Выращивание производили в качалочных колбах со 100 мл среды при интенсивном встряхивании в течение 7 сут при 30^оС. Рост культуры клеток на средах, подвергнутых мягкой стерилизации, не отличался от контроля.

Приведенные выше примеры показывают, что предлагаемый метод обеспечивает абсолютную стерильность питательных сред уже при температурах ниже 100^оС при времени тепловой обработки 40-60 мин. Минимальное значение рН среды, достаточное для достижения полной стерильности в вышеуказанном режиме тепловой обработки, ниже 3,5. Увеличение концентрации ионов [H+] (понижение рН до 3,0 и ниже) позволяет снизить температуру нагрева среды до 90^оС и даже еще ниже при том же времени (40-60 мин) тепловой обработки.

Важно подчеркнуть, что для некоторых сред существуют границы рН, ниже которых закислять среды не следует, поскольку это может сказаться отрицательным образом на скорости роста продуцента и на выходе конечных продуктов ферментации.

Наиболее оптимальные значения рН для мягкой стерилизации, при котором минимален расход кислот и соответствующих оснований, минимально воздействие (коррозия) на ферменторное оборудование, минимальное разрушение компонентов среды и не изменяется существенно состав среды. Обычно это рН 2,7-3,5 (при температуре нагрева 90-100^оС и времени инкубирования в течение 40-60 мин). Заявленный рН сред для кислотной стерилизации 1-5,0.

При рН выше 3,5 (в области 3,5-5,0) тепловая обработка среды должна проводиться уже при температуре выше 100^оС, а именно в интервале 100^оС до 110-115^оС (при том же времени температурной обработки, равном 40-60 мин.).

Для подкисления сред и достижения нужного значения рН (от 2,7 до 3,5) во многих случаях достаточно 0,1-0,3% (V/V) минеральной кислоты. В случае мелассных а также мучных сред, отличающихся большой буферной емкостью, требуется до 1-2% кислоты. Однако даже в этих случаях использование кислоты будет рентабельно и даст некоторую экономию уже по той причине, что стоимость кислоты и щелочи всегда ниже стоимости соответствующей соли, образующейся при их взаимодействии.

Таким образом, предлагаемый метод за счет подкисления среды позволяет снизить температуру стерилизации на 30-40^оС, что должно дать значительную экономию тепловой энергии, идущей на стерилизацию.

Предлагаемый метод является универсальным, т.е. может быть использован для стерилизации сред самого разнообразного состава, пригодных для культивирования как бактериальных и грибных продуцентов, так и для культивирования культур клеток растений и животных. При этом метод пригоден для стерилизации как жидких, так и твердых (агаризованных) сред. В последнем случае нейтрализация кислоты должна проводиться при температуре выше температуры застывания агара.

Предлагаемый метод является экологически чистым, поскольку используемые реагенты (кислоты и щелочи) в концентрированном виде не токсичны (хотя и требуют осторожного обращения) и используются в микробиологической промышленности. В виде разбавленных растворов (т.е. при рН 2,5-3,5) кислоты совершенно безвредны для организма человека. Продукты нейтрализации кислот и щелочей (т.е. соли) с другой стороны, являются компонентами сред и используются растущими клетками.

Предлагаемый метод легко масштабируется и может быть использован в микробиологической промышленности. Действи- тельно, при рН 2,7-3,5 и 90-100^оС ферментерное оборудование устойчиво к коррозии, а наличие в ферментаторах датчиков рН и устройств для перемешивания среды очень удобно для нейтрализации кислоты и доведения рН до нужного значения.

Метод мягкой (кислотной) стерилизации пригоден для использования в стерилизаторах различной конструкции, в том числе в аппаратах с системой УНС для непрерывной стерилизации. В этом случае с целью сокращения времени тепловой обработки сред в выдерживателе до 7-15 мин температуру подкисленных сред можно поднять до 110-115^оС.

При мягкой кислотной стерилизации практически не разрушаются компоненты среды, в частности сахара, аминокислоты, и это позволяет повысить на 3-5% выход продуктов ферментации, что в масштабах микробиологического производства может быть значительную экономию. Что касается полисахаридов (крахмала, декстрана и др. ), то при кислых значениях рН и 90-100^оС они подвергаются некоторому гидролизу с образованием глюкозы. В ходе тепловой обработки (мягкой стерилизации) крахмалсодержащих сред наблюдают некоторое их разжижение (падение вязкости). Появление свободной глюкозы может сказаться отрицательным образом на продуктивности некоторых грибных продуцентов, в частности тех из них, которые чувствительны к микроколичествам глюкозы. Чтобы избежать этого, мягкую стерилизацию следует проводить при рН выше 3,0. Для других продуцентов присутствие глюкозы индифферентно.

Высокая эффективность предлагаемого метода мягкой стерилизации, кроме всего прочего, связана со способностью кислот растворять мелкие частички почвы, присутствующие во многих компонентах среды, например в мелассе, и не поддающиеся растворению и стерилизации при нейтральных значения рН.

Важный аспект низкотемпературной кислотной стерилизации состоит в том, что его можно применять для обезвреживания (дезинфекции) отходов микробиологических производств (например, биомассы и стоков), органических отходов животноводческих и птицеводческих ферм, фекалий, почвы и т.д. При этом желательно использовать такие кислоты, как серная, фосфорная, соляная, или смеси этих кислот, а нейтрализацию проводить аммиаком с тем, чтобы органический раствор обогащался нужными для развития полезной микрофлоры и культивирования растений минеральными солями. При дезинфекции органических отходов во многих случаях не обязательна полная стерилизация достаточно убить патогенную микрофлору, вирусы, яйца гельминтов, зародыши сорняков. Следовательно, в этих случаях можно понизить температуру тепловой обработки, увеличив кислотность среды и время выдержки.

Предлагаемый метод, кроме того, может быть использован и в пищевой промышленности для стерилизации фруктовых и овощных соков, пюре, вин и т.д. В этом случае из минеральных кислот для подкисления наиболее целесообразно использовать соляную кислоту, а для нейтрализации NaOH или Na₂CO₃. Поскольку буферная емкость соков весьма низкая, расход кислоты и соответственно щелочи будет незначительным, так что образующаяся после нейтрализации соль (NaCl) абсолютно не повлияет на вкусовые качества напитка.