способ получения концентрата фактора фон виллебранда или комплекса "фактор viii/фактор фон виллебранда" и его применение

Формула изобретения

1. Способ получения концентрата фактора Фон Виллебранда или комплекса фактор Фон Виллебранда/фактор VIII из плазмы крови человека или рекомбинантной природы, включающий

a) приготовление раствора фактора Фон Виллебранда или комплекса фактор Фон Виллебранда/фактор VIII, который содержит VWF в концентрации до 12 IU VWF:RCo/мл и имеет отношение фактор Фон Виллебранда/фактор VIII, равное 0,4 или больше;

b) нанофильтрацию раствора, приготовленного согласно а) через фильтр с размером пор меньше чем 35 нм при давлении, меньшем или равном 0,5 бар и в присутствии от 0,05 до 0,2 М ионов кальция.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что получаемый после нанофильтрации фактор Фон Виллебранда сохраняет мультимерную структуру, которая включает мультимеры с числом полос 11 или больше.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что выход фактора Фон Виллебранда после нанофильтрации составляет 60% или больше.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что выход фактора VIII после нанофильтрации составляет 70% или больше.

5. Способ п.1, отличающийся тем, что применяется нагрузка на фильтр до 50 IU фактора Фон Виллебранда на 1 см² площади фильтрующей поверхности.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что максимальная концентрация раствора, который фильтруется, составляет 0,6 AU (OD₂₈₀).

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что нанофильтрация проводится при давлении от 0,2 до 0,4 бар.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что стандартная скорость тока при нанофильтрации составляет от 10 до 20 л/ч/м².

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что нанофильтрация проводится с применением фильтра с размером пор меньше, чем 35 нм.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что нанофильтрация проводится с применением фильтра с размером пор 19±1 нм.

11. Применение концентрата, полученного согласно способу по любому из пп.1-10, для изготовления медицинского средства для лечения гемофилии А или болезни Фон Виллебранда.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается терапевтического концентрата фактора Фон Виллебранда или комплекса фактор VIII/фактор Фон Виллебранда и способа получения медицинского соединения, предназначенного для лечения болезни Фон Виллебранда (Von Willebrand's Disease, VWD) и гемофилии А, при котором концентрат подвергается нанофильтрации через поры размером меньше чем 35 нм, которые эффективно задерживают вирусы с оболочкой или без оболочки, такие как, например, вирус гепатита А или эритровирус В19.

Предшествующий уровень техники

Фактор Фон Виллебранда (VWF) представляет собой белок плазмы крови, имеющий мультимерную (олигомерную) структуру, при этом молекулярный вес разных изоформ варьирует от примерно 230000 Да (Дальтон) для каждой мономерной субъединицы до более чем 20 миллионов Да для мультимерных форм с высокими молекулярными весами, образующих, таким образом, самый крупный известный растворимый белок. Его концентрация в плазме крови составляет около 5-10 мкг/мл [Siedlecki et al., Blood, vol 88, n 8, 1996: 2939-2950] и присутствующая в плазме форма небольшого размера соответствует димеру с приблизительным размером 500000 Да.

VWF играет важную роль в первичном гемостазе, отвечая за адгезию тромбоцитов к поврежденной поверхности кровеносных сосудов и, таким образом, за формирование бляшки из тромбоцитов, на которой начинается процесс формирования фибринового коагулята. Предполагается, что мультимерные формы с высокими молекулярными весами обеспечивают процесс адгезии тромбоцитов в субэндотелии с большей эффективностью, и что клиническая эффективность концентратов VWF связана с концентрацией именно таких мультимеров с высоким молекулярным весом [Metzner et al., Haemophilia (1998) 4, 25-32].

Кроме того, VWF в плазме принимает участие в транспортировке и стабилизации фактора VIII (FVIII), так как обнаружено, что молекула FVIII в нативном состоянии связана с мультимерными формами VWF. Комплекс фактор VIII/фактор Фон Виллебранда (FVIII/VWF) достигает длины до 1150 нм [Furuya К. et al., Vox Sanguinis (2006) 91, 119-125]. Кроме того, VWF в виде своей небольшой молекулярной формы будет иметь размеры примерно 149×77×3,8 нм и может изменять свою структуру в зависимости от скорости кровотока (силы углового сдвига), превращаясь в вытянутую или линейную форму [Siedlecki et al., Blood (1996) 88, 2939-2950]. Концентрация FVIII в плазме составляет примерно около 0,05-0,1 мкг/мл (т.е. примерно в 50-100 раз меньше, чем концентрация VWF).

Количественные или качественные дефекты VWF приводят к нарушениям в первичном гемостазе, известным как болезнь Фон Виллебранда, которая проявляется в виде кровотечения.

Концентраты очищенного VWF и концентраты FVIII с высоким содержанием функционального VWF нашли терапевтическое применение в лечении болезни Фон Виллебранда.

Другим аспектом, который необходимо принимать во внимание, является то, что поскольку VWF представляет собой природный стабилизатор для FVIII, концентраты FVIII с высоким содержанием VWF могут иметь множество преимуществ при применении для лечения гемофилии А, что было отмечено многими авторами, например: более длительное время жизни in vivo для вводимого FVIII, защитное действие против ингибиторных антител на FVIII [Gensana М. et al., Haemophilia, (2001) v.7, 369-374] [Bjorkman S. et al, Clin Pharmacokinet, (2001) v.40, 815-832] [Behrmann K. et al., Thromb Haemost, (2002) v.88, 221-229] и возможно меньшая частота образования антител, ингибирующих активность FVIII [Goudemand J. et al., Blood (2006) 107: 46-51].

Были разработаны аналитические методы для характеристики как содержания, так и активности VWF в его концентратах. Определение активности VWF как кофактора Ристоцетина (VWF:RCo) является широко распространенным методом определения активности VWF [Heath et al., Thromb Haemost 1992; 68:155-159]. Измерение VWF в качестве антигена (VWF:Ag) [Cejka J. Clin Chem. 1982; 28:1356-1358] показывает нам количество как активного, так и неактивного VWF в образце.

Одним из важных параметров для определения функционального качества концентратов VWF является соотношение между активностью VWF:RCo и антигена VWF:Ag.

С учетом возможного значения мультимерной структуры VWF и мультимеров с высоким молекулярным весом для их клинической активности и эффективности, характеристика мультимерной структуры является крайне важной для определения пригодности концентратов VWF и концентратов FVIII с высоким содержанием VWF. Такую мультимерную структуру определяют с помощью гельэлектрофореза [Ruggeri et al., Blood 1981; 57: 1140-1143].

Были описаны разные методы очистки VWF или комплекса FVIII/VWF, в которых VWF является функциональным и находится в достаточной концентрации для его применения в качестве терапевтического продукта для лечения VWD, как это показано в патентах ЕР 0411810 и ЕР 0639203 и в публикации Ristol P. et al., Sangre (1996) 41:125-130.

Другие методы очистки FVIII дают конечный продукт, не содержащий VWF или содержащий только его следовые количества. Эти концентраты не пригодны для лечения VWD. Хотя в некоторых случаях остаточный VWF присутствует в таких концентратах FVIII, он является нефункциональным, поскольку теряет часть мультимеров, которые его образуют, и особенно мультимеров с высоким молекулярным весом. Эти концентраты не будут обладать теми преимуществами концентратов FVIII, которые обогащены VWF при применении для лечения гемофилии А.

Эти концентраты описаны (таблицы 2 и 3) в Списке концентратов факторов коагуляции, созданном в 1997 году и обновленном в 2006 году Всемирной федерацией гемофилии (World Haemophilia Federation, WHF) (Kasper, C.K.; Brooker, M. Registry of clotting factor concentrates, January 2006), где среди прочего указаны методы фракционирования и инактивации вирусов, содержание в них VWF и их функциональная эффективность.

Среди концентратов FVIII, которые подверглись нанофильтрации, мы должны различать те, которые прошли нанофильтрацию через поры размером 35 нм (или большего размера), т.е. те, для которых эта нанофильтрация не эффективна против вирусов, не имеющих оболочки, таких, например, как вирус гепатита А (примерно 24 нм) или вирус В19 (между 18 и 24 нм). С другой стороны, концентраты FVIII, которые прошли нанофильтрацию через поры меньше, чем 35 нм, не содержат VWF, а если и содержат, то лишены мультимеров с высоким молекулярным весом, в результате чего они не эффективны в лечении VWD и не обладают преимуществами концентратов FVIII, богатых VWF, при их применение для лечения гемофилии А.

Возможность удаления патогенных агентов является крайне важной для обеспечения безопасности биологических продуктов и, следовательно, в производственный процесс с этой целью включаются различные методы. Среди них необходимо отметить химическую инактивацию, основанную на действии органических растворителей в комбинации с детергентом, которые продемонстрировали свою высокую эффективность против вирусов с липидной оболочкой, хотя они не эффективны против вирусов, лишенных липидной оболочки. Другие способы физической обработки, такие как тепловая обработка, являются эффективными независимо от наличия у вирусов липидной оболочки, но их эффективность зависит от жесткости обработки, которая, в свою очередь, зависит от устойчивости белка, который подвергается такому процессу инактивации. Другие способы, которые помогают снизить вирусное загрязнение, включают разделение с помощью преципитации или хроматографии.

Один из методов, который, как было доказано, является высокоэффективным для удаления вирусов, независимо от наличия или отсутствия у них липидной оболочки, заключается в фильтрации через фильтры с размером пор, которые обеспечивают задержку вирусных частиц (нанофильтрация). Было также показано, что этот метод является эффективным для удаления и других инфекционных частиц, таких как прионы. Однако эффективность этого метода определяется размером пор, который, в свою очередь, зависит от размера белка, который должен быть подвергнут нанофильтрации.

Существуют нанофильтры с разным размером пор, обычно от 15 до 75 нанометров (нм) и, как правило, чем меньше размер пор, тем выше эффективность фильтров в задерживании патогенов: нанофильтры с размером пор меньше 35 нм, предпочтительно от 15 до 20 нм, представляют собой такие фильтры, которые задерживают самые мелкие вирусы с размером от 18 до 23 нм, такие как эритровирус В19 и вирус гепатита А (размер примерно 24 нм). Благодаря своим характеристикам эти нанофильтры являются физически пригодными только для белков меньшего размера, которые, таким образом, могут фильтроваться с выходом, приемлемым для промышленного производства (обычно выход белка после нанофильтрации должен составлять 60% или больше).

Вероятно, что из-за своей молекулярной структуры VWF или комплекс FVIII/VWF в принципе не способны проходить через поры нанофильтров с диаметром меньше чем 35 нм, особенно мультимерные формы VWF с высоким молекулярным весом. До настоящего времени нанофильтрация VWF или комплекса FVIII/VWF, включающих мультимерные формы с высоким молекулярным весом, через нанофильтры с диаметром пор меньше 35 нм была невозможна.

Согласно списку концентратов факторов коагуляции Всемирной федерации гемофилии (WHF), который упоминался выше, имеется один концентрат прошедшего нанофильтрацию FVIII (в данном случае использовались поры размером 20 нм), который представляет собой Cross Eight М Красного Креста Японии, который также описан в публикации K.Furaya et al, Vox Sanguinis (2006) 91, 119-125. Несмотря на то, что в публикации говорится, что при фильтрации через поры размером 20 нм в концентрате FVIII сохраняется VWF и что его мультимерная структура не нарушается, мы можем видеть из списка WHF, что этот концентрат содержит нефункциональный VWF. Возвращаясь к публикации Furuya et al., мы видим, что содержание VWF находится на следовом уровне [стр.123: количества VWF были близки к тем, которые обычно обнаруживаются (0,007-0,015 U VWF/U FVIII:С) ], тогда как это отношение в плазме составляет 1 единицу активности VWF на каждую единицу активности FVIII (пропорция 1:1). С другой стороны, характеристика мультимерной структуры остаточного VWF (Фигура 4, стр.123) демонстрирует не более чем 10 мультимерных полос, тогда как известно, что мультимеры с хорошо сохранившейся мультимерной структурой, которые имеют высокий молекулярный вес, должны содержать не менее 11 полос (Metzner et al., Haemophilia (1998) 4; стр.27, 2-й абзац). То, что Furaya сообщает в своей публикации, заключается в следующем: концентрат FVIII, очищенный аффинной хроматографией с использованием моноклональных антител содержит только следовые количества VWF, который представлен только мультимерами с низкими молекулярными весами, и такой состав VWF не изменяется в худшую сторону при нанофильтрации через поры размером 20 нм. Очевидно, что этот концентрат (Cross Eight М) не подходит для лечения VWD и не обладает преимуществами, которые дает присутствие VWF в пропорции (1:1), обнаруживаемой в нормальной плазме крови человека.

В Списке концентратов факторов коагуляции Всемирной федерации гемофилии, упоминавшемся выше, упомянут и другой концентрат FVIII, прошедший нанофильтрацию, который представляет собой LFB's FACTANE. Согласно упомянутому списку, этот концентрат прошел нанофильтрацию через поры размером 15 нм и он содержит VWF. Данный продукт соответствует продукту, полученному согласно патенту WO 2005040214, который описывает композицию FVIII, прошедшего нанофильтрацию через фильтр с порами размером от 13 до 25 нм, в котором эффективность задерживания вирусов сочетается с присутствием VWF с высоким молекулярным весом (больше, чем 10 мультимеров) в количестве менее 15%. Это опять подтверждает то, что видно из публикации Furaya, а именно, что мультимеры VWF с низким молекулярным весом могут проходить через нанофильтры с размером пор 20 нм, когда они присутствуют в низких концентрациях по отношению к FVIII, то есть в них соотношения VWF/FVIII далеки от 1 (0,015 в случае статьи Furaya и 0,15 в случае Factane, патент WO 2005040214). Мультимеры с высоким молекулярным весом, напротив, задерживаются на нанофильтре. Более того, в указанном патенте для сохранения FVIII, ассоциированного с VWF, который также должен был быть сохранен, обеспечивалась усиленная диссоциация комплекса FVIII/VWF путем добавления CaCl₂ в концентрации выше, чем 0,20 М, которая является минимальной концентрацией, при которой диссоциирует комплекс FVIII/VWF. Несмотря на это, во всех приведенных примерах для того, чтобы обеспечить диссоциацию комплекса FVIII/VWF, и, следовательно, повысить выход FVIII, использовалась концентрация CaCl₂, по меньшей мере, 0,35 М. Описанная в данном патенте композиция предназначена исключительно для лечения дефицита FVIII, а не для лечения VWD. Действительно, данный продукт не пригоден для лечения VWD, что указано в лицензии на продукт, выданной French Agency for the Safety of Health Products [http://afssaps-prd.afssaps.fr/php/ecodex/frames.php?specid=66716833&typedoc=R&ref=R0093176.htm], в секции 4.1 Терапевтические показания, где ясно указано, что продукт не содержит VWF в количествах, достаточных для лечения VWD. Кроме того, в посвященной данному продукту публикации [Vox Sanguinis (2007) 92, 327-337] авторы подтверждают, что продукт (Factane) не предназначен для лечения VWD (стр.335).

Суммируя все сказанное выше, можно заключить, что способы, описанные K.Furuya et al, [Vox Sanguinis (2006) 91, 119-125], в патенте WO 2005040214 и в публикации Vox Sanguinis (2007) 92, 327-337, предназначены для получения концентрата FVIII, который имеет низкое содержание VWF (<15% или отношение VWF/FVIII<0,15:1), применимого для лечения гемофилии А, но который не обладает преимуществами, которые будет иметь концентрат, обогащенный VWF, при лечении гемофилии и который ни при каких обстоятельствах не подходит для лечения VWD.

Было установлено (Siedlecki et al., Blood, vol 88, n 8, 1996: 2939-2950), что VWF изменяет свою трехмерную структуру в условиях тока, обеспечивающих повышение силы углового сдвига (стресс углового сдвига), что обеспечивает включение механизма адгезии тромбоцитов in vivo. Это изменение структуры приводит к тому, что молекула меняет свою глобулярную структуру в сторону более линейной формы. В этой связи K.Furuya et al., в своей публикации (Vox Sanguinis (2006) 91, 119-125) уже указывали, что фильтрация их концентрата FVIII через поры размером 20 нм должна проводиться при высоком давлении (0,8 бар) для того, чтобы обеспечить приемлемый выход FVIII, и что они предполагают, что при более низком давлении влияние скорости тока недостаточно для того, чтобы присутствующий VWF изменил свою структуру, что затрудняет фильтрацию. В указанных условиях (0,8 бар) они также достигали хорошего выхода присутствующих мультимеров с низким молекулярным весом, если иметь в виду, что исходное содержание этих мультимеров до нанофильтрации было очень низким.

Процитированные выше документы не раскрывают возможного применения нанофильтрации через поры размером меньше чем 35 нм, такие как, например, 20 нм, для VWF или комплекса VWF/FVIII (отношение >0,4) с функциональным содержанием мультимеров с высоким молекулярным весом, которое делает возможным их применение для лечения VWD, или которое сохраняет преимущества, описанные для концентратов, богатых VWF, при их применении для лечения гемофилии А. Более того, патент WO 2005040214 ясно говорит любому квалифицированному специалисту в данной области техники, что такой размер пор препятствует прохождению VWF с высоким молекулярным весом.

Уровень техники, в котором проводится нанофильтрация VWF для получения терапевтического продукта, в настоящее время ограниченная нанофильтрацией через поры размером 35 нм, описан в патенте ЕР 1632501. Этот патент раскрывает способ получения концентрата VWF с низким содержанием FVIII (отношение FVIII.C/VWF:RCo меньше чем 0,06), который включает стадию удаления вирусов нанофильтрацией через фильтр с размером пор 35 нм, как указано в абзаце 23 Осуществления изобретения и в Примере 1, абзац 37. Из данного патента мы можем заключить, что нанофильтрация молекулы, имеющей размер VWF, является невозможной для нанофильтров, имеющих размер пор меньше чем 35 нм.

Как мы видели, в настоящее время отсутствует терапевтический концентрат, предназначенный для лечения болезни Фон Вильдебранда, который прошел бы нанофильтрацию через поры размером 20 нм. Кроме того, современный уровень техники показывает, что нанофильтрация VWF, содержащего мультимеры с высоким молекулярным весом, через поры размером 20 нм невозможна, как в случае молекулярного комплекса FVIII/VWF, если присутствуют мультимеры VWF с высоким молекулярным весом и пропорция между VWF и FVIII выше чем 0,15.

Таким образом, получение концентрата FVIII/VWF путем нанофильтрации через поры размером 20 нм с пропорцией между двумя компонентами макромолекулярного комплекса FVIII и VWF, который более похож на комплекс, в норме присутствующий в плазме крови человека (1 единица VWF на каждую 1 единицу FVIII), и который все еще обладает всеми преимуществами нативного комплекса FVIII/VWF и подходит для лечения VWD и гемофилии А, пока еще представляет собой нерешенную проблему.

Способ получения VWF или комплекса FVIII/VWF из плазмы крови человека обычно начинается с получения фракции криопреципитата, которая очищается путем избирательной преципитации или, с недавнего времени, с помощью хроматографической техники, особенно с применением ионообменной и/или аффинной хроматографии.

Способы очистки FVIII, которые в настоящее время основаны на иммуноаффинной хроматографии (с использованием моноклональных антител), обеспечивают получение FVIII с очень высокой специфической активностью, но лишенного функционального VWF [K.Furaya et al., Vox Sanguinis (2006) 91, 119-125].

Как мы видели, эти способы получения VWF или комплекса FVIII/VWF включают в себя одну или несколько специальных стадий инактивации или удаления вирусов.

В настоящем изобретении активность VWF основана на роли VWF как кофактора для антибиотика Ристоцетина (Ristocetin, VWF:RCo) в его способности индуцировать агрегацию тромбоцитов (Pharmacopoiea Europea 07/2006:20721). Эта активность выражается в международных единицах (International Units, IU VWF:RCo), и его концентрация выражается в IU/миллилитр (IU VWF:RCo/мл).

Под активностью FVIII понимается коагулирующая активность FVIII (FVIII:C), которая основана на роли FVIII как кофактора в активации FX в присутствии FIXa, ионов кальция и фосфолипидов (Pharmacopoeia Europea 07/2006:20704). Эта активность количественно определяется с хромогенным субстратом и выражается в международных единицах (International Units, IU FVIII), и его концентрация выражается в IU FVIII/миллилитр (IU FVIII/мл).

Осуществление изобретение

Настоящее изобретение раскрывает терапевтический концентрат фактора Фон Виллебранда или комплекса фактор VIII/фактор Фон Виллебранда, который прошел нанофильтрацию через сито с размером пор меньше, чем эквивалент 35 нм, в котором полученный продукт имеет отношение VWF:RCo/FVIII:C, которое больше или равно 0,4, в котором сохранена структура мультимеров VWF, включая мультимеры с высоким молекулярным весом (больше 11 полос), и который является пригодным для получения медицинских соединений для лечения болезни Фон Виллебранда и гемофилии А, и способ его получения.

На основании проведенных исследований по нанофильтрации VWF или комплекса FVIII/VWF, в котором VWF сохраняет мультимерную структуру и содержит мультимеры с высоким молекулярным весом, авторы настоящего изобретения неожиданно показали, что в случае раствора, содержащего VWF или комплекс FVIII/VWF и ионы кальция, можно проводить нанофильтрацию через нанофильтр с номинальным размером пор меньше чем 35 нм, и предпочтительно 20 нм при максимальном давлении менее чем 0,5 бар и предпочтительно от 0,2 до 0,4 бар.

Раствор, который должен быть подвергнут нанофильтрации, имеет максимальную концентрацию 0,6 единиц поглощения (AU₂₈₀), что эквивалентно не более чем 12 IU VWF:RCo/мл. Белковый состав раствора помимо присутствия в нем собственно VWF и FVIII может включать и другие белки, такие как, например, фибриноген или фибронектин; специфическая активность VWF (IU VWF:RCo/мг белка) равна или больше чем 1, и обычно 10 или более. Специфическая активность FVIII (IU FVIII/мг белка) в случае нанофильтрации комплекса FVIII/VWF также равна или больше чем 1, и обычно 10 или более.

Раствор, который должен быть подвергнут нанофильтрации, может содержать кальций (хлорид) в концентрации от 0,05 до 0,20 М и, по меньшей мере, одну основную (щелочную) аминокислоту в качестве стабилизатора белка, предпочтительно гистидин, в концентрации от 20 до 30 мМ. Значение рН раствора, который должен быть подвергнут нанофильтрации, должно быть выше 5,5 для предотвращения денатурации.

Отношение нагрузки (фильтра), выраженное в биологической активности белка, который должен быть подвергнут нанофильтрации, может достигать 50 IU VWF:RCo/см² площади фильтрующей поверхности, что эквивалентно 0,5 мг VWF/см².

В указанных условиях можно профильтровать до 120 литров раствора на 1 м² площади фильтрующей поверхности с выходом активности FVIII более чем 70%, с выходом активности VWF более чем 60%, с сохранением мультимерной структуры VWF (более чем 11 мультимеров) и с отношением VWF:RCo/FVIII, которое составляет, по меньшей мере, 80% от этого отношения в исходном материале.

Раствор, который должен быть подвергнут нанофильтрации, отличается тем, что он имеет отношение активностей VWF:RCo/FVIII, равное или больше чем 0,4, и обычно от 1 до 3, и данная процедура применима в равной степени как для растворов VWF без FVIII, так и для растворов комплекса FVIII/VWF, поскольку именно VWF, являясь мультимерной молекулой большого размера, представляет собой молекулу, которая накладывает ограничения на весь процесс.

В указанных условиях стандартная скорость фильтрации составляет максимум 30 литров/час/м², обычно от 10 до 20 литров/час/м ², время фильтрации составляет 12 часов или меньше. Это делает возможным промышленное применение, и также очевидно, что эти параметры могут быть изменены или оптимизированы путем изменения площади поверхности для нанофильтрации, что является ограничивающим фактором для всего процесса из-за высокой цены (нанофильтра).

В предпочтительном воплощении проводится предварительная нанофильтрация с применением нанофильтра с размером пор от 35 до 100 нм до того, как проводится нанофильтрация через поры размером меньше чем 35 нм. Отношение между площадами первого (для предварительной фильтрации) и второго (<35 нм) нанофильтров составляет от 1:2 до 1:4.

Также можно проводить двойную нанофильтрацию через поры размером 20 нм (20 нм + 20 нм), что увеличивает преимущества за счет повышенной безопасности продукта нанофильтрации.

Благодаря настоящему изобретению получены прошедшие нанофильтрацию VWF или комплекс FVIII/VWF, что делает возможным создание высокоочищенного медицинского препарата, пригодного для лечения VWD и гемофилии А, обладающего активностью VWF больше чем 100 IU VWF:RCo/мл и имеющего отношение между активностями VWF и FVIII 0,4 или более, и в котором мультимерная структура VWF включает мультимеры с высоким молекулярным весом (больше чем 11 полос).

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Из коммерчески доступных нанофильтров в Примерах настоящего изобретения применялись нанофильтры марки Planova® фирмы Asahi Kasei Corporation, Japan, которые производятся из регенерированной целлюлозы и имеют размер пор примерно 35±2 нм в случае Planova 35N и 19±1 нм в случае Planova 20N. Фильтры такого типа можно использовать для разных вариантов фильтрации, как для «тупиковой» фильтрации, когда весь раствор продавливается через фильтр (dead end mode filtration), так и для проточной фильтрации, когда раствор прокачивается над фильтром (tangential mode filtration). В приведенных ниже Примерах при использовании фильтров Planova применялся вариант «тупиковой» нанофильтрации, однако для целей настоящего изобретения также подходит и проточный вариант фильтрации, а также возможно применение других марок нанофильтров и композиций, которые хорошо известны квалифицированным специалистам в данной области техники. В инструкциях производителя подробно описано, как надо собирать устройства для фильтрации, проводить нанофильтрацию и осуществлять тестирование для того, чтобы убедиться, что имеющие отношение к настоящему изобретению нанофильтры являются неповрежденными.

Пример 1. Подготовка исходного материала

Перед нанофильтрацией раствор комплекса FVIII/VWF из плазмы крови человека может быть получен, например, из солюбилизированного криопреципитата путем преципитации полиэтиленгликолем и последующей очистки аффинной хроматографией, как указано в патенте ЕР 0411810. Прошедший нанофильтрацию раствор может быть дополнительно очищен для получения продукта с высокой чистотой, например, путем преципитации глицином, как указано в патенте ЕР 0639203. Альтернативно этому, FVIII или VWF или оба эти фактора могут быть получены с помощью биосинтеза с применением технологии рекомбинантной ДНК в трансгенных клетках или в животных [Wood W.I. et al., Nature (1984) 312: 330-337]; [Toole, JJ. et al., Nature (1984) 312: 342-347].

Пример 2. Нанофильтрация комплекса FVIII/VWF

Была проведена последовательная фильтрация через фильтры Planova 35N площадью 0,12 м² и Planova 20N площадью 0,3 м ² 14,7 литров раствора частично очищенного комплекса FVIII/VWF со специфической активностью 10,4 IU FVIII/AU_280нм и концентрацией VWF: RCo 5,69 IU/мл, что эквивалентно 0,235 AU_280нм, в присутствии 25 мМ гистидина и 0,14 М кальция при рН 6,77 и при температуре 20±5°С. Фильтрацию проводили при постоянной скорости тока примерно 14 л/ч/м², поддерживая разницу давлений между 0,20 и 0,30 бар в случае фильтра Planova 20N во время фильтрации всего раствора, которая по времени была завершена за 3,3 часа. Производительность на единицу площади за единицу времени составила 3,6 IU FVIII/см²/час, 8,2 IU VWF RCo/см²/час (отношение VWF: RCo/FVIII: С=2,3) и 9,8 IU VWF: Ag/см²/час. Выход активности составил 94% для FVIII и 95% для VWF RCo.

Пример 3. Характеристики комплекса FVIII/VWF после нанофильтрации через Planova 20N

По способу, описанному в Примере 2, было проанализировано 7 разных образцов исходного материала. В качестве исходного материала был использован комплекс FVIII/VWF со специфической активностью около или более чем 10 IU FVIII/AU _280нм и концентрацией белка 0,3±0,2 AU_280нм в присутствии 25 мМ гистидина и 0,14 М кальция при рН 6,8±0,2 и температуре 20±5°С. Была проведена очистка через поры размером 0,1 мкм и последующая последовательная нанофильтрация через фильтры Planova 35N и Planova 20N. Фильтрация проводилась при постоянной скорости тока между 10 и 20 литрами/ч/м² . Рабочее давление на фильтре Planova 20N поддерживалось между 0,2 и 0,4 бар во время фильтрации во всех случаях.

Полученные результаты (таблица 1) показывают, что нанофильтрация комплекса FVIII/VWF через поры размером 20 нм в указанных условиях не оказывает никакого влияния на активность и чистоту (специфическую активность) полученного нанофильтрата.

Сравнительный анализ отношений VWF:RCo/FVIII и VWF:RCo/VWF:Ag (таблица 1), полученных для материала до и после нанофильтрации, позволяет заключить, что в указанных условиях можно проводить фильтрацию VWF, присутствующего в концентрате FVIII/VWF, через сито с размером пор 20 нм без изменения функциональности VWF в качестве кофактора Ристоцетина.

Приведены средние значения для 7 образцов ± стандартное отклонение (SD)

Пример 4. Мультимерная структура VWF, выявленная с помощью электрофореза, показывает сохранение исходной структуры, включающей мультимеры с высоким молекулярным весом, содержащие более чем 11 полос.

На фигуре 1 показана мультимерная структура VWF в разных образцах конечного продукта до и после стадии нанофильтрации. На оригинальных фотографиях образцов, прошедших нанофильтрацию, можно насчитать, по меньшей мере, 16 полос в каждой дорожке геля.

Пример 5. Влияние разницы давления на нанофильтрацию комплекса FVIII/VWF.

Частично очищенный раствор FVIII/VWF, в котором специфическая активность FVIII составляла примерно 10 IU/AU_280нм и с концентрацией в диапазоне 0,1-0,3 AU_280нм, был профильтрован через фильтр Planova 35N в условиях, описанных в Примерах 2 и 3. Нанофильтрация проводилась при высоком давлении (0,8 бар) и при низком давлении (0,3 бар), полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Planova 35N	Условия фильтрации	Давление (бар)	Концентрация белка в образце (OD280нм)	Скорость тока % по отношению к начальной скорости тока
Через 1 час	Через 3 часа
Высокое давление		0,179	10,6	7,9
0,8	0,271	14,6	н.о.(1)
Низкое давление (n=5)		0,187±0,039	98,2±7,3	88,6+3,5
0,3	0,133-0,236	92,1-110,8	84,5-92,5
(1)Невозможно определить, поскольку фильтрация была прервана из-за загрязнения и закупоривания нанофильтра.

Аналогичным образом раствор комплекса FVIII/VWF, предварительно профильтрованный через фильтр Planova 35N, был профильтрован через фильтр Planova 20N в условиях, описанных в примере 2. Нанофильтрация проводилась при высоком давлении (0,8 бар) и при низком давлении (0,3 бар), и были получены следующие результаты.

Таблица 3
Planova 20N	Условия фильтрации	Давление (бар)	Концентрация белка в образце (OD280нм)	Скорость тока по отношению к начальной скорости тока(%)
Через 1 час	Через 3 часа
Высокое давление	0,8	0,146	40	н.о.(1)
Низкое давление (n=4)		0,199±0,05	86,5±9,9	75,7±4,5
0,3	0,139-0,254	75,7-98,4	72,1-82,1
(1) Невозможно определить, поскольку фильтрация была прервана из-за загрязнения и закупоривания нанофильтра.

В случае фильтрации через фильтр Planova 35N при высоком давлении наблюдалось резкое снижение скорости тока: через один час фильтрации наблюдалось снижение скорости тока до 10,6% и 14,6% от начальной скорости тока, и в одном случае до 7,9% от начальной скорости тока через 3 часа фильтрации. В случае фильтрации через фильтр Planova 35N при разнице давлений 0,3 бар скорость тока составляла 88,6% даже через 3 часа нанофильтрации.

В случае фильтрации через фильтр Planova 20N раствора комплекса FVIII/VWF, прошедшего предварительную фильтрацию через фильтр Planova 35N, в качестве исходного материала при разнице давлений 0,8 бар скорость тока составила 40% через один час нанофильтрации, а через 3 часа фильтрация была остановлена из-за загрязнения и закупоривания нанофильтра. В случае фильтрации через фильтр Planova 20N при разнице давлений 0,3 бар скорость тока составила 75,7% даже через 3 часа нанофильтрации.

Из приведенных выше примеров совершенно очевидно, что поддержание условий низкого давления в процессе фильтрации при размере пор 35 нм или меньше позволяет избежать внезапного снижения скорости тока. Вследствие этого в условиях низкого давления не наблюдалось закупоривания части пор мембраны фильтра из-за их загрязнений молекулами с высоким молекулярным весом, которые присутствуют в растворе FVIII/VWF, такими как мультимерные формы VWF, достигающие размера 20000000 Да.

Пример 6. Влияние концентрации исходного материала на нанофильтрацию комплекса FVIII/VWF

Была проведена нанофильтрация разных растворов частично очищенного комплекса FVIII/VWF со специфической активностью FVIII примерно 10 IU FVIII/AU_280нм и активностью VWF по отношению к активности FVIII (VWF:RCo:FVIII) примерно 2 с концентрациями в диапазоне 0,1-0,65 AU_280нм через фильтры Planova 20N при разнице давлений примерно 0,5 бар тем же самым способом и в тех же условиях, которые описаны в Примерах 1 и 2 (за исключением концентрации).

Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4
Planova 20N	Используемая концентрация белка (OD280нм)	Отношение скорости тока по отношению к начальной скорости тока (%)	Используемые отношения	Производительность (активность, профильтрованная через единицу площади фильтра 20N в единицу времени)(2)	Выход белка (OD280нм) (%)
		Через 1 час	Через 3 часа	(AU280нм/c м2 фильтра 20N)	IU FVIII/ см2/ч	IU FVW:RCo/ см2/ч
0,106	80,7	71,4	1,77	2,6	5,2	77,6
0,170	63,6	30,5	1,39	2,0	4,1	87,6
0,314	60,7	33	2,85	3,9	7,8	82,5
0,343	52,9	32	2,19	3,2	6,5	88,6
0,648	16,2	н.о.(1)	1,16	0,9	1,8	46,8
(1)Н.о.: невозможно определить, поскольку фильтрация была прервана из-за загрязнения и закупоривания нанофильтра.
(2)Значения рассчитаны на основе количества белка, профильтрованного за 6 часов, во всех случаях специфическая активность была 10 IU FVIII/ AU280нм, отношение FVW:RCo/FVIII было 2, а выход белка рассчитывался в каждом случае.

Наблюдаемое в ходе нанофильтрации снижение скорости тока прямо пропорционально концентрации наносимого материала. Так, наблюдаемая через один час скорость тока составила 80,7%, 63,6%, 60,7%, 52,9% и 16,2% для растворов с исходной концентрацией 0,106 AU, 0,17 AU, 0,314 AU, 0,343 AU и 0,648 AU соответственно. В отношении скорости тока, наблюдаемой через 3 часа нанофильтрации, можно сказать, что снижение скорости тока ниже примерно 30,5% от начальной скорости тока может быть связано с тем, что нанофильтрация проводилась при таком давлении, которое представляет собой верхний предел давления для процесса фильтрации.

Значения оптимальной производительности (7,8 IU of VWF:RCo/см² /час, что эквивалентно 46,8 IU VWF:RCo/см²) и выхода белка (смотри таблицу) были получены при использовании исходной концентрации, близкой к 0,3 AU. Когда использовалась максимальная исходная концентрация (0,648 AU), с самого начала фильтрации наблюдались загрязнение и закупоривание нанофильтра, а производительность и выход белка значительно снижались до значений ниже 2 IU VWF:RCo/см ²/час и 46,8% общего выхода белка, что делает невозможным проведение нанофильтрации при такой концентрации.

Из приведенных данных можно заключить, что диапазон концентраций для нанофильтрации раствора FVIII/VWF со специфической активностью примерно 10 IU FVIII/AU_280нм составляет 0,6 AU, что эквивалентно примерно 6 IU/мл FVIII и 12 IU/мл VWF:RCo.

Пример 7. Влияние концентрации кальция на нанофильтрацию комплекса FVIII/VWF

Была проведена фильтрация разных растворов комплекса FVIII/VWF, смешанных с альбумином и имеющих специфическую активность более чем 10 FVIII/AU₂₈₀ и активность FVIII около 3 IU/мл, что примерно эквивалентно 4 IU/мл VWF:RCo, через фильтры с размером пор 20 нм в присутствии 0,1 М аргинина, 25 мМ гистидина и 0,05 мМ кальция при рН 7,3±0,1. Фильтрацию проводили при разнице давлений на фильтре Planova 20N примерно 0,5 бар. В таблице 5 показаны наиболее важные параметры, полученные при тестировании двух разных образцов продукта.

Таблица 5
Состав используемого образца	Производительность (IU/см2/час)	Выход (%)
OD280нм	FVIII (IU/мл)	FVIII	VWF:RCo	Активность FVIII
0,143	2,77	1,6	2,0(1)	43,3
0,188	2,96	1,6	2,0(1)	46,6
(1) Значения рассчитаны на основе IU FVIII, профильтрованного в единицу времени через единицу поверхности, принимая отношение (VWF:RCo/FVIII) равным 1,24.

Эти данные показывают, что практически полное отсутствие кальция (0,05 мМ) и его замена на аргинин (0,1 М) приводят к значительному снижению производительности, до значении 1,6 IU FVIII/см²/час и 2,0 IU VWF:RCo/см² /час в обоих случаях, что значительно меньше значений, которые были получены в Примере 2 (3,6 IU FVIII/см²/час и 8,2 IU VWF:RCo/см²/час), хотя активность FVIII в исходном материале была такой же.

Аналогичным образом выход активности FVIII, наблюдаемый в двух тестах, падает до 43,3% и 46,6% соответственно. Тем не менее, даже в этих условиях нанофильтрация макромолекулярного комплекса FVIII и VWF обеспечивала соотношение активностей VWF и FVIII, близкое к такому соотношению, наблюдаемому в природе (1:1).

Пример 8. Получение нанофильтрованного комплекса FVIII/VWF в промышленном масштабе

С использованием частично очищенного раствора комплекса FVIII/VWF, полученного из более чем 3000 литров плазмы крови и имеющего специфическую активность 15,6 IU FVIII/AU₂₈₀, была проведена фильтрация в несколько приемов через фильтр с номинальным размером пор 35 нм (Planova 35N) площадью 4 м² и через два фильтра с номинальным размером пор 20 нм (Planova 20N) площадью 4 м² в присутствии 25 мМ гистидина и 0,14 М кальция при рН 6,80. Фильтрацию проводили при постоянной скорости тока примерно 107 л/час, поддерживая разницу давлений на фильтре Planova 20N между 0,20 и 0,35 бар, с общей нагрузкой (раствор продукта + последующая промывка) 120,2 кг/м² фильтра Planova 20N. Общая активность, нанесенная на единицу площади, составила 8,9 IU FVIII/см² и 19,1 IU VWF:RCo/см². Выход активности после нанофильтрации составил 70,4% для FVIII и 77,3% для VWF:RCo. С учетом стадии последующей промывки и концентрирования полученного нанофильтрованного продукта, наблюдаемый выход активности составил 97,5% для FVIII и 86,8% для VWF:RCo.

Последующая преципитация хлоридом натрия и глицином (согласно патенту ЕР 0639203) обеспечивает получение нанофильтрованного концентрата FVIII/VWF с высокой чистотой.

Полученный нанофильтрованный концентрат FVIII/VWF с высокой чистотой был стабилизирован и доведен до нужной активности, после чего разлит по бутылям.

Относительное содержание VWF по отношению к содержанию VWF, выраженное в отношении VWF:RCo/FVIII, в ходе процесса очистки, показано ниже в таблице 6.

Таблица 6
Изменение активности (IU VWF:RCo/IU FVIII) в ходе процесса очистки
	Нанофильтрованный продукт (n=1)	Ненанофильтрованный продукт (n=6)
Исходный материал	1,7	1,57±0,19
Промежуточный концентрат	1,9	1,71±0,11
Высокоочищенный продукт	1,5	1,14±0,25
Расфасованный высокоочищенный продукт	1,5	1,24±0,19

Эти результаты показывают, что применение нанофильтрации в процессе очистки комплекса FVIII/VWF не влияет значительным образом на последующую стадию очистки, которая приводит к получению высокоочищенного продукта. Таким образом, это показывает, что подобранные условия нанофильтрации концентрата FVIII/VWF через мембрану с размером пор 20 нм не изменяют в худшую сторону содержание мультимерных форм VWF с высоким молекулярным весом, поскольку такое изменение, как можно было ожидать, оказывало бы отрицательное влияние на последующую очистку с помощью преципитации.

Прошедший нанофильтрацию концентрат FVIII/VWF имеет такую относительную концентрацию VWF, которая достаточна для его применения в качестве терапевтического продукта для лечения VWD, и такое содержание FVIII, которое также делает его возможным его применение для лечения гемофилии А, обеспечивая дополнительные преимущества от присутствия VWF (природного стабилизатора FVIII) в количествах, близких к таковым, обнаруживаемым в природе, что дает, как отмечалось выше, дополнительные преимущества при лечении гемофилии А.

Хотя настоящее изобретение раскрывается с помощью его предпочтительных воплощений и иллюстративных примеров, необходимо понимать, что на основе раскрываемого материала квалифицированный специалист в данной области техники может внести множество новых вариантов в воплощения настоящего изобретения, которые останутся в рамках настоящего изобретения, учитывая содержание пунктов следующей ниже Формулы изобретения и эквивалентов этих пунктов.