штамм бактерий pseudomonas species - продуцент хитинолитических ферментов

Формула изобретения

Штамм бактерий Pseudomonas species 182 коллекция УНЦ РАН - продуцент хитинолитических ферментов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологического производства и может найти применение для получения хитинолитического ферментного препарата.

Известны штаммы Serratia marcescens - продуценты хитиназы [1]. Однако известные штаммы являются условно патогенными для человека и теплокровных животных и поэтому их промышленное применение небезопасно для обслуживающего персонала.

Наиболее ближайшим к заявляемому штамму (прототипом) является штамм бактерий Pseudomonas maltophilia CR-332D, обладающий хитинолитической активностью [2] . Однако эффективность известного штамма как продуцента хитинолитических ферментов сравнительно невысокая.

Цель изобретения - расширение ассортимента доступных продуцентов и выделение природного штамма-продуцента хитинолитических ферментов, отличающегося высокой эффективностью гидролиза хитина.

Новый штамм выделен из супесчаной почвы Иглинского района Республики Башкортостан и хранится в коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра Российской Академии Наук под номером 182.

Штамм характеризуется следующими признаками. Клетки палочковидной формы, подвижные, грамотрицательные, неспорообразующие. Колонии на мясопептонном агаре (МПА) круглые, с ровными краями, слабовыпуклые, непрозрачные, серовато-белые. Пигмент желто-зеленый, диффундирующий в среду, нефлюоресцирующий.

Физиолого-биохимические признаки. В факторах роста не нуждается. По отношению к кислороду - аэроб. Оксидазная реакция положительная. Желатин не разжижает. Гидролизует лецитин, крахмал, продуцирует каталазу, не редуцирует нитраты до нитритов. Образует аргининдигидролазу. Накапливает поли--оксибутират. Растет при 4^oС и при 41^oС, растет на среде с 10 мг/мл Ba²⁺. В качестве источника углерода использует глюкозу, ксилозу, рамнозу, сахарозу, галактозу, рибозу, трегалозу, L-валин, -аланин, L-аргинин, малонат. Не усваивает арабинозу, мальтозу.

Штамм устойчив к ампициллину (500 мкг/мл), стрептомицину (50 мкг/мл), эритромицину (500 мкг/мл) и чувствителен к гентамицину (100 мкг/мл) и канамицину (100 мкг/мл). Штамм Pseudomonas species 182 проявляет активность по подавлению жизнедеятельности фитопатогенных грибов Bipolaris sorokiniana, Fusarium solani, F. culmorum, Altemaria altemata.

Хранится штамм на косяках МПА в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца.

По физиолого-биохимическим признакам штамм не соответствует ни одному из описанных в определителе бактерий (Берджи. т.1: Пер. с англ./Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П.Спита, Дж. Стейли, С. Уильямса. -М.: Мир, 1997.-432с.) и идентифицирован как Pseudomonas species 182.

Штамм Pseudomonas species 182 не является возбудителем оппортунистических инфекций животных, паразитом животных и человека.

Использование бактерий Pseudomonas species в качестве продуцента хитинолитических ферментов до настоящего времени не описано.

Пример 1. Определяют хитинолитическую активность нового штамма Pseudomonas species 182. Для этого штамм выращивают на среде с 1,5% агара следующего состава, г/л дистиллированной воды:

Дрожжевой экстракт - 0,5

(NH₄)₂SO₄ - 1

MgSO₄7H₂O - 0,3

КН₂PO₄ - 1,36

В качестве источника углерода в среду вводят коллоидный хитин. Хитин добавляют в среду в количестве 0,5%. Культивируют штамм на чашках Петри при 28^oС.

Эффективность гидролиза хитина определяли по величине отношения диаметра зоны просветления мутной среды вокруг колонии к диаметру колонии.

Результаты представлены в таблице и свидетельствуют о наличии хитинолитической активности у штамма Ps. species 182, причем эффективность гидролиза хитина у нового штамма выше, чем у штамма по прототипу (ориентировочно на 15%).

Пример 2. Для получения хитинолитических ферментов штамм Ps. species 182 выращивают в жидкой культуре на среде, приготовленной по примеру 1, с добавлением 0,1% пептона. Инкубируют при 28^oС в течение 5-7 дней в условиях аэрации. Далее биомассу отделяют центрифугированием. Супернатант культуральной жидкости представляет собой неочищенный препарат хитиназы.

Для определения активности препарата в чашки Петри разливали агаризованную среду из примера 1 с добавлением 0,5% хитина. После застывания среды с помощью стерильного пробочного сверла вырезали в ней лунки, в которые вносили исследуемый препарат. Чашки Петри инкубировали при 28^oС. Активность препарата оценивали по диаметру зон просветления агара, образующихся вокруг лунок, результаты не отличались от приведенных в таблице.

Литература

1. Moreal J., Relse E.T. The chitinase of Serratia marcescens //Can. J. Microbiology.-1969.-v. 15, p. 689-696.

2. Патент 2031119, Россия, кл. С 12 N 9/42, 1/20, 1995, БИ 8.