способ энзиматического получения основного фактора роста фибробластов bfgf (10 - 155) и фармацевтическая композиция на его основе

Формула изобретения

1. Способ энзиматического получения основного фактора роста фибробластов bFGF (10 155), включающий взаимодействие bFGF с защитным агентом при соотношении защитный агент bFGF от 1 0,5 до 1 10 (вес/вес), образование комплекса между защитным агентом и bFGF, обработку полученного комплекса протеолитическим ферментом, отличающийся тем, что в качестве bFGF используют bFGF (2 155) и/или bFGF (3 155), в качестве защитного агента гепарин или гепаран-сульфат, а полученный комплекс обрабатывают пепсином А или катепсином D с последующим выделением целевого продукта.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что bFGF (2 155) и/или bFGF (3 - 155) является человеческим.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что защитный агент и bFGF (2 - 155) и/или bFGF (3 155) добавляют в буферном растворе.

4. Способ по пп.1 3, отличающийся тем, что гепарин или гепаран-сульфат иммобилизуют на подложке с образованием аффинной колонки, колонку загружают раствором bFGF (2 155) и/или bFGF (3 155), затем через колонку пропускают раствор пепсина А или катепсина D, полученный bFGF (10 155) элюируют.

5. Фармацевтическая композиция, содержащая основной фактор роста фибропластов (bFGF) и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, отличающаяся тем, что в качестве bFGF используют bFGF (10 155), полученный путем взаимодействия bFGF (2 155) и/или bFGF (3 155) с защитным агентом, гепарином или гепаран-сульфатом, при соотношении защитный агент bFGF от 1 0,5 до 1 10 (вес/вес), образования комплекса между защитным агентом и bFGF, обработки полученного комплекса пепсином А или катепсином D и выделения bFGF (10 155).

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к способу энзиматического получения основного фактора роста фибробластов bFGF, а также к фармацевтической композиции на его основе.

Фактор bFGF первоначально был выделен из мозга и гипофиза в виде полипептида из 146 аминокислот (Esch и др. PNAS, USA, 82, 6507-6511, 1985). Был клонирован ген bFGF быка (Abraham и др. Science, 233, 545 548, 1986). Последовательность нуклеотидов предопределила 155-аминокислотный bFGF-продукт трансляции. Дальнейшие исследования показали, что 154-аминокислотный bFGF может быть извлечен вместе с 146-аминокислотным bFGF из обычной ткани гипофиза при добавлении энзимных ингибиторов (Ueno и др. Biochem. Biophys. Res. Comm. 138, 580 -588, 1986), и что кислотные протеазы в мозговых и гепатомных клетках расщепляют bFGF (Klagsbrum и др. PNAS USA 84, 1839 -1843, 1987).

Методы генной инженерии белков сделали доступными рекомбинантные факторы роста фибробластов для терапевтического использования. Однако после экспрессии полученные ростовые факторы могли перерабатываться только в смесь их различных форм. FGF-факторы не являются исключением в этом отношении (Barr и др. J. Biol. Chem. 263, 31, 16471 16478, 1988).

Авторами изобретен способ получения bFGF-фактора, усеченного на его N-конце. Этот способ может использоваться для получения 146-аминокислотной формы bFGF из его более длинных форм для получения единственной формы bFGF из смеси различных BFGF.

Соответственно настоящее изобретение предлагает способ энзиматического получения основного фактора роста фибробластов bFGF (10 155), включающий взаимодействие bFGF с защитным агентом при соотношении защитный агент: BFGF от 1 0,5 до 1 10 (вес/вес), образование комплекса между защитным агентом и bFGF, и обработку полученного комплекса протеолитическим ферментом, причем в качестве bFGF используют bFGF (2 155) и/или bFGF (3 155), в качестве защитного агента используют гепарин или гепаран-сульфат, а полученный комплекс обрабатывают пепсином A или катепсином D с последующим выделением целевого продукта.

Изобретение предлагает также фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и основной фактор рота фибробластов bFGF, в которой указанным фактором роста является фактор, описанный в предыдущем абзаце.

BFGF полной длины имеет 155 аминокислотных остатков и может быть обозначен как 155-BFGF или (1 155) bFGF. Изобретение может использоваться для смеси bFGF из 154 аминокислотных остатков ((2 155) bFGF) и bFGF из 153 аминокислотных остатков ((3 155)bFGF).

BFGF или смесь различных bFGF обычно получают при помощи методик рекомбинантной ДНК. Различные формы bFGF получают в виде таких смесей посредством обработки продукта трансляции на его N-конце. Один или каждый bFGF может быть человеческим, мышиным или bFGF грызунов.

Аддукт может быть образован между защищающим агентом для bFGF, который выбирают из гепарина или гепарансульфата, и смесью bFGF в любой удобной форме. Защищающий агент и bFGF обычно дают в водном растворе. Этот раствор может содержать буфер.

Также может присутствовать антиоксидант, такой как дитиотреол, для предотвращения окисления протеина. Соотношение bFGF защищающий агент составляет от 0,5 1 до 10 1 (вес/вес), например от 1 1 до 5 1 (вес/вес). Защита bFGF в виде аддуктов предотвращает дальнейший гидролиз при добавлении пепсина A.

Пепсин А (EC 3.4.23.1) или катепсин D (EC 3.4.23.5) затем контактирует с аддуктом. Это приводит к специфическому расщеплению 9 10 Leu-Pro связи в bFGF, содержащихся в аддуктах. Энзим может быть обеспечен в растворе аддукта.

Поэтому энзим может добавляться к раствору bFGF и защищающего агента. Энзим обычно дается в растворе, доведенном до pH 4 6.

Раствор инкубируется в течение, например, в случае пепсина A, от 30 минут до 10 ч, например от 1 до 8 ч. Инкубирование обычно дольше для катепсина D, например от 90 до 130 ч подходящим является интервал примерно 110 ч. Температура инкубирования может составлять от 5^oC до комнатной температуры, например примерно 10^oC. Инкубация проводится до тех пор, когда реакция завершится.

Напротив, защищающий агент может быть иммобилизован на подложке с образованием афинной колонки. Может быть использована любая подходящая подложка, такая как агарозный гель или шарики сшитого декстранового геля (например, Сефароза). Раствор bFGF пропускается через колонку. bFGF связываются с защищающим агентом и удерживаются на колонке. Раствор энзима может быть затем пропущен через колонку. Наконец, укороченный один вид bFGF может быть элюирован из колонки. Это может быть достигнуто при помощи линейного градиента водного раствора хлорида натрия.

Чистая форма bFGF может быть получена способом настоящего изобретения. В частности, может быть получена 146-аминокислотная форма bFGF, обозначенная как (10 155) bFGF. Полученный bFGF может быть использован для обработки ран и ожогов, например, bFGF могут использоваться для ран и ожогов в любой подходящей рецептуре. Такие рецептуры поэтому включают в себя далее физиологически приемлемый носитель или разбавитель.

Нижеследующие примеры иллюстрируют изобретение. Приводятся примеры получения и сравнительные примеры.

Примеры получения: получение 154/153 формы bFGF

Конструирование последовательности синтетической ДНК для bFGF и плазмиды экспрессии, несущей такую последовательность, было осуществлено согласно методу, описанному в EP-A-363375. Процессы ферментации и очистки проводились следующим образом:

(а) Процесс ферментации

Бактериальный штамм, E.coli типа B, из коллекции института Пастера, был трансформирован с плазмидой, несущей как человеческий ген, кодирующий bFGF, так и ген тетрациклиновой устойчивости. Этот трансформированный штамм был использован для получения рекомбинантного негликозилированного h-bFGF (человеческого bFGF). Master Cell банк клеток (15 лиофильно-высушенных пузырьков) и Working Cell банк клеток (W.C.B.) (70 пузырьков, хранящихся в жидком азоте при 190^oC) этого штамма были получены. Содержание одного пузырька W.C.B. было использовано в качестве инокулята для базы ферментации.

Ферментативный процесс проводился в 10 л ферменторах, заполненных 4 л питательной среды. В питательную среду был добавлен гидрохлорид тетрациклина для того, чтобы поддерживать условия селекции штамма. После 20 ч роста при 37^oC конечная биомасса составляла 42 2 г/л сухого веса, и выход bFGF составлял 2500 500 мг/л, как показало измерение при помощи сравнительного гель электрофореза.

В течение ферментативной фазы потребовалось обогащение чистым кислородом для того, чтобы обеспечить большой бактериальный рост.

Исходная очистка

Клетки (микроорганизмы) были отделены от общей ферментативной смеси при помощи центрифугирования. Полученные гранулы были повторно суспендированы в натрий фосфатном буфере, содержащем хлорид натрия. Было необходимо минимум три прохождения через гомогенизатор высокого давления для эффективного клеточного обрыва. Полученный клеточный лизат был осветлен при помощи центрифугирования и супернатант собран для дальнейшей обработки.

Очистка

Осветленный супернатант был пропущен через колонку с Sepharose (Trade Mark) S Fast Flow (катионообменник) и продукт был элюирован из этой колонки с использованием градиента возрастающих концентраций хлорида натрия в фосфатном буфере. Далее продукт был очищен на колонке Heparin Sepharose 6B путем элюирования градиентом возрастающей концентрации хлорида натрия в фосфатном буфере. Наконец, был сделан буферный обмен на Sephadex (Trade Mark) G 25 смоле для получения продукта в объеме продуктового буфера (натрий фосфат ЭДТА).

Очистка колонки

Sepharose S Fast Flon и Sephadex G 25 колонки были очищены путем промывания растворами гидроксида натрия. Heparin Sepharose была промыта поочередно растворами, содержащими 3М хлорида натрия при pH 8,5 и pH 5,5.

Таким образом, была получена 154/153 форма bFGF.

Она представляет собой смесь приблизительно 50:50 из:

154-аминокислотный человеческий bFGF /2 155/ bFGF, имеющий аминокислотную последовательность 155-аминокислотной формы, которая описывается Abraham et al и показана в SEQ ID NO, но без N-терминального Met остатка; и

153-аминокислотный человеческий bFGF /3 155/ bFGF, состоящий из 155-аминокислотной формы bFGF, показанной на SEQ ID NO: 1, но без N-терминального Met остатков.

Пример 1. Гепарансульфат как защитный агент; пепсин A.

1. Получение протеинового образца

154/153 форма bFGF препаративного образца была получена при концентрации 1,8 мг/мл в забуференном растворе:

10 мМ мононатрий фосфата,

0,1 мМ ЭДТА динатриевая соль,

pH 6,0.

Для того, чтобы избежать какого-либо окисления протеина в процессе контролированного гидролиза, было добавлено 20 мг дитиотреитола к 1,8 мг bFGF.

Методика энзиматического гидролиза bFGF:

а) Стандартный раствор защитного агента

Раствор 1: 20 мг защитного раствора в 1 мл H₂O

б) Приготовление раствора bFGF и защитного агента

100 мкл протеинового образца,

9 мкл раствора, 1,

3 мкл 1 М цитрата натрия pH 3,0,

70 мкл H₂O,

18 мкг (18 мкл) пепсина A из слизистой оболочки свиного кишечника,

конечный объем: 200 мкл.

Защитный агент представлял собой гепаран сульфат и соотношение bFGF / защитный агент составляло 1:1 (вес/вес). Пепсин A (EC: 3.4.23.1) был добавлен к раствору bFGF и защитного агента при pH 4,0 и инкубирован при 10^oC в течение 1 ч.

3. Кинетика энзиматического гидролиза

Процедура гидролиза прослеживалась при различных временах при помощи SDS-PAGE анализа. Образцы обрабатываемой смеси были проанализированы после 1, 20, 40 и 60 мин при помощи SDS-PAGE. Отделение 154/153 bFGF формы от 146-bFGF формы было достигнуто в SDS-PAGE анализе с использованием PHAST System (Trade Mark; Pharmacia). Что касается буфера образца, условия приготовления образца были определены следующим образом для того, чтобы избежать какого-либо осаждения протеина из образца в зоне заполнения Phast Cell Higri Density:

15 мкл раствора протеина;

10 мкл 40 мМ Трис/HCl, 4 мМ ЭДТА, 10% SDS, 20% меркаптоэтанол, pH 8,0;

3 мкл ДМСО (диметилсульфоксид);

1 мкл Бромфенола голубого (0,3%).

Денатурация образцов достигалась путем нагревания образца при 100^oC в течение 5 мин. Анализ образцов показал, что в образцах, взятых из обрабатываемой смеси после одного часа, 154/153 bFGF полностью пропадал. Был получен один основной фрагмент, который соответствовал точно 146 bFGF рекомбинантному фрагменту, использованному в качестве эталона.

4. Очистка bFGF

Реакционная смесь была непосредственно пропущена через Гепарин-агарозную колонку, предварительно уравновешенную Трис-буфером 10 мМ, pH 8,0, 0,5 NaCl. bFGF элюировался при 1,5 М NaCl с использованием градиента от 0,5 М до 3 М NaCl. Концентрация протеина была определена методом Bradford"s с использованием в качестве стандарта 154/153 bFGF.

Электровпитывание 146-формы bFGF

Процедура, используемая в электровпитывающем анализе, была аналогична процедуре, описанной PIoug et al (Anal. Biochem, 181, 33 39, 1989). Используемая мембрана представляла собой Immobilon PVDF (MiIIipor).

После электрофореза гель был уравновешен в переходном буфере /10 мМ CAPS / 3-[циклогексиламино]-1-пропансульфоновая кислота/, pH 11,0, 20% метанол) в течение 10 мин. Immobilon PVDF была первоначально увлажнена чистым метанолом и затем уравновешена в переходном буфере перед применением. Был использован полусухой электровпитывающий анализ (Kyhsel An dersen, J. Biochem. Biophys. Melhoass, 10. 203 209, 1984). Электроперенос был осуществлен в течение 2 ч при 0,2 мА/см².

PVDF мембрана была промыта в воде и затем прокрашена в 0,1% (вес/объем) Coomassie бриллиантового синего R 250 в 50% (объем/объем) метанола в течение 1 мин. Избыток красителя был удален путем короткого промывания водой, за которым следовало удаление окраски в 40% (объем/объем) метаноле, включающем 10% (объем/объем) уксусной кислоты в течение 10 мин. Мембрана PVDF была затем осторожно промыта в воде перед определением последовательности.

6. Анализ амино-терминальной последовательности

Вырезанные области PVDF мембраны, содержащие окрашенный протеин, были помещены как одинарный слой на верхнюю часть Polybrene кондиционного фильтра. Определение последовательности было осуществлено на Определителе последовательности Applied Biosystems Model 470A, снабженном последовательно PTH-аминокислотным анализатором Model 120 A.

Первые три аминокислоты NH₂-терминальной части протеина, определенные при этих условиях, были:

Pro-Ala-Leu

Эти аминокислоты соответствуют трем аминокислотам аминотерминальной 146-bFGF формы.

7. Лазерный сканирующий денситометрический анализ

Этот анализ был проведен для определения процента 146-bFGF, полученного после 1 ч гидролиза 154/153-bFGF при помощи пепсина A. После 1 ч 50 мкл реакционной смеси были смешаны с 50 мкл SDS-денатурирующего буфера. При тех же самых условиях bFGF образцы различных концентраций протеина были SDS-денатурированы. Эти образцы разделялись электрофорезом на геле PAA 4/30 (Pharmacia). Была проанализирована денситометрия каждого пика с использованием LKB BROMA 2220 записывающего интегратора. Используя стандартные кривые, полученные в этих условиях, было найдено, что концентрация 146-bFGF формы соответствовала 91% от начальной 154/153-bFGF концентрации.

Выход 146-bFGF после афинной очистки

Выход реакции энзиматического гидролиза был также определен после очистки 146-bFGF формы на гепарин-агарозной колонке, 1,64 мг реакционной смеси из п. 2. представленного выше, было пропущено через гепарин-агарозную колонку, предварительно уравновешенную Трис 10 мМ, pH 8, 0,5 М NaCl. При pH 8 пепсин A совсем неактивен, и комплекс между гепаран сульфатом и bFGF дестабилизирован, позволяя bFGF адсорбироваться на гепарин-агарозе, присутствующей в избытке в среде. bFGF был элюирован при 1:5 М NaCl. Было выделено 1,14 мг 146-bFGF формы. Общий выход 146-bFGF аминокислотной формы после контролированного гидролиза с использованием гепарансульфата в качестве защитного агента и очистки на афинной колонке составлял 73%

Пример 2. Гепарин как защитный агент; пепсин A.

Была повторена процедура из примера 1, за исключением того, что защитным агентом был гепарин, соотношение bFGF -гепарин составляло 5:1 (вес/вес), аликвоты обрабатываемой смеси были проанализированы после 2 мин и 4, 6 и 8 ч и общее время инкубирования составляло 8 ч. Раствор bFGF и гепарина состояли из:

100 мкл протеинового образца,

18 мкл раствора 2,

3 мкл 1 М цитрата натрия, pH 3,0,

70 мкл H₂O,

18 мкг пепсина A,

конечный объем: 200 мкл.

Раствор 2 состоял из 100 мкл раствора 1 и 900 мкл H₂O. При этих условиях только один фрагмент был также получен после 8 ч инкубирования. Этот фрагмент имел кажущийся молекулярный вес вес 16.200, как определено SDS-PAGE анализом.

При помощи анализа аминотерминальной последовательности были получены три те же самые N-терминальные аминокислоты, как и в примере 1: Pro-Ala-Leu.

Пример 3. Гепарин как защитный агент; пепсин A.

Выход контролируемого гидролиза bFGF, защитного гепарином, был также определен после очистки 146-bFGF фрагмента на гепарин-агарозной колонке. После 7 ч гидролиза в тех же самых условиях, что и в примере 2, реакционная среда, содержащая 1,54 мг bFGF, была пропущена через гепарин-агарозную колонку, предварительно уравновешенную 10 мМ натрий фосфатным буфером, pH 8, и 0,5 М NaCl. 1,02 мг 146-bFGF было элюировано при 1,5 М NaCl.

Общий выход 146-bFGF аминокислотной формы после очистки на афинной колонке с использованием гепарина в качестве защитного агента составлял 69%

Пример 4. Гепарин, иммобилизованный на Агарозе в качестве защитного агента; пепсин A.

1. Процедура энзиматического гидролиза bFGF

Гепарин-агарозная колонка (7 мл гель, содержащего 5,6 мг гепарина) была уравновешена натрий монофосфатом 10 мМ, 0,1 мМ ЭДТА, NaCl 0,5 М, pH 4 при 10^oC. 154/153-bFGF был пропущен через афинную колонку. Затем 0,18 мг пепсина, разбавленного тем же самым фосфатным раствором, пропускали через колонку. Энзим рециркулировался через колонку при скорости потока 0,5 мл/мин в течение 6 ч.

При времени, равном 6 ч, колонка была промыта 10 мМ натрий фосфатным буфером pH 7, 0,1 мМ ЭДТА, 0,5 М NaCl, (3 объема), затем градиентом от 0,5 М до 3 М NaCl. bFGF был элюирован при 1,5 М NaCl.

2. Анализ аминотерминальной последовательности

После электрофореза гель был подвержен электропоглощению на Immob: 10n PVDF с использованием полусухого поглощающего устройства, как описано в примере 1. Вырезанные области PVDF- мембраны, содержащие окрашенный протеин, были помещены в виде единичного слоя на верх Polybren кондиционного фильтра. Первые три аминокислоты NH₂-терминальной части протеина, определенные при этих условиях, представляли собой: Pro-Ala-Leu.

Эти аминокислоты соответствовали трем аминокислотам из аминотерминальной части 146-bFGF формы.

3. Выход при выделении 146 bFGF

Выход реакции гидролиза был определен после количественного определения 146 bFGF фрагмента, вымытого из гепарин-агарозной колонки. 1,28 мг 146 - bFGF было выделено. Общий выход "Obtention" 146 bFGF аминокислотной формы (М. в. 16,200) после контролируемого гидролиза на гепарин-агарозной колонке составлял 81%

Пример 5. Гепарин как защитный агент; катепсин D.

1. Процедура энзиматического гидролиза bFGF

Была повторена процедура примера 2, за исключением того, что вместо пепсина А был использован катепсин D из печени быка, и время инкубирования составляло 110 ч.

2. Кинетика реакции

Содержание 146 bFGF фрагмента, полученного во время энзиматического гидролиза, было очень низким, но детектируемым путем SDS PAGE анализа после 1 ч. После 72 ч гидролиз 154/153 bFGF не был полным и 36 мкг катепсина D было добавлено в реакционную среду. Спустя 40 ч реакция была завершена. Это происходит из-за низкой активности катепсина D (10 единиц/мг).

6. Анализ аминотерминальной последовательности

После электрофореза гель был подвержен электропоглощению на Immobilon PVDF с использованием "Siemi-dry blotting assembly", как описано в примере 1. Вырезанные области PVDF- мембраны, содержащие окрашенный протеин, были помещены в виде единичного слоя на верх Poly bren кондиционного фильтра. Определение последовательности осуществлялось на Applied Biosystems анализаторе определителе последовательности Model 470A, соединенным последовательно с PTH-аминокислотным анализатором Model 120A. Первые три аминокислоты NH₂-терминальной части протеина, определенные при этих условиях, были: Pro-Ala-Leu.

Сравнительный пример 1: пепсин A без защитного агента.

Пример 1 был повторен за исключением того, что не присутствовал защитный агент. 154/153 форма bFGF была полностью переработана пепсином A в пределах нескольких минут.

Сравнительный пример 2: катепсин D без защитного агента.

Пример 5 был повторен за исключением того, что защитный агент не присутствовал. 154/153 форма bFGF была полностью переработана катепсином D в пределах нескольких минут.

Сравнительный пример 3: -химотрипсин.

Пример 1 был повторен, за исключением того, что вместо пепсина А использовался a-химотрипсин, и защитный агент не присутствовал. 154/153 форма bFGF была полностью переработана a -химотрипсином в пределах нескольких минут. Поэтому были протестированы различные анионные соединения с точки зрения их способности защищать bFGF от a-химотрипсина:

1. Гепарин 3.000 (Sigma, H 7516)

соотношение bFGF / защитный агент 1,

температура 10^oC,

pH 7,5,

время инкубирования 4 часа.

При использовании гепарина 3.000 в качестве защитного агента был получен главным образом один фрагмент кажущегося молекулярного веса 14.000 и несколько других фрагментов более низкого молекулярного веса, как определено SDS-PAGE анализом.

2. Гепарин (Sigma, H 3125)

соотношение bFGF / защитный агент (вес/вес) 5,

температура 10^oC,

pH 7,5,

время инкубирования 4 ч.

При использовании этого гепаринового свойства как защитного агента защита не была подходящей, и было получено много фрагментов.

3. Хондроитин сульфат

соотношение bFGF / защитный агент (вес/вес) 1,

температура 10^oC,

pH 7,5,

время инкубирования 2 ч.

Защита не была пригодной, и было получено много фрагментов.

4. Дерматан сульфат

соотношение bFGF / защитный агент (вес/вес) 1,

температура 10^oC,

pH 7,5,

время инкубирования 2 ч.

Защита не была подходящей, и было получено много фрагментов.

5. Полиаспарагиновая кислота

соотношение bFGF / защитный агент (вес/вес) 1,

температура 10^oC,

pH 7,5,

время инкубирования 2 ч.

При использовании полиаспарагиновой кислоты в качестве защитного агента защита не была подходящей, и было получено много фрагментов.

Пример 6: Гепарин или гепаран сульфат как защитный агент; пепсин А или катепсин D

1. Экспериментальный протокол

Протеолитическая обработка растворимых комплексов bFGF гепарин и bFGF - гепаран сульфат в растворе

1,6 мг 154/153-аминокислотной формы bFGF были закомплексованы с 1,6 мг гепарина или гепаран-сульфата в 10 мМ цитратфосфатного буфера pH 4,0, 10^oC. После 1 ч времени инкубирования к раствору было добавлено 160 мкг пепсина А (Sigma, P-6887, 3200 4500 единиц/мг протеина). При различных временах были взяты образцы реакционной среды и непосредственно пропущены через гепарин- сефарозную колонку, предварительно уравновешенную 10 мМ фосфатным буфером pH 8,0/0,5 М NaCl при 4^oC. Колонка была затем интенсивно промыта тем же самым буфером, и bFGF был элюирован 3 М NaCl в 10 мМ фосфатного буфера pH 8,0. Собранные фракции были обессолены на колонке Сефадекс C 25, предварительно уравновешенной 10 мМ фосфатным буфером pH 6,0 и проанализированы SDS PAGE анализом. При использовании гепаран-сульфата в качестве защитного агента был получен 146 bFGF с количественным выходом после 1 ч. Обработка пепсином комплекса гепарин bFGF привела к такому же количественному выходу через 6 ч времени инкубирования.

Обработка пепсином A bFGF, связанного с гепарин-сефарозной колонкой

50 мг bFGF / 154/153 были пропущены через гепарин-сефарозную колонку (Pharmacia) (2,6 х 22,5 см), предварительно уравновешенную 25 мМ цитратным буфером pH 4,0/0,5 М NaCl при 4^oC и при скорости потока 2,5 мл/мин. Раствор 680 единиц/мл свиного пепсина А (Sigma) в цитрат-фосфатном буфере непрерывно рециклирован через колонку при 2,5 мл/мин в течение 3 ч при 4^oC. Колонка была затем интенсивно промыта 25 мМ фосфатным буфером pH 8,0/0,5 М NaCl для инактивации и удаления энзима. bFGF был ступенчато элюирован 3М NaCl в 25 мМ фосфатном буфере pH 8,0. bFGF-содержащие фракции были собраны, сконцентрированы путем ультрафильтрации на Amicon PM 10 мембране и обессолены на Сефадекс C-25 колонке (Pharmacia), предварительно уравновешенной 10 мМ фосфатным буфером pH 6,0.

Анализ N-терминальной последовательности

Автоматизированный анализ N-терминальной последовательности осуществлялся на Model 477A Pulsedliquid Phase Sequence (Applied Biosystems, CA USA) с последовательным Model 120 A PTH-анализатором. Использовалась программа Normal-1 с небольшими модификациями. Все материалы для определения последовательности и реагенты были куплены у Applied Biosystems.

Анализ C-терминальной последовательности

Исследование протекания воздействия карбоксипептидазы на bFGF во времени проводилось при комнатной температуре в 10 мМ натрий ацетатном буфере pH 3,8/0,05% Brij 35, с использованием соотношения энзим / субстрат примерно 1: 100 (вес/вес) (Lu et al, J. Chromatogr. 447, 351 364, 1988).

Ферментативные обработки 0,5 1 нмоль протеина проводились в течение 2 ч с 0,1 0,2 мкг CpP (Boehringer); N-Лейцин был добавлен в качестве внутреннего стандарта. При различных временах были отобраны аликвоты 10/100 мкл и подвергнуты аминокислотному анализу после автоматизированной дериватизации PITC на дериватографе Model 420 A (Applied Biosystems) и впоследствии инжектированы в P HPLC с последовательно соединенным анализатором Model 130A. Разделение дериватизированных PTC-аминокислот на PTC-C8 колонке (P/N 0711-0204, 22 x 2,1 мм, 5 мкм, Applied Biosystems).

Биоанализы

Для изучения пролиферативного ответа, индуцированного bFGF, был использован эндотелиальный клеточный штамм, полученный из аорты быка (BAEC). Клетки высеивались при 2500 клеток / на ячейку в 96 ячеистые микротитровочные пластины, в питательной среде, состоящей из Dulblecco"s Modified Eagle"s Medium (MEME), дополненной 13% эмбриональной сывороткой быка (FBS) (G: bro, UK). После прикрепления питательная среда была замещена на экспериментальную среду, состоящую из DMEM, дополненной 0,5% эмбриональной сывороткой теленка (FBS), 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Sigma USA), и желаемыми концентрациями bFGf (Erbamont). Культуры были инкубированы в течение 3 дней, и при этом времени они были смешаны с формалином и окрашены 0,5 кристаллическим фиолетовым. После окрашивания ячейки были тщательно промыты для удаления невключенного красителя. Метанол (95% 0,1 мл/ячейку) был добавлен в каждую ячейку для экстрагирования красителя в степени, пропорциональной количеству клеток, выросших на ячейку. Пластины были перенесены для автоматического считывания в спектрофотометрическое микропластиночное считывающее устройство, снабженное 540 нм-фильтром.

Для синтеза плазминогенного активатора BAEC (3 х 10⁴ клеток в 0,2 мл/ячейку) были высеяны в 96 ячеечных микротитровочных пластинах в питательной среде, которая была заменена после прикрепления на DMEM, дополненную 0,5% (FBF), 0,1% BSA и тестируемыми концентрациями bFGF. После инкубирования с течение 28 ч культуры были промыты и клетки лизировались раствором, содержащим 0,5% Тритон Х-100. Аликвоты клеточных лизатов были проанализированы на плазминогенную активаторную активность с использованием хромогенного субстрата (Spectrosyme PL) и плазминогена (оба реагента из Ammerican Diagnostica Inc) для амидолитического анализа.

2. Результаты

Контролируемая энзиматическая обработка bFGF

Очищенная рекомбинантная 154/153 смесь была инкубирована с двумя различными аспарагиновыми протеазами: пепсином A и катепсином D. Аликвоты реакционной смеси были взяты при различных временных интервалах и подвергнуты SDS-Page анализу, показывающему, что в отсутствии какого-либо защитного агента bFGF была быстро расщеплена на небольшие пептиды. Напротив, обработка bFGF / 154/153 / пепсином A 10:1 pH 4,0; 10^oC/ в присутствии гепарина или гепаран-сульфата (1:1 вес/вес), приводила к прогрессивной и полной конверсии 154/153-аминокислотных форм в форму с более низким молекулярным весом, который совместно мигрирует с нашим стандартом 146/145 аминокислотной формы.

После электровпитывания на PDVF мембране полоса с низким молекулярным весом, полученная при энзиматическом расщеплении, была подвергнута автоматизированному анализу N-терминальной последовательности на "pulsed" жидкофазном определителе последовательности. Первые три цикла привели к единичной гомогенной последовательности; Pro-Ala-Leu, которая соответствует интактному N-терминальному концу известной 146-аминокислотной формы. Никакая другая последовательность не была определена, показывая, что несмотря на присутствие трех Leu-Pro сайтов на молекуле bFGF, когда удлиненные формы bFGF были комплексно связаны с гепарином или гепаран-сульфатом, ферментативная обработка пепсином A расщепляла специфически и только пептидную связь Leu₉ Pro₁₀.

Контролируемое протеолитическое расщепление NH₂-расширенной "защищенной гепарином" молекулы bFGF, как получено с пепсином A, было достигнуто после обработки катепсином D, хотя потребовалось более длительное время инкубирования для этой протеолитической реакции, возможно из-за более низкой специфической активности энзима, использованного при получении. Когда при аналогичных условиях, но при pH 7,5 был добавлен хемотрипсин, был детектирован после гельэлектрофореза инкубированной смеси единичный полипептид примерно 14000 Да, и не имелось доказательства присутствия 146-аминокислотной формы.

Энзиматическая обработка bFGF по широкой шкале на гепарин-сефарозной колонке

Результаты, полученные в растворе и в реакциях с небольшими партиями, были проверены на процессе с большими количествами 154/153 смеси удлиненных bFGF, связанных с гепарин-сефарозной колонкой. Соответственно, 50 мг bFGF (154/153) были пропущены через колонку гепарин-сефароза, предварительно уравновешенную цитрат-фосфатным буфером pH 4,0. Раствор пепсина A рециркулировал непрерывно через колонку в течение 3 ч при 4^oC. После этого колонка была промыта фосфатным буфером при щелочных pH как для инактивации, так и для удаления энзима. Полученный полипептид элюировался из колонки 3 М NaCl в фосфатном буфере при pH 8,0. Фракции, содержащие bFGF, были собраны и обессолены на колонке Сефадекс G-25.

Собранные фракции, проанализированные на SDS PAGE, показали единичную полосу с молекулярным весом, соответствующим молекулярному весу стандартной 146/145 формы bFGF. Анализ на HPLC с обратной фазой приводил также к единичному пику. Анализ N-терминальной последовательности приводил к единичной последовательности, соответствующей правильному, интактному N-терминальному концу молекулы bFGF, то есть Pro-Ala-Leu-. Анализ C-терминальной последовательности показал ожидаемый конец молекулы bFGF, т.е. -Ala-Lys-Ser. Таким образом, также, когда bFGF был связан с гепарин-сефарозной смолой, пепсин A был способен расщеплять специфически молекулу при Leu₉ - Pro₁₀ связи, генерируя гомогенную 146-аминокислотную форму.

Биоанализы in vitro bFGF форма

Биологическая активность смеси 154/153 аминокислотной формы сравнивалась с активностью гомогенной 146-аминокислотной формы, полученной при помощи описываемого протеолитического процесса. Две активности, индукция пролиферативного ответа и синтез плазминогенного активатора были изучены в эндотелиальных клетках аорты быка (BAEC). Оба анализа подтвердили in vitro биологическую эквивалентность 154/153 по сравнению с 146-аминокислотной формой, полученной при помощи энзиматического процесса.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

// ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ SEQ ID NO:1:

// ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

/A/ ДЛИНА: 155 аминокислот

/B/: ТИП: аминокислотный

/C/ "Strandedness" единичная

/D/ ТОПОЛОГИЯ: линейная

/II/ ТИП МОЛЕКУЛЫ: протеин

// ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO:1:

/2/ ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO:2:

// ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

/A/ ДЛИНА: 8 аминокислот

/B/: ТИП: аминокислотный

/C/ "Strandedness" единичная

/D/ ТОПОЛОГИЯ: линейная

/II/ ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид

// ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO:2:

Met-Ala-Ala- Gly-Ser-Ile-Jhr-Jhr

/3/ ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ SEQ ID NO:3:

/I/ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

/A/ ДЛИНА: 7 аминокислот

/B/: ТИП: аминокислотный

/C/ "Strandedness" единичная

/D/ ТОПОЛОГИЯ: линейная

// ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид

// ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:



/4/ ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO:4:

// ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

/A/ ДЛИНА: 6 аминокислот

/B/: ТИП: аминокислотный

/C/ "Strandedness" единичная

/D/ ТОПОЛОГИЯ: линейная

// ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид

// ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO:4:



/6/ ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ SEQ ID NO:5

// ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

/A/ ДЛИНА: 5 аминокислот

/B/: ТИП: аминокислотный

/C/ "Strandedness": единичная

/D/ ТОПОЛОГИЯ: линейная

// ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид

// ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO:3:



/6/ ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ SEQ ID NO:6:

// ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

/A/ ДЛИНА: 4 аминокислоты

/B/ ТИП: аминокислотный

/C/ "Standedness": единичная

/D/ ТОПОЛОГИЯ: линейная

// ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид

// ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO:6:

н