очистка и применение фактора, способствующего заживлению ран

Формула изобретения

1. Способ очистки фактора, способствующего заживлению ран, выбранного из фактора роста гепатоцитов (HGF), из источника, содержащего указанный фактор, где все стадии способа очистки осуществляют в присутствии антитромбина III (AT-III), при этом способ включает:

(i) размораживание замороженного источника, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и удаление осадка из размороженного источника;

(ii) приведение раствора, полученного на стадии (i), содержащего супернатант и антитромбин III, в контакт с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина;

(iii) отделение раствора от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина и приведение носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина в контакт с десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, и

(iv) сбор десорбционного буфера, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, антитромбин III (AT-III) и богатый гистидином гликопротеин (HRGP).

2. Способ по п.1, включающий стадии:

(i) размораживание источника, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и представляющего собой замороженную кровь, удаление осадка из размороженного источника с получением супернатанта;

(ia) приведение супернатанта стадии (i) в контакт с носителем для анионообменной хроматографии в буферном растворе, необходимом для анионообменной хроматографии, причем буферный раствор содержит соли в концентрациях, сравнимых с физиологическими, и имеет значение рН, близкое к нейтральному;

(ib) отделение носителя для анионообменной хроматографии от раствора, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и AT-III;

(ii) приведение раствора, полученного на стадии (ib), в контакт с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина;

(iii) отделение раствора от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, и

(iv) сбор десорбционного буфера, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, антитромбин III (AT-III) и богатый гистидином гликопротеин (HRGP).

3. Способ по п.1, включающий стадии:

(i) размораживание источника, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и представляющего собой замороженную плазму крови, содержащую фактор, способствующий заживлению ран, удаление осадка из размороженной плазмы крови с получением супернатанта;

(ia) добавление к супернатанту неорганического адсорбирующего вещества, выбранного из группы, состоящей из диатомовой земли, силикагеля или глинозема, и инкубацию в течение достаточного времени для связывания нежелательных примесей;

(ib) добавление низшего алифатического спирта, такого как C₁-C₄ спирт, к смеси этапа (ia) с получением фракции Кона I и супернатанта;

(ic) удаление осадка, если таковой имеется, и неорганического адсорбирующего вещества;

(ii) контактирование супернатанта фракции Кона I, полученного на этапе (ic), который представляет собой раствор, содержащий фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и богатый гистидином гликопротеин (HRGP), с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина;

(iii) отделение раствора от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина и контактирование носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина с десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, и

(iv) сбор десорбционного буфера, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и богатый гистидином гликопротеин (HRGP).

4. Способ по п.1, включающий стадии:

(i) размораживание источника, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и представляющего собой замороженную плазму крови, удаление осадка из размороженной плазмы крови;

(ia) приведение супернатанта в контакт с носителем для анионообменной хроматографии в буферном растворе, необходимом для анионообменной хроматографии, причем буферный раствор содержит соли в концентрациях, сравнимых с физиологическими, и имеет значение рН, близкое к нейтральному, при этом фактор, способствующий заживлению ран, антитромбин III (AT-III) и богатый гистидином гликопротеин (HRGP) остаются несвязанными, а другие белки, содержащие один или несколько белков из протромбина, фактора Х и фактора IX, связываются с носителем для анионообменной хроматографии;

(ib) отделение носителя для анионообменной хроматографии от раствора, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и HRGP;

(ic) добавление неорганического адсорбирующего вещества, выбранного из группы, состоящей из диатомовой земли, силикагеля и глинозема, к раствору этапа (ib) и инкубацию в течение достаточного времени для связывания нежелательных примесей, содержащих фактор XII и/или активатор прекалликреина;

(id) добавление низшего алифатического спирта, такого как C₁-C ₄ спирт, к смеси этапа (ic) с получением фракции Кона I и супернатанта;

(ie) удаление осадка, если таковой имеется, и неорганического адсорбирующего вещества;

(ii) контактирование супернатанта фракции Кона I, полученной на этапе (ie), который представляет собой раствор, содержащий фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и богатый гистидином гликопротеин (HRGP), с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина;

(iii) отделение раствора от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина и контактирование носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина с десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, и

(iv) сбор десорбционного буфера, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и богатый гистидином гликопротеин (HRGP).

5. Способ по п.1, включающий стадии:

(i) размораживание источника, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, и представляющего собой замороженную плазму крови, удаление осадка;

(ii) приведение полученного раствора, содержащего супернатант и антитромбин III, в контакт с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина;

(iii) отделение раствора от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина и приведение носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина в контакт с десорбционным буфером с ионной силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, и

(iv) сбор фактора, способствующего заживлению ран, антитромбина III (AT-III) и богатого гистидином гликопротеина (HRGP).

6. Способ по любому из пп.1-5, в котором собранный фактор, способствующий заживлению ран, концентрируют или подвергают диафильтрации с получением концентрированного раствора.

7. Способ по любому из пп.1-5, дополнительно включающий стадию инактивации вирусов после сбора фактора, способствующего заживлению ран, AT-III и богатого гистидином гликопротеина (HRGP).

8. Способ по п.7, в котором стадия инактивации вирусов включает применение химического вещества, инактивирующего вирусы.

9. Способ по п.8, в котором фракцию, обработанную химическими веществами, инактивирующими вирусы, дополнительно подвергают хроматографии на фосфате целлюлозы.

10. Способ по п.8, в котором фракцию, обработанную химическими веществами, инактивирующими вирусы, подвергают анионообменной хроматографии с последующей катионообменной хроматографией.

11. Способ по любому из пп.1-5, в котором к элюированному и собранному фактору, способствующему заживлению ран, добавляют осаждающий буфер для получения осадка, который затем фильтруют и обрабатывают буфером для выделения фактора, способствующего заживлению ран, и антитромбина III (AT-III).

12. Способ по любому из пп.1-5, в котором фактор, способствующий заживлению ран, обрабатывают с целью снижения содержания патогенов с помощью по меньшей мере одного из следующих методов:

(i) инактивация вирусов с помощью раствора детергента в растворителе;

(ii) инактивация вирусов с помощью облучения ультрафиолетовым светом или радиоактивного облучения;

(iii) инактивация вирусов путем тепловой обработки;

(iv) удаление вирусов с помощью вирусных фильтров.

13. Способ по любому из пп.1-5, в котором фактор, способствующий заживлению ран, подвергают дальнейшей очистке с использованием катионообменной смолы, при которой фактор, способствующий заживлению ран, и богатый гистидином гликопротеин (HRGP) связываются со смолой, и которая включает одну из следующих стадий:

(i) фракцию фактора, способствующего заживлению ран, и HRGP элюируют с катионообменной смолы буфером, обладающим проводимостью при комнатной температуре, выбранной из группы, состоящей из 10-450 мСм/см, 20-200 мСм/см и 30-100 мСм/см;

(ii) при проведении хроматографии рН поддерживают на уровне, выбранном из группы, состоящей из рН 6-9, рН 6,5-8 и рН 6,75-7,25; и

(iii) заряженные группы катионообменной смолы присоединяют к смоле с помощью слабогидрофобных полимерных углеродных цепей, состоящих примерно из 10-100 мономерных звеньев.

14. Способ по любому из пп.1-5, дополнительно включающий стадию катионообменной хроматографии после сбора фактора, способствующего заживлению ран, AT-III и богатого гистидином гликопротеина (HRGP).

15. Способ по п.14, в котором катионообменную смолу обрабатывают буфером с ионной силой, достаточной для элюции фракции, содержащей AT III, и далее обрабатывают катионообменный материал буфером с ионной силой, достаточной для элюции фактора, способствующего заживлению ран, и HGRP, которые собирают.

16. Способ по п.15, в котором фракцию, содержащую фактор, способствующий заживлению ран, и HGRP, концентрируют или подвергают диафильтрации.

17. Способ по любому из пп.1-5, дополнительно включающий стадию нанофильтрации.

18. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что полученный фактор, способствующий заживлению ран, подвергают дальнейшей очистке путем высаливания, при котором богатый гистидином гликопротеин (HRGP) осаждается, следующим образом: используют соль в соответствии с рядом Гофмейстера, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из сульфата натрия, фосфата натрия, цитрата натрия, сульфата аммония и их комбинаций; концентрацию соли выбирают в интервале, выбранном из группы, состоящей из 0,3-3 М, 0,5-2 М и 0,75-1,5 М; рН раствора выбирают в интервале, выбранном из группы, состоящей из 4-10, 6-9 и 7-8; полученный осадок удаляют путем фильтрации или центрифугирования.

19. Композиция для заживления раны, содержащая фактор, способствующий заживлению ран, который представляет собой фактор роста гепатоцитов (HGF), полученная способом по любому из пп.1-18, где композиция также содержит один или два стабилизатора, выбранных из антитромбина III (AT-III) или богатого гистидином гликопротеина.

20. Композиция для заживления раны по п.19, в которой указанный фактор представляет собой активированную или неактивированную форму, или их комбинацию.

21. Композиция для заживления раны по п.19, дополнительно содержащая химические стабилизаторы, выбранные из группы, состоящей из полиолов, сахаридов и аминокислот.

22. Фармацевтическая композиция для заживления раны, содержащая композицию по п.19 и фармацевтически приемлемый носитель.

23. Фармацевтическая композиция для заживления раны по п.22, в которой фактор, способствующий заживлению ран, находится в жидкой или лиофизированной форме.

24. Лекарственная форма для заживления раны, содержащая композицию по п.19, при этом лекарственная форма находится в виде геля, мази или спрея.

25. Композиция для заживления раны, содержащая очищенный фактор, способствующий заживлению ран, обогащенная фракцией богатого гистидином гликопротеина (HRGP), полученная способом по любому из пп.1-18.

26. Композиция для заживления раны, содержащая очищенный фактор, способствующий заживлению ран, обогащенная фракцией богатого гистидином гликопротеина (HRGP), полученная способом по любому из пп.1-18, где способ включает после проведения аффинной хроматографии на гепариновом носителе и инактивации вирусов, обработку смеси, полученной на стадии инактивации вирусов, фосфатом целлюлозы.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к способам очистки и применения белкового фактора, получаемого из плазмы крови, для облегчения заживления ран. Отдельные аспекты изобретения включают способы очистки и защиты молекулы от деградации in vivo и in vitro.

Уровень техники

HGF является одним из факторов, способствующих заживлению ран, и представляет собой белок, который экспрессируется в мезенхимальных клетках, таких как легочные макрофаги и фибробласты, купферовских клетках в печени и лейкоцитах. HGF является цитокином, секретируемым при повреждении клеток, который, по-видимому, играет важную роль в регенерации определенных органов и заживлении ран. С точки зрения химического строения HGF представляет собой гликопротеин, который изначально синтезируется в клетке в виде нативного (неактивного) предшественника. Впоследствии молекула предшественника расщепляется в поврежденном органе с получением активного HGF с помощью специального активатора. HGF и другие факторы связываются с гепарином; это связывание, по-видимому, необходимо для активации HGF и связывании его со своим рецептором. Рецептором, связывающимся с HGF, является c-MET. Поскольку экспрессия c-MET понижена только в поврежденных органах, только клетки этих органов реагируют на взаимодействие HGF с рецептором. Примерами факторов роста, связывающихся с гепарином и воздействующих на процесс заживления ран, могут служить: тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста эпидермиса (EGF), трансформирующий фактор роста (TGF- ), трансформирующий фактор роста (TGF- ), инсулиноподобный фактор роста (IGF-I) и фактор роста фибробластов (FGF).

Антитромбин III (AT-III) представляет собой гликопротеин плазмы, который ингибирует сериновые протеазы в каскаде коагуляции и, таким образом, играет важнейшую роль в регуляции свертывания крови. АТ-III является ингибитором факторов свертывания крови IXa, Xa, XI, Xlla и тромбина. Таким образом, АТ-III регулирует образование сгустка на разных ступенях каскада коагуляции. Даже небольшое понижение концентрации АТ-III в крови приводит к повышению риска тромбоэмболии. Концентрированные препараты AT-III используют для профилактики и лечения тромбоэмболических заболеваний у пациентов с врожденным или приобретенным дефицитом AT-III. Кроме того, было показано, что AT-III участвует во многих других биологических процессах, включая ангиогенез и реакции воспаления. Механизм действия AT-III в этих процессах еще не раскрыт полностью.

Из уровня техники известен способ очистки AT-III с помощью аффинной хроматографии, использующей гепарин в качестве лиганда, связанного с твердофазным носителем. В работе Миллер-Андерссона и соавт. описывается использование гепарин-сефарозы для очистки человеческого АТ-III (Miller-Andersson et al., Thrombosis Research 5, 439-452, 1974). Описанная методика, включающая ионообменную и гель-фильтрационную хроматографию, обеспечивает выход продукта 34%.

Богатый гистидином гликопротеин (HRGP) представляет собой одноцепочечный протеин плазмы крови, впервые выделенный в 1972 г. Физиологическая функция HRGP до сих пор точно не известна. Поскольку HRGP взаимодействует с гепарином, фибриногеном и фибрином, плазминогеном и активированными тромбоцитами, предполагается, что HRGP является модулятором коагуляции и фибринолизиса (Koide, T. In: Fibrinolysis: current prospects. Gaffney, PJ (Ed.), John Libbey & Co., London 1988, p. 55-63). Полипептидная цепь HRGP содержит 507 полипептидных остатков и содержит участки гомологии с другими белками плазмы, например, AT-III (Koide, T. Et al., (1986) Biochemistry 25, 2220-2225).

Сущность изобретения

Активная форма фактора, способствующего заживлению ран, быстро разрушается в организме, особенно в области ран, где активируется коагуляция и система протеолиза, включающая протеазы. В процессе очистки in vitro также важно предотвратить деградацию как нативной, так и активной форм фактора, способствующего заживлению ран. Про один из факторов, HGF, известно, что он переносится в крови в форме неактивного предшественника и активируется во время процесса заживления ран особыми активаторами. Например, неактивная (денатурированная) форма HGF может быть выделена в небольших количествах с помощью практически всех протестированных методов очистки, в то время как активированная и/или неактивированная форма может быть выделена только с помощью метода, описанного в настоящем изобретении. Неожиданно было обнаружено, что удаление протеаз и/или предшественников протеаз в сочетании с совместной очисткой двух стабилизаторов HGF (АТ-III и/или HRGP) приводило к увеличению выхода активированной или неактивированной формы HGF, которая легко переводится в активную форму. Поскольку обычно HGF in vivo циркулирует в крови в форме неактивного предшественника, очевидно, что медицинский препарат, представляющий собой нативную и/или активную форму HGF, может быть полезным при лечении многих заболеваний и нарушений в организме, в особенности там, где возможно местное нанесение препарата, например, при заживлении ран. Подобное может оказаться справедливым и для других факторов роста, связывающихся с гепарином, как-то: тромбоцитарного фактора роста (PDGF), фактора роста эпидермиса (EGF), трансформирующего фактора роста (TGF- ), трансформирующего фактора роста (TGF- ), инсулиноподобного фактора роста (IGF-1) и фактора роста фибробластов (FGF). Ожидается, что присутствие АТ-III и HRGP улучшит результаты очистки и применения этих факторов роста.

В зависимости от способа применения, активированная и/или неактивированная форма фактора, способствующего заживлению ран, может поставляться в присутствии или в отсутствие двух специфических стабилизаторов, AT-III и HRGP, которые являются ингибиторами протеолитической деградации нативной и активированной формы фактора, способствующего заживлению ран, таким образом, их использование повышает эффективность и время полужизни продукта. В зависимости от способа нанесения в некоторых случаях предпочтительно вводить пациенту только активированную или неактивированную форму фактора, способствующего заживлению ран, в других случаях предпочтительно вводить смесь этих форм с добавлением выбранных стабилизаторов AT-III и HRGP. Это зависит от того, насколько быстро должен действовать фактор, способствующий заживлению ран. Очевидно, что сходный принцип подходит и для других факторов роста, связывающихся с гепарином и обладающих сходными с HGF свойствами, например, тромбоцитарного фактора роста (PDGF), фактора роста эпидермиса (EGF), трансформирующего фактора роста (TGF- ), трансформирующего фактора роста (TGF- ), инсулиноподобного фактора роста (IGF-1) и фактора роста фибробластов (FGF).

Изобретение относится к способу получения композиции, содержащей очищенный фактор, способствующий заживлению ран, из источников, содержащих фактор, способствующий заживлению ран, в частности, крови, причем стадии очистки фактора осуществляют в присутствии антитромбина III (АТ-III), богатого гистидином гликопротеина (HRGP), или их комбинации. Факторы, способствующие заживлению ран, выбирают из группы, включающей фактор роста гепатоцитов (HGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста эпидермиса (EGF), трансформирующий фактор роста (TGF- ), трансформирующий фактор роста (TGF- ), инсулиноподобный фактор роста (IGF-1) и фактор роста фибробластов (FGF), полученные из различных источников, в частности, крови, содержащих фактор, способствующий заживлению ран, причем способ получения включает стадии очистки, которые проводят в присутствии антитромбина III (АТ-III).

Способ согласно изобретению можно осуществлять с помощью следующих стадий:

- (i) размораживания замороженной крови, удаления осадка и дальнейшей обработки супернатанта;

- (ii) приведения супернатанта в контакт с носителем для анионообменной хроматографии в буферном растворе для анионообменной хроматографии, причем буферный раствор содержит соль в концентрации, сравнимой с физиологической, и имеет значение pH, близкое к нейтральному, при этом основная часть белков находится в несвязанном состоянии (включая факторы, способствующие заживлению ран, АТ-III, HRGP, альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и др.), а специфические белки и протеазы связываются анионной смолой (например, протромбином, фактором X, фактором IX и др.);

- (iii) отделение носителя для анионообменной хроматографии с получением раствора (содержащего факторы, способствующие заживлению ран, AT-III, HRGP, альбумин, IgG, транферрин, гаптоглобин и др.);

- (iv) приведение раствора в контакт с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина, причем основная часть белков остается несвязанной (альбумин, IgG, транферин, гаптоглобин и др.);

- (v) отделение раствора и обработка носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина десорбционным буфером с ионном силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, от носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина (необязательно, промывание гепарин-сефарозного носителя промывочным буфером до десорбции фракции, содержащей факторы, способствующие заживлению ран, причем промывочный раствор имеет повышенную ионную силу, достаточную для десорбции примесных белков (например, кофактора гепарина II), но недостаточную для десорбции факторов, способствующих заживлению ран;

- (vi) сбор десорбционного буфера, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, AT-III и HRGP.

Во втором варианте осуществления способ согласно изобретению может включать следующие стадии:

(i) размораживание замороженной плазмы крови, необязательное удаление осадка и дальнейшая обработка супернатанта;

(ii) добавление неорганического адсорбирующего вещества, такого как диатомовая земля, силикагель или глинозем, и инкубация в течение достаточного времени для связывания нежелательных примесей, например, фактора XII, активатора прекалликреина и т.д.;

(iii) добавление низшего алифатического спирта, например, С ₁-С₄ спирта с получением фракции Кона I;

(iv) удаление осадка, если таковой имеется, и неорганического адсорбирующего вещества;

(v) пропускание супернатанта фракции Кона I через носитель для аффинной хроматографии, при котором нативная и активная форма фактора, способствующего заживлению ран, AT-III и HRGP (нативная и активная форма фактора, способствующего заживлению ран, AT-III и HRGP далее в тексте обозначены HAH) связываются с носителем колонки, тогда как основная часть других белков плазмы (например, альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и т.д.) остается несвязанной и удаляется;

(vi) элюирование и сбор фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии, необязательно, обработка аффинной смолы промывочным буфером перед десорбцией факторов, способствующих заживлению ран, причем промывочный раствор имеет повышенную ионную силу, достаточную для десорбции примесных белков (например, кофактора гепарина II и др.), но недостаточную для десорбции факторов, способствующих заживлению ран.

В третьем варианте способа согласно изобретению могут осуществляться следующие стадии:

(i) размораживание замороженной плазмы крови, необязательное удаление осадка и дальнейшая обработка супернатанта;

(ii) приведение супернатанта в контакт с носителем для анионообменной хроматографии в буферном растворе для анионообменной хроматографии, при этом буферный раствор содержит соли в концентрациях, сравнимых с физиологическими, и имеет значение pH, близкое к нейтральному, причем основная часть белков является несвязанной (включая фактор, способствующий заживлению ран, АТ-III, HRGP, альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и др.), и специфические белки и протеазы связываются анионной смолой (например, протромбин, FX, FIX и др.);

(iii) отделение носителя для анионообменной хроматографии с получением раствора (содержащего фактор, способствующий заживлению ран, AT-III, HRGP, альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и др.);

(iv) добавление неорганического адсорбирующего вещества, такого как диатомовая земля, силикагель или глинозем, и инкубация в течение достаточного времени для связывания нежелательных примесей, например, фактора XII, активатора прекалликреина и т.д.;

(v) добавление низшего алифатического спирта, например, С₁-С₄ спирта с получением фракции Кона I;

(vi) удаление осадка, если таковой имеется, и неорганического адсорбирующего вещества;

(vii) пропускание супернатанта фракции Кона I через носитель для аффинной хроматографии, при котором активные факторы, способствующие заживлению ран, AT-III и HRGP (HAH) связываются с носителем, тогда как основная часть других белков плазмы (например, альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и т.д.) остается несвязанной и удаляется;

(viii) элюирование и сбор факторов, способствующих заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии (необязательно, промывка аффинной смолы промывочным буфером перед десорбцией факторов, способствующих заживлению ран, причем промывочный раствор имеет повышенную ионную силу, достаточную для десорбции примесных белков, но недостаточную для десорбции факторов, способствующих заживлению ран.

Четвертый вариант способа согласно изобретению осуществляют при помощи следующих стадий:

(i) размораживание замороженной плазмы крови, необязательное удаление осадка и дальнейшая обработка супернатанта;

(ii) пропускание супернатанта через носитель для аффинной хроматографии, при котором активный фактор, способствующий заживлению ран, АТ-III и HRGP (HAH) связываются носителем, тогда как основная часть других белков плазмы (например, альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и т.д.) остается несвязанной и удаляется;

(iii) элюирование и сбор фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии (необязательно, промывка аффинной смолы промывочным буфером перед десорбцией фактора, способствующего заживлению ран, причем промывочный раствор имеет повышенную ионную силу, достаточную для десорбции примесных белков (например, кофактора гепарина II), но недостаточную для десорбции факторов, способствующих заживлению ран).

В особом воплощении настоящего изобретения способ включает инактивацию вирусов, в частности, после стадии (vi). Инактивацию вируса на данной стадии способа осуществляют предпочтительно с помощью химических веществ, способных инактивировать вирусы. Подобный процесс инактивации, так называемый процесс сольвент/детергентной инактивации, подробно рассмотрен в патентной заявке № EP-A-131740. Содержание патентной заявки № EP-A-131740 включено в виде ссылки в настоящую заявку. После стадии инактивации вируса возможно проведение анионообменной хроматографии. Также возможно проведение катионообменной хроматографии, в частности, после анионообменной хроматографии. В дальнейшем воплощении изобретения проводят хроматографию на фосфате целлюлозы. Хроматография на фосфате целлюлозы может быть предпочтительной, поскольку такая хроматография является достаточной. Однако может быть предпочтительным проведение хроматографии на фосфате целлюлозы в комбинации с анионообменной и/или катионообменной хроматографией.

Как правило, фракцию, содержащую HGF, наносят на целлюлозофосфатный носитель в буфере, позволяющем HGF адсорбироваться на целлюлозофосфатном носителе. Элюирование HGF обычно проводится буферами с ионной силой 0,05 М хлорида натрия или его эквивалента.

В соответствии с настоящим изобретением фракции, полученные при выполнении альтернативных вариантов способа, могут быть сконцентрированы или подвергнуты диафильтрации для получения концентрата. Этот концентрат может быть подвергнут дальнейшей обработке, в частности, путем контакта с катионообменным носителем. Катионообменный носитель обрабатывают буфером с ионной силой, необходимой для элюции фракции А1, содержащей в основном (>90%) АТ-III, и далее обрабатывают буфером с большей ионной силой, необходимой для преимущественной элюции фактора, способствующего заживлению ран, и HRGP, которые затем собирают. Фактор, способствующий заживлению ран, и HRGP концентрируют или подвергают диафильтрации с получением фракции А2.

Во втором альтернативном варианте способа, согласно настоящему изобретению, включающем добавление к концентрату осаждающего буфера, проводят фильтрацию, и к осадку добавляют буфер для выделения фактора, способствующего заживлению ран, и HRGP.

Дальнейшая очистка полученного концентрата нативных факторов, способствующих заживлению ран, с использованием катионообменной смолы, при которой нативный фактор, способствующий заживлению ран, и HRGP связываются со смолой, может быть осуществлена с помощью по меньшей мере одним из следующих факторов:

(i) фракцию факторов, способствующих заживлению ран, и HRGP элюируют с катионообменной смолы буфером, обладающим проводимостью 10-450 мСм/см при комнатной температуре, более предпочтительно 20-200 мСм/см, наиболее предпочтительно 30-100 мСм/см;

(ii) при проведении хроматографии pH поддерживают на уровне 6-9, в частности, 6,5-8 или 6,75-7,25;

(iii) заряженные группы катионообменной смолы присоединяют к смоле с помощью слабогидрофобных полимерных углеродных цепей, состоящих из 10-100 мономерных звеньев.

Более подробно, условия для проведения второго альтернативного варианта способа очистки полученного концентрата фактора, способствующего заживлению ран, с использованием стадии высаливания, на которой HRGP осаждается, включают:

(i) использование соли в соответствии с рядом Гофмейстера, предпочтительно выбранной из группы, состоящей из сульфата натрия, фосфата натрия, цитрата натрия, сульфата аммония и их комбинаций;

(ii) концентрацию соли выбирают в интервале 0,3-3 М, в частности 0,5-2 М или 0,75-1,5 М;

(iii) рН раствора выбирают в интервале 4-10, в частности 6-9 или 7-8;

(iv) полученный осадок удаляют фильтрованием или центрифугированием.

Для получения пригодного к коммерческому употреблению фактора, способствующего заживлению ран, полученный концентрат нативного фактора, способствующего заживлению ран, обрабатывают с целью очистки от патогенов с помощью по меньшей мере одного из следующих методов:

(i) инактивация вирусов с помощью раствора детергента в растворителе;

(ii) инактивация вирусов с помощью облучения светом, например, UVC, или радиоактивного облучения;

(iii) инактивация вирусов путем тепловой обработки;

(iv) удаление вирусных частиц с помощью вирусных фильтров.

Объектом настоящего изобретения является также композиция, полученная способом согласно настоящему изобретению, содержащая активированную и/или неактивированную форму фактора, способствующего заживлению ран, активную форму фактора, способствующего заживлению ран или их комбинацию.

В одном воплощении изобретения, композиция содержит активированную и/или неактивированную форму фактора, способствующего заживлению ран, а также АТ-III для повышения стабильности фактора, способствующего заживлению ран, in vivo и in vitro. В другом воплощении изобретения композиция содержит активированную и/или неактивированную форму фактора, способствующего заживлению ран, к которому добавляют HRGP для повышения стабильности нативного фактора, способствующего заживлению ран, in vivo и in vitro. В частности, фактор, способствующий заживлению ран, полностью находится в активированной форме, или фактор, способствующий заживлению ран, находится в неактивной форме.

Предпочтительно добавление стабилизаторов, выбранных из группы, содержащей сахариды и аминокислоты, к фракциям, содержащим фактор, способствующий заживлению ран, и HRGP. Как правило, в роли стабилизаторов могут выступать полиол, аргинин, трегалоза, лизин, маннит или их комбинации.

Объектом настоящего изобретения также является фармацевтическая композиция, содержащая композицию согласно настоящему изобретению.

В фармацевтической композиции фактор, способствующий заживлению ран, может присутствовать в активированной и/или неактивированной форме. Предпочтительно, чтобы фактор, способствующий заживлению ран, содержался в композиции в жидкой или лиофилизированной форме в составе для местного применения, такого как гель, спрей или аналогичной формы, в концентрации, обеспечивающей приблизительную дозировку 1-10 нг фактора, способствующего заживлению ран на см² раны в день. В зависимости от способа применения композиция также может вводиться с использованием одного или более следующих путей введения: внутривенно, внутримышечно, подкожно, интратекально, ректально или путем ингаляции.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ

Количественное определение АТ-III

Для измерения биологической активности (МЕ/мл) АТ-III измеряли его активность в качестве кофактора гепарина в реакции ферментативного расщепления хромогенного субстрата H-D-Phe-Pip-Arg-pNA 2 HCl (Chromogenix, Sweden) тромбином в присутствии гепарина и AT-III. Более полное описание методики см. Frantzen Handeland et al. (Scand. J. Haematol. 31, 427-436, 1983) и van Voorhuizen et al. (Thromb. Haemostas. 52(3), 350-353, 1984).

Общий белок

Концентрацию общего белка определяли путем измерения поглощения света с длиной волны 280 нм (A ₂₈₀). Концентрацию (мг/мл) для растворов AT-III рассчитывали с использованием коэффициента 6,4 МЕ/мг.

Удельную активность (SA) AT-III определяли как отношение между активностью кофактора гепарина, исчисляемой в МЕ/мл, и А₂₈₀.

Количественное определение богатого гистидином гликопротеина

Количественное определение HRGP проводили с использованием метода ракетного электрофореза, в котором высота «ракеты» пропорциональна концентрации антигена (Laurell, C-B, (1966) Analyt. Biochem. Vol. 15, p. 45; and Laurell, C-B (1972) J. Clin. Lab. Invest. Vol. 29, suppl. 124, p. 21). Кроличьи антитела против HRGP (Behringwerke) добавляли в 1% гель из агарозы А (Amersham Pharmacia Biotech). Образец HRGP объемом 5 мкл наносили на гель, электрофорез проводили в течение ночи при 150В и 1В/см. Полученный комплекс антиген-антитело окрашивали и сравнивали со стандартом (сыворотка крови человека).

Изоэлектрическое фокусирование

Изоэлектрическое фокусирование проводили с использованием системы PhastSystem (Amersham Pharmacia Biotech) на готовых гелях; изоэлектрическая точка pI 3-9 согласно инструкции по методике разделения белков Phast файл № 100 (см. приложенное изображение).

Характеризация HGF

Чтобы подтвердить присутствие интактного HGF, обладающего полным спектром свойств, присущих этому цитокину, проводили анализ по методике Вестерн-блот. Для этого вначале проводили электрофорез белков в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), как в присутствии, так и в отсутствие восстанавливающих агентов. После переноса белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану мембрану инкубировали в растворе антител, специфичных к человеческому HGF (имеющиеся в продаже антитела производства R&D Systems, Inc.), а затем в растворе конъюгированных вторых антител, специфичных к первым антителам (имеющиеся в продаже антитела производства R&D Inc.). Визуализацию антигена (белка) проводили с помощью цветной реакции.

Количественное определение HGF

Для определения относительных массовых долей HGF естественного происхождения использовали имеющуюся в продаже систему для проведения твердофазного иммуноферментного анализа (solid phase ELISA, производство R&D Systems, Inc.), разработанную для определения уровня HGF в культуральной среде, сыворотке и плазме крови.

Планшет для иммуноферментного анализа предварительно покрывали антителами к HGF. Образцы и контроли наносили в лунки планшета, в результате чего весь HGF, присутствующий в растворах, связывался с иммобилизированными антителами. После отмывки несвязанных веществ в лунки добавляли поликлональные антитела, специфичные к HGF, ковалентно связанные с ферментом. После отмывки лунок с целью удаления несвязанных антител в комплексе с ферментом в лунки добавляли раствор субстрата. Субстрат расщепляли ферментом с образованием окрашенного продукта, таким образом, интенсивность цвета пропорциональна количеству HGF, связавшегося с антителами в ходе первого этапа методики. После остановки цветной ферментативной реакции определяли оптическую плотность раствора в каждой лунке при длине волны 450 нм с помощью ридера для микропланшетов.

Биологическая активность HGF

Биологическую активность определяли с помощью имеющихся в продаже тестов на заживление экспериментальной раны, миграцию и пролиферацию клеток. См. B. Rafferty et al. (J. Immunol. Methods 258 (2001) 1-11).

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Очистка нативного (активного) HGF, стабилизированного AT-III и HRGP согласно изобретению.

Стадия 1

Объединенную свежезамороженную плазму крови здоровых доноров в количестве 1 200 кг размораживали при 0°С. Полученный криопреципитат, содержащий, в частности, фактор VIII и фибронектин, удаляли с помощью центрифугирования. Преципитат обычно используют для выделения и очистки фактора VIII.

Стадия 2

Криосупернатант, полученный в результате выполнения стадии 1, пропускали через анионообменную колонку (70 литров DEAE-сефароза FF, производство Amersham Pharmacia Biotech) для связывания витамин К-зависимых белков (фактор IX, фактор X, фактор II, протеин C, протеин S и др.). Колонку промывали буфером, содержащим 0,14 М хлорида натрия и 5 мМ фосфата натрия, рН 7,0. Фракцию несвязанных белков (приблизительный вес 1270 кг) подвергали дальнейшей обработке на стадии 3, в то время как белки, связавшиеся с носителем колонки, подвергались дальнейшей очистке с целью получения фактора IX, тромбина и пр.

Стадия 3

Фракцию несвязанных белков, полученную в результате этапа 2, подвергали дальнейшей обработке путем добавления этилового спирта до достижения массовой доли 8% с получением осадка фракции Кона I, содержащей, в частности, фибриноген и липопротеиды (Cohn et al. (1946) Am. Chem. Soc. 68, 459-475). Перед добавлением этилового спирта к раствору белков было добавлено 5,5 кг диатомовой земли (Hyflow Super cel). Осадок и диатомовую землю удаляли с помощью центрифугирования.

Стадия 4

pH супернатанта фракции Кона I (приблизительный вес около 1400 кг) доводили до 7,8; после этого супернатант пропускали через носитель для аффинной хроматографии (120 литров, гепарин-сефароза FF, Amersham Pharmacia Biotech), где нативный (активный) HGF, AT-III и HRGP (HAH) связывались с носителем колонки, в то время как основная часть других белков плазмы (альбумин, IgG и др.) проходили через колонку. Колонку промывали 600 кг буфера (0,4 М хлорида натрия, 0,01 М фосфата натрия, pH 7,8) для удаления неактивных форм белков и после этого фракцию НАН элюировали 500 кг буфера (2,3 М хлорида натрия, 0,01 М фосфата натрия, pH 7,8). Полученный элюат НАН сконцентрировали и подвергали диафильтрации против раствора 0,05 М фосфата натрия, pH 7,5 через мембрану для ультрафильтрации (Biomax-10, Millipore). Полученный концентрат HAH, подвергнутый диафильтрации, обозначался UF1.

ПРИМЕР 2

Очистка нативного (активированного и/или неактивированного) HGF, стабилизированного АТ-III и HRGP, согласно изобретению

Стадия 1

Объединенную свежезамороженную плазму крови здоровых доноров в количестве 1 200 кг размораживали при 0°С. Полученный криопреципитат, содержащий, в частности, фактор VIII и фибронектин, удаляли с помощью центрифугирования. Преципитат обычно используют для выделения и очистки фактора VIII.

Стадия 2

Криосупернатант, полученный в результате выполнения стадии 1, подвергали дальнейшей обработке путем добавления этилового спирта до достижения массовой доли 8% с получением осадка фракции Кона I, содержащей, в частности, фибриноген и липопротеиды (Cohn et al. (1946) Am. Chem. Soc. 68, 459-475). Перед добавлением этилового спирта к раствору белков добавляли 5,5 кг диатомовой земли (Hyflow Super cel), и раствор перемешивали в течение 1-2 ч. Преципитат и диатомовую землю удаляли с помощью центрифугирования.

Стадия 3

pH супернатанта фракции Кона I (приблизительный вес около 1400 кг) доводили до 7,8; после этого супернатант пропускали через носитель для аффинной хроматографии (120 литров, гепарин-сефароза FF, Amersham Pharmacia Biotech). Нативный (активный) HGF, AT-III и HRGP (HAH) связывали с носителем колонки, в то время как основная часть других белков плазмы (альбумин, IgG и др.) проходила через колонку. Колонку промывали 600 кг буфера (0,4 М хлорида натрия, 0,01 М фосфата натрия, pH 7,8) для удаления неактивных форм белков и после этого фракцию НАН элюировали 500 кг буфера (2,3 М хлорида натрия, 0,01 М фосфата натрия, pH 7,8). Полученный элюат НАН сконцентрировали и подвергали диафильтрации против раствора 0,05 М фосфата натрия, pH 7,5 через мембрану для ультрафильтрации (Biomax-10, Millipore). Полученный концентрат HAH, подвергнутый диафильтрации, обозначался UF1.

ПРИМЕР 3

Дальнейшая очистка нативного HGF с целью удаления AT-III

Способ осуществляли при комнатной температуре (+22°С). Концентрат UF1, полученный в Примере 1 или 2 (А₂₈₀=23,6; фиг. 1, дорожка 1), разбавляли тройным объемом дистиллированной воды. Разбавленный раствор (масса 2050 г; проводимость 2,6 мСм/см) пропускали через колонку (Pharmacia Biotech Bioprocess Column, диаметр 15 см), заполненную катионообменным носителем Fractogel® EMD SO ₃-650 (M) (1,7 л). Предварительно колонку уравновешивали раствором 10 мМ цитрата натрия, pH 7,5, проводимость 2,6 мСм/см. Скорость потока составляла 9 л/ч. После того, как колонку нагружали белковым раствором, колонку промывали семикратным объемом уравновешивающего буфера. Вещества, не адсорбировавшиеся на колонке, смешивали с промывочным буфером (14,6 кг, обозначенный «Фракция А1», фиг. 1, дорожка 2). Белки, более сильно связанные с носителем колонки, элюировали с колонки 1,9 кг буфера (1 М NaCl, 10 мМ цитрата натрия, pH 7,5, проводимость 106 мСм/см). Элюат (массой 1,9 кг) концентрировали и подвергали диафильтрации против раствора, содержащего 0,1 М цитрата натрия/1% сахарозы, pH 7,0. Полученная фракция, обозначенная «А2», содержала активный HGF и HRGP (табл. 1 и фиг. 1, дорожка 3).

Таблица 1
Разделение фракций АТ-III и HGF/HRGP согласно изобретению
	А280	Содержание АТ-III (%)	Присутствие нативного HGF	HRGP (мг/мл)
UF1 (HAH)	33	>80	+	не определено
Фракция А1 (АТ-III)	4,5	>95	-	<0,01
Фракция А2 (HGF+HRGP)	16	<1	+	4,2

ПРИМЕР 4

Дальнейшая очистка нативного HGF с целью удаления HRGP

К 490 г фракции UF1 (полученной способом, описанным в Примере 2) добавляли осаждающий буфер, состоящий из 532 г 0,05 М натрий-фосфатного буфера, pH 7,5, 327 г цитрата натрия и 237 г сахарозы. Осаждающий буфер добавляли к раствору фракции UF1 в течение 30 минут. После перемешивания в течение 15 минут осадок удаляли с помощью фильтра с диаметром пор 0,2-0,45 мкм; для сбора HGF и АТ-III фильтрат промывали буфером следующего состава: 1,617 г цитрата натрия и 1,012 г сахарозы, растворенных в 4400 г 0,05 М раствора фосфата натрия pH 7,5. Получившийся фильтрат далее обозначается как «фильтрат».

Таблица 2
Отделение АТ-III и HGF от фракций HRGP согласно изобретению
	Масса (г)	А280	Содержание АТ-III (%)	Присутствие нативного HGF	HRGP (мг/мл)
UF1	490	18,6	>80	+	+
Фильтрат	3,620	2,2	>95	+	-

ПРИМЕР 5

Чтобы выяснить, насколько важно присутствие АТ-III и HRGP для наилучшего выхода HGF, был предпринят следующий эксперимент:

А. Фракцию не связанных с гепарин-сефарозой продуктов, полученную в ходе примера 2 (этапы 1-3), подвергали дальнейшей обработке. В эту фракцию, не содержащую HGF, активного АТ-III, вносили HGF, но не АТ-III или HRGP. После обработки сольвентом/детергентом (Octoxynol, TnBP) раствор пропускали через фильтр с размером пор 0,45 мкм и наносили на колонку с Q-сефарозой XL (анионообменная смола). Колонку промывали раствором Tris/HCl (концентрация 20 мМ, pH 7,0), который также удалял следы сольвента/детергента. После промывки связавшиеся с колонкой белки элюировали буфером Tris/HCl pH 7,0, содержащим 0,2 М NaCl. Элюат наносили на колонку с носителем Fractogel EMD SO₃. После промывки материал элюировали с колонки 10 мМ раствором цитрата натрия pH 5,5 и 1 М NaCl.

B. Процедуру очистки проводили аналогично описанной в части А, но одновременно с HGF в раствор вносили очищенный АТ-III.

Результаты

Оценка различных фракций, полученных в ходе вариантов методики А и В, показала, что постадийный выход обоих хроматографических процессов был значительно выше в присутствии АТ-III, чем в его отсутствие, особенно в случае хроматографии на Fractogel EMD SO₃. В присутствии AT-III пошаговый выход HGF превышал постадийный выход HGF в отсутствие АТ-III в два раза.

Следует также отметить, что в отсутствие АТ-III HGF обнаруживался также в других фракциях, помимо элюата, в то время как в присутствии АТ-III в случае В HGF был сконцентрирован в элюате, а в проточной и промывочной фракции присутствие HGF не обнаруживалось.

Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что присутствие АТ-III значительно повышает постадийный выход HGF. В особенности это справедливо для процессов анионообменной и катионообменной хроматографии, описанных выше.

ПРИМЕР 6

Элюат, полученный с колонки с гепарин-сефарозой, а также фракция UF1, полученные согласно способу, описанному в примере 2, то есть содержащие HGF, АТ-III и HRGP, обрабатывали сольвентом/детергентом способом, описанным в примере 5, пропускали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и наносили на колонку с фосфатом целлюлозы. Колонку промывали фосфатным буфером с концентрацией 1 мМ, pH 6,0. Элюирование HGF проводилось 1М NaCl в фосфатном буфере.

При использовании такого хроматографического процесса для удаления сольвента/детергента и дальнейшей очистки HGF постадийный выход HGF достигал более 50% от содержания HGF в исходном материале.