способ иммобилизации биологически активных веществ на матрицах пористых носителей

Формула изобретения

1. Способ иммобилизации биологических веществ на матрице пористых носителей, при котором указанную матрицу помещают в фильтрационный прибор, наносят на нее находящийся в жидкой фазе раствор препарата в виде слоя определенной толщины, устанавливают разрежение на выходе фильтровального устройства, задают требуемую величину точности реакции и осуществляют колориметрический или визуальный контроль результатов реакции, отличающийся тем, что толщину наносимого слоя реагента определяют из условий заданной точности реакции и обеспечения адекватного колориметрического и визуального контроля результатов реакции, после чего уточняют установленную на выходе фильтровального устройства величину разряжения, выбранную ниже "точки пузырька".

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на указанную матрицу наносят находящийся в жидкой фазе раствор препарата, подвергая его воздействию ультразвуковых колебаний.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что мощность указанных ультразвуковых колебаний ограничивают с учетом механико-деструкционной прочности иммобилизуемых биологических веществ.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на указанную матрицу наносят находящийся в жидкой фазе раствор препарата, подвергая его воздействию инфракрасного излучения.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что мощность и частоту указанного инфракрасного излучения ограничивают с учетом термо-деструкционной прочности иммобилизуемых биологических веществ.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к методам модифицирования пористых систем с целью создания биологически активных композиционных материалов. Биологически активными являются реагенты биологической природы (ферменты, антитела, антигены) и биологические объекты (тканевые клетки и микроорганизмы), предназначенные для иммобилизации на пористых основах при изготовлении биосенсорных зон в диагностических изделиях, в том числе тест-полосках для экспресс-диагностики в медицине и экологии.

Известен, например, аналог предлагаемого - способ модификации микрофильтрационных материалов для очистки физиологически активных препаратов [1], при котором помещают в фильтрационный прибор исходный микрофильтрационный материал, наносят на него находящийся в жидкой фазе препарат и используют перепад давлений при работе фильтровального устройства, что совпадает с существенными признаками предлагаемого способа.

При этом избыточное давление на входе фильтровального устройства устанавливают равным 0.210⁵ Па. Кроме того, в известном способе исходный материал предварительно обрабатывают раствором хлорида калия, в качестве модифицирующего агента используют латекс. Недостаток известного способа состоит в том, что используемое количество наносимого раствора достаточно велико - 50 мл, что не оправдано при использовании дорогостоящих биологически активных веществ, например ферментов. Кроме того, конкретно выбранное значение давления сужает диапазон параметров наносимых препаратов, ограничивая диапазон характеристик реализуемых устройств.

Наиболее близким к предлагаемому является способ иммобилизации липидов из спиртового раствора на поверхность трековой мембраны [2], принятый в качестве прототипа.

В способе-прототипе помещают в фильтрационный прибор исходный микрофильтрационный материал, наносят на него находящийся в жидкой фазе раствор препарата и устанавливают разрежение на выходе фильтровального устройства, что совпадает с существенными признаками предлагаемого способа.

При этом исходный микрофильтрационный материал является трековой мембраной. Принцип действия изготавливаемых данным способом изделий состоит в том, что получаемая сложная двухслойная матрица (основа и слой реагента) на этапе эксплуатации также должна впитать анализируемую жидкость, именуемую аналитом - воду, раствор препарата, биологическую жидкость - слезу, кровь и т.п. и иммобилизованный в активной зоне реагент должен вступить в реакцию с аналитом. Результат реакции состоит в изменении цвета активной зоны и может быть подвергнут визуальному контролю или фотометрическому анализу.

Недостатком известного способа, возникающим из-за ненормированности создаваемого разрежения, является возможность практически полного перекрытия поры раствором реагента и образование слоя заметной толщины на исходной матрице. Это явление особенно существенно, если реагент имеет высокую вязкость. Слой, формирующийся на основной матрице, резко снижает сечение поры, что ограничивает площадь контакта реагента с аналитом и заставляет повышать концентрацию реагентов, как правило, очень дорогих.

Кроме того, недостаток известного способа состоит в том, что слабо развитая поверхность трековой мембраны снижает точность колориметрического и визуального контроля результатов биохимических анализов, проводимых с помощью рассматриваемого способа. Кроме того, отсутствие дозировки наносимых реагентов и регулирования величины разрежения снижает эффективность известного способа, повышает стоимость производимой продукции, уменьшает его функциональную гибкость.

Таким образом, анализ уровня техники показывает, что при иммобилизации биологических веществ весьма актуальным является следующий технический результат:

- повышение точности колориметрического и визуального контроля результатов биохимических анализов при использовании пористых матриц с иммобилизацией на них биологических веществ, в том числе лечебного назначения,

- повышение эффективности колориметрического и визуального контроля результатов биохимических анализов,

- повышение экономической эффективности биохимических анализов,

- повышение функциональной гибкости методов колориметрического и визуального контроля результатов биохимических анализов.

Перечисленные ранее недостатки прототипа устраняются и указанный выше технический результат реализуется в предлагаемом способе иммобилизации биологических веществ на матрице пористых носителей, при котором указанную матрицу помещают в фильтрационный прибор, наносят на нее находящийся в жидкой фазе раствор препарата (лечебного или аналитического) и устанавливают разрежение на выходе фильтровального устройства, что совпадает с существенными признаками известного способа. При этом величину разрежения выбирают ниже "точки пузырька".

Кроме того, толщину наносимого слоя реагента определяют из условий заданной точности реакции, после чего уточняют величину разрежения, установленного на выходе фильтровального устройства.

Кроме того, оценивают толщину наносимого слоя реагента, необходимую для обеспечения адекватного колориметрического и визуального контроля результатов реакции, после чего уточняют величину разрежения установленного на выходе фильтровального устройства.

Кроме того, указанную матрицу подвергают воздействию ультразвуковых колебаний.

Кроме того, мощность указанных ультразвуковых колебаний ограничивают с учетом механико-деструкционной прочности иммобилизуемых биологических веществ.

Кроме того, указанную матрицу подвергают воздействию инфракрасного излучения.

Кроме того, мощность и частоту указанного инфракрасного излучения, ограничивают с учетом термо-деструкционной прочности иммобилизируемых биологических веществ.

Итак, способом избежать потери чувствительности и снизить стоимость изготовления является предлагаемый в настоящей заявке динамический метод иммобилизации реагентов на основной исходной матрице с образованием вторичного слоя композиционной матрицы. Он состоит в том, что иммобилизация проходит в режиме фильтрования под давлением, превышающем давление вытеснения смачивающей основной материал жидкости. Классическое определение объемной скорости фильтрования по формуле Пуазейля дает следующую зависимость длительности фильтрования определенного объема жидкости:



где l - длина пора, м;

r - его средний радиус, м;

- вязкость, Пас;

Р - разность давлений на концах пора, Па;

Q - объемная скорость фильтрования, м³с^-1.

Известно также, что давление вытеснения смачивающей жидкости подчиняется следующему закону:

P_в = 4cos/d (2),

где - поверхностное натяжение, Нм^-1,

- краевой угол смачивания матрицы пористой основы смачивающей жидкостью, рад.,

Р_в - минимальное давление, достаточное для вытеснения жидкости из пор основы, Па,

d - диаметр поры, м.

Таким образом, кратковременный контакт фильтруемого реагента с материалом основной матрицы позволяет сформироваться тонкому слою реагента на внутренней поверхности пор материала. Последнее позволяет более экономно расходовать материалы при изготовлении тест-полосок и других диагностических изделий. Кроме того, возможно прогнозирование скорости взаимодействия растворов аналита с биологически активными реагентами на основе наблюдения за временем растекания капли раствора аналита на пористом носителе. Расчеты основаны на том, что характеристики жидкости (вязкость, поверхностное натяжение) и суммарный эффект взаимодействия жидкости (краевые углы смачивания), учтены в соотношении и Пуазейля (1), и Лукаса-Вашберна [3] - уравнение (3).

dl/dt = -rcos/4l (3).

Уравнение (3) преобразуется при интегрировании в (4).

t = 2l²/rcos (4).

В уравнениях (3) и (4)

r - радиус поры (в данном случае - капилляра), м,

- поверхностное натяжение Нм^-1,

- краевой угол смачивания матрицы пористой основы смачивающей жидкостью, рад.,

l - длина поры, м, - вязкость жидкости, Пас,

t - время движения жидкости на расстояние l.

Эти соотношения дают возможность расчета режима взаимодействия аналитов с композиционным биологически активным материалом, каковым являются активные зоны биосенсоров, при их эксплуатации и в технологическом процессе изготовления биосенсоров путем иммобилизации биологически активных веществ на матрице.

Процесс иммобилизации биологически активного вещества на заданном участке пленки при автоматизированном изготовлении тест-полосок для диагностики заболеваний человека, животных и растений или для экологических исследований сопровождается затем изготовлением нарезанных по шаблону полосок и их фиксацией в корпусе, содержащем "рабочие окна" и "окна контроля". Знание времени движения аналита в поровом пространстве биоактивной зоны позволяет провести расчет конструкции изделия - расстояний от места введения аналита до обоих окон.

В лабораторных условиях предлагаемый способ может быть применен в решении следующих задач:

Отработка способов изготовления тест-полосок для измененных условий или ранее не использованных биологических жидкостей с целью оптимизации диагностического процесса;

Отработка методов исследования скорости трансдермального переноса лекарственных препаратов;

Отработка экспресс-методов экологического контроля.

Во всех этих случаях полезны предварительные сведения о том, как будет меняться режим взаимодействия жидкости и пористого материала при изменении физико-химических характеристик реагентов.

Примеры.

Для проведения иммобилизации биологически активных веществ в динамическом режиме собрана установка, состоящая из водоструйного насоса, вакуумметра и фильтродержателя фирмы Миллипор типа Sterifil 47 mm Filter Holder.

Пример 1.

Для проведения иммобилизации альбумина (модельного раствора) в динамическом режиме в фильтродержатель собранной установки помещают микропористую пленку Химифил, поверх фильтра наливают раствор альбумина в количестве 20 мл и проводят фильтрование. При этом устанавливают давление ниже точки пузырька, чему соответствует значение диаметра пор пленки согласно формуле (2). Варьируя концентрацию альбумина, фиксируют разные по толщине слои белка. Время фильтрации (1) возрастает с ростом вязкости, прямо пропорциональной концентрации альбумина. Затем сравнивают интенсивность окрашивания метиленовым синим - реагентоспособность пленок в зонах иммобилизации белка с той же характеристикой пленок, изготовленных обычным методом пропитки. Сравнение показывает, что масса иммобилизованного белка на фрагментах, используемых в динамическом режиме, в 5-6 раз меньше, чем на пленках, пропитанных обычным способом, при одинаковой реакции, определяемой с помощью ФЭК (фотоэлектроколориметра).

Пример 2.

Раствор холинэстеразы ранее описанным методом фиксируют в динамическом режиме на пористых пленках типа HAWP фирмы Миллипор. Параллельно те же инкубируют пленки в растворе холинэстеразы. После высушивания обе серии образцов пленок с иммобилизованным ферментом подвергают воздействию реактива Эллмана [4]. Цветовая реакция идет быстрее на пленках с иммобилизованным в установке ферментом при одной и той же концентрации фермента в растворах, но 4-5-кратно меньшем объеме израсходованного раствора фермента.

С помощью описанных выше устройств можно иммобилизовать лекарственные препараты в динамическом режиме при создании повязок пролонгированного действия путем подачи в качестве фильтруемой жидкости лечебного раствора, для чего в фиксатор помещают образец повязки. На слой наносят определенное количество раствора, включают вакуумный насос и устанавливают давление, не превышающее "точку" пузырька. Вместо впитывания рассчитывают и выбирают оптимальный режим иммобилизации препарата по минимальному времени фильтрования (максимальной скорости фильтрования).

Пример 3.

Смесь глицерина, нашатырного и этилового спирта (смягчающий кожу препарат) в количестве 20 мл пропускают через нетканый материал, разрешенный к применению в хирургии. Параллельно в 100 мл пропитывают обычным способом такой же по площади фрагмент основы - хирургического нетканого материала. Затем проверяют экспертной оценкой эффективность действия на добровольце с трещинами в области пальцев рук (синдром "сухой кожи" - доброволец С., 61 год). Эффективность аппликаторов одинакова (оценка по успокаивающему действию со слов добровольца) при 5-кратной экономии препарата и повышенному удобству пользования.

Таким образом, не затрачивая большие количества реагентов и лечебных препаратов, можно иммобилизовать биологически активные вещества на пористых носителях путем применения динамического режима. Можно также прогнозировать, как изменится скорость работы биологически активного вещества при повышении его концентрации, при изменении температуры в производстве других биосенсоров, что сократит этап предварительных исследований и снизит их стоимость.

Приведенные примеры свидетельствует о перспективности предлагаемого способа и для изучения особенности иммобилизации препаратов, различных по аналитическому или медицинскому назначению, на пористых носителях.

Далее покажем, что технический результат в предлагаемом способе реализуется именно за счет его существенных отличий.

То, что величину разрежения выбирают ниже "точки пузырька" способствует равномерности нанесения реагента на поверхность пор и поров, т.к. исключает возможность "закипания" жидкой фазы.

То, что толщину наносимого слоя реагента определяют из условий заданной точности реакции, после чего уточняют величину разрежения, установленного на выходе фильтровального устройства, позволяет ограничиться минимальным количеством реагентов, зачастую весьма дорогих, и таким образом снизить себестоимость изделий, повысить экономическую эффективность способа. Одновременно увеличивается и чувствительность, точность способа с учетом увеличения активной поверхности изделий, поскольку активное разрежение не позволяет порам закупориваться и способствует более равномерному растеканию жидкой фазы по стенкам пор. Последнее способствует дополнительному повышению экономической эффективности способа.

То, что оценивают толщину наносимого слоя реагента, необходимую для обеспечения адекватного колориметрического и визуального контроля результатов реакции, после чего уточняют величину разрежения установленного на выходе фильтровального устройства, позволяет дополнительно снизить расход дорогостоящих реагентов с учетом особенностей колориметрического и визуального контроля результатов биохимических анализов, проводимых с помощью рассматриваемого способа. Дело в том, что визуально контролируемая зона изменения цветовой окраски имеет глубину порядка половины длины волны наблюдаемого кванта света. Соответственно, такого же порядка должна быть выбрана и глубина пропитываемого слоя, что позволяет существенно снизить расход дорогостоящих реагентов. Действительно, сопоставление обычно производимой пропитки на всю толщину подложки, например 1 мм, и глубины пропитки в предлагаемом способе - порядка 0,4-0,8 мкм, говорит о возможности улучшения рассматриваемого параметра на 3 порядка.

То, что указанную матрицу подвергают воздействию ультразвуковых колебаний, также позволяет повысить равномерность нанесения реагентов на пористую матрицу. В результате повышается точность получаемых анализов, их достоверность.

При этом мощность указанных ультразвуковых колебаний ограничивают с учетом механико-деструкционной прочности иммобилизуемых биологических веществ, поскольку биологические объекты могут разрушаться при достаточно жестких воздействиях.

Нагревание матрицы, например, воздействием инфракрасного излучения, позволяет варьировать вязкость и поверхностное натяжение наносимых реагентов, что расширяет диапазон используемых биохимических материалов и объектов, повышает функциональную гибкость способа.

При этом мощность и частота указанного инфракрасного излучения не должны быть слишком велики, чтобы избежать разрушения иммобилизуемых биологических веществ.

Таким образом, показано, что именно существенные отличия предлагаемого способа обеспечивают достижение требуемого технического результата.

Проведенные эксперименты показали реализуемость предлагаемого способа.

Список литературы

1. Способ модификации микрофильтрационных материалов для очистки физиологически активных препаратов (авт. св. СССР 1801561, приоритет 06.03.93, кл. В 01 D 67/00).

2. Снегирева Н.С. и др. Модели кожи - биоактивные композиты для биомедицинских исследований. Механика композиционных материалов и конструкций, т. 3, 4, 1997 г., с.68 (прототип).

3. Хейфец Л.И., Неймарк А.В. Многофазные процессы в пористых средах. - М.: Химия, 1982. 320 с.

4. Ellman G. L., Courtney K.D., Andres V., Featherstone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7, 1961, p.88-95.