способ получения пептидов и устройство для его осуществления
Классы МПК: | C07K5/04 содержащие только нормальные пептидные связи C07K1/24 электрохимическими способами C07K1/00 Общие способы получения пептидов B01J19/12 с использованием электромагнитных волн |
Автор(ы): | Новиков Вадим Викторович, Яновский Илья Яковлевич |
Патентообладатель(и): | Новиков Вадим Викторович, Яновский Илья Яковлевич |
Приоритеты: |
подача заявки:
1995-10-09 публикация патента:
27.12.1997 |
Сущность изобретения: предлагается способ получения пептидов путем синтезирования из раствора, содержащего в качестве компонентов аминокислоты, в котором предварительно по меньшей мере часть компонентов, например, изменением pH раствора переводят в ионизированное состояние, а затем раствор подвергают одновременному воздействию скрещенных между собой электрического поля и магнитного поля, имеющего постоянную и переменную составляющие, причем частота переменной составляющей магнитного поля соответствует собственной частоте циклоидного движения компонентов раствора, и устройство для осуществления способа. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил.
Рисунок 1
Формула изобретения
1. Способ получения пептидов путем синтезирования из раствора, содержащего в качестве компонентов аминокислоты, отличающийся тем, что предварительно по меньшей мере часть компонентов переводят в ионизированное состояние и затем раствор подвергают одновременному воздействию скрещенных между собой электрического поля и магнитного поля, имеющего однонаправленные постоянную и переменную магнитные составляющие, при этом частота переменной составляющей соответствует собственной частоте циклоидного движения компонентов раствора. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перевод компонентов в ионизированное состояние осуществляют изменением рН раствора. 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что величину напряженности электрического поля выбирают в диапазоне 0,1 10,0 В/м, величину индукции постоянного магнитного поля выбирают в диапазоне 10 100 мкТ, а величину индукции переменного магнитного поля в диапазоне 10 200 нТ. 4. Устройство для получения пептидов, содержащее емкость для размещения раствора, снабженную средством для подачи и отбора раствора, отличающееся тем, что оно снабжено регулятором рН раствора и источником магнитного поля, образованного двумя охватывающими емкость и размещенными коаксиально одна в другой магнитными катушками, одна из которых соединена с источником постоянного, а другая с источником переменного тока, а внутри емкости установлены подключенные к источнику постоянного тока электроды из биологически инертного материала, расположенные так, что создаваемые электрическое поле и магнитное поле скрещены между собой, при этом емкость выполнена термостатируемой.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биологии, более точно к способам получения пептидов и устройствам для их осуществления. Известен способ получения пептидов и ряда пептидных гормонов ферментов и иммуномодуляторов путем экстрагирования их из биологического материала (например, A.Lehninger, "Biochemistry", Worth Rublishers, N. J. 1972). Способ является трудоемким, выход конечного продукта составляет 20-60% процесс отделения конечного продукта от множества молекулярных примесей, содержащихся в биологическом материале, сложен, из-за чего в настоящее время применяется редко. Известны способы получения пептидных продуктов синтезом из аминокислот или гидролизом из более длинных белковых и пептидных последовательностей под действием протеолитических ферментов (Структурные основы действия пептидных и белковых иммуномодуляторов /Под ред. Г. И. Чипенса, Рига. Зиматне, 1990; Овчинников Ю. А. Биоорганическая химия, М. Просвещение, 1987). Однако из-за сложности контроля направленности синтеза пептидной последовательности и сложной очистки конечного продукта от ферментов и сопутствующих примесных пептидов применение этих способов в настоящее время ограничено. Известен способ получения пептидных и белковых продуктов с помощью генной инженерии (Алберт А. Брей Р. Дльюис Дж и др. Молекулярная биология. М. Мир, 1986). Способ заключается в направленном встраивании в геном клетки бактерии определенного гена, кодирующего синтез заданного пептида или белка. Модифицированная таким образом клетка начинает синтезировать необходимый конечный продукт. Применение данного способа ограничено из-за трудоемкости технологического процесса, а также необходимости очистки конечных продуктов от сопутствующих биологических соединений, являющихся продуктами метаболизма бактерий. Наиболее широко в настоящее время используется способ получения пептидов путем химического синтеза пептидной последовательности ("The peptides, Analysis, Synthesis, Biology". Edited by Erhard Gross, Johahnes Meienhofed", Academic Press", N. Y. San Franc. London, 1979). В основе способа лежит осуществление многократно повторяющихся химических реакций, при которых происходит процесс присоединения аминокислот к растущей пептидной цепи (Merrifield R. B. "Automated Synthesis of Peptides", Science, 1965, p. 150, 178-185). Способ методически сложен, требует постоянного контроля за содержанием аминокислот в реакционной смеси. Необходимость проведения промежуточной очистки выделяемых из смеси синтезированных молекул промежуточных пептидов для последующего возврата их в реакционную смесь для дальнейшего синтеза приводит к значительному увеличению продолжительности процесса синтеза конечного продукта. В связи с тем, что применяемые в способе реактивы конденсирующие агенты, необходимые для осуществления реакций образования пептидных связей, могут реагировать и с группами аминокислот, находящихся в смеси, но не участвующих в образовании нужных пептидных связей, такие группы аминокислот химически "блокируют", а затем удаляют из реакционной смеси. По этим причинам описанный процесс синтеза пептидов является многостадийным: блокирование-конденсация-деблокирование, требует сложной технологической оснастки, трудоемок. В среднем синтез одной пептидной связи имеет продолжительность около 3 ч, а выход конечного продукта за один цикл составляет 50-90% от количества сухого вещества исходного продукта. Известно устройство для синтеза пептидов путем химического синтеза пептидной последовательности, содержащее емкость для размещения раствора, снабженную средствами для подачи и отбора раствора аминокислот, дозированной подачи в раствор дополнительно компонентов, необходимых для осуществления направленного синтеза, и средством обеспечения фильтрации раствора в процессе синтеза ((Merrifield R. B. "Automated Synthesis of Peptides", Scince, 1965, p. 150, 178-185). В основу изобретения положена задача создания в способе получения пептидов таких физико-химических условий, которые бы позволили увеличить количество свободных ионов аминокислот в реакционной смеси, повысить из активность и упорядочить движение для наиболее эффективного использования энергии синтеза, а также создание устройства для осуществления такого способа. При создании способа получения пептидов был использован принцип избирательности управляемой дегидратации и активации молекул аминокислот в растворе при комбинированном воздействии на раствор электрическим и магнитным полями в условиях управляемого раствора. Поставленная задача решается тем, что в способе получения пептидов путем синтезирования из раствора, содержащего в качестве компонентов аминокислоты, предварительно по меньшей мере часть компонентов переводят в ионизированное состояние и затем раствор подвергают одновременному воздействию скрещенных между собой электрического поля и магнитного поля, имеющего однонаправленные постоянную и переменную магнитные составляющие, при этом частота переменной составляющей соответствует собственной частоте циклоидного движения компонентов раствора. При этом перевод компонентов в ионизированное состояние осуществляют изменением pH раствора. Поставленная задача решается также тем, что устройство для получения пептидов, содержащее емкость для размещения раствора, снабженную средством для подачи и отбора раствора, снабжено регулятором pH раствора и источником магнитного поля, образованного двумя охватывающими емкость и размещенными коаксиально одна в другой магнитными катушками, одна из которых соединена с источником постоянного, а другая с источником переменного тока, а внутри емкости установлены два подключенные к источнику тока электрода из биологически инертного материала и расположенные так, что создаваемые электрическое поле и магнитное поле сокращены между собой, и при этом емкость выполнена термостатируемой. Для наилучшего понимания предлагаемого способа рассмотрим сначала вариант выполнения устройства, предлагаемого для его осуществления, которое поясняется чертежом. Устройство для получения пептидов способом согласно изобретению содержит емкость 1 из биологически инертного материала, например пластмассы, для размещения исходного раствора, которая снабжена средством 2 для подачи раствора из соединенного с емкостью 1 резервуара 3 и средством 4 для отбора раствора из емкости 1, соединенного с резервуаром 5 конечного продукта. Средства 2 и 4 обеспечивают подачу и отбор раствора с помощью известных средств, например с помощью пневматического насоса. Емкость 1 выполнена термостатируемой, например, путем размещения внутри корпуса емкости 1 термостата 6, например, с жидким теплоносителем, например водой, скорость подачи и температура которого регулируется блоком 7 управления. В емкости 1 установлены датчик 8 pH раствора, соединенный с регулятором pH раствора, содержащим блок 9 управления и емкости 10 для кислоты и 11 для щелочи. Емкость 1 помещена внутрь расположенных коаксиально одна в другой магнитных катушек 12 и 13 любой известной конструкции, магнитная катушка 12 подключена к источнику 14 постоянного тока, а магнитная катушка 13 к источнику 15 переменного тока. Внутри емкости 1 установлены электроды 16 из биологически инертного материала, например золота или платины, подсоединенные к источнику 17 постоянного тока. Взаимное расположение электродов 16 и магнитных катушек 12 и 13 обеспечивает направление векторов электрического













где q и m заряд и масса иона компонента;
B0 индукция постоянного магнитного поля. Сочетание одновременного воздействия вышеописанных полей на компоненты раствора с подогревом и ионизацией раствора создает наиболее благоприятные условия для протекания процесса образования пептидных связей. Экспериментально установлено, что время такого воздействия на аминокислоты для синтезирования пептида должно составлять не менее 15 мин. Для синтезирования более крупных молекул пептидов время воздействия электрическим и магнитным полями увеличивают, предварительно переводя последовательно присоединяемые компоненты в ионизированное состояние путем изменения pH раствора, и добавляют в электрический сигнал, подаваемый на катушку переменного магнитного поля, частотную гармонику, соответствующую собственной циклоидной частоте присоединяемого компонента. По окончании процесса синтеза раствор охлаждают и с помощью устройства, имеющегося в емкости, отбирают конечный продукт. Количественные и качественные характеристики конечного продукта определяют с помощью химического и физического пептидов по их видам на основе данных замеренной оптической плотности пептида, а также известными методами определения количества сухого вещества. Такое осуществление способа получения пептидов позволяет увеличить количество свободных ионов аминокислот в растворе, активизировать их для наиболее эффективного синтеза, а также за счет упорядочения движения молекул компонентов в растворе снизить потери энергии системы. Способ является одностадийным, не требует промежуточной очистки компонентов раствора от примесей. Количество примесей в конечном продукте невелико. Выход конечного продукта составляет 60-92% от сухого вещества исходного продукта. Продолжительность одного цикла получения пептидов составляет около 20 мин. Пример 1. Получение пептида
NH2 глутаминовая кислота триптофан (тимоген). Для синтеза пептида в качестве исходного продукта использовали раствор аминокислот глутаминовой кислоты (Glu) и триптофана (Try) в дистиллированной воде: по 2



Электрический сигнал, создающий переменное магнитное поле, содержал гармоники частот 3, 11 и 2,33 Гц, соответствующих собственным частотам


Для синтеза пептида в качестве исходного продукта использовали эквимолярный раствор аспарагина (ASP-) и аспарагиновой кислоты (Asn+) в дистиллированной воде: по 2,27 М сухого вещества каждого компонента раствора в 10 мл воды. pH раствора смещали до 3,2, затем раствор подогревали до 30oC. Создавали электрическое поле напряженностью E 0,5 В/м. Создавали постоянное магнитное поле с индукцией B0 30


Для синтеза трипептида в качестве исходного продукта использовали 10 мл эквимолярного раствора, содержащего по 2






Для синтеза пептида в качестве исходного продукта использовали два пептида Arg-Lys и Glu-Try в эквимолярных концентрациях по 3



Для синтеза пептида в качестве исходного продукта использовали эксимолярный раствор аминокислот Cys и Ser в фосфатном буфере: по 4


при величине напряженности электрического поля E=10 B/м, величине индукции магнитного поля B0 10


при величине E=10 B/м; B0 100

при величине E=5 B/м; B0 50

Класс C07K5/04 содержащие только нормальные пептидные связи
Класс C07K1/24 электрохимическими способами
Класс C07K1/00 Общие способы получения пептидов
Класс B01J19/12 с использованием электромагнитных волн