способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ

Классы МПК:C12N11/14 ферменты или микробные клетки, иммобилизованные на или в неорганическом носителе
C07B43/04 аминогрупп
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кемеровский технологический институт пищевой промышленности" (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2010-02-16
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ. Способ заключается в модификации содержащих сложноэфирные группы наночастиц Fе3О 4. Затем полученные частицы обрабатывают аминопропилтриэтоксисиланом. Далее суспензию наночастиц инкубируют с конденсирующим агентом и осуществляют иммобилизацию фермента. Способ позволяет получать иммобилизованные препараты с удельной активностью фермента более 70%. 3 табл.

Формула изобретения

Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ, состоящий в формировании большого количества активных функциональных групп с использованием алкоксисиланов на поверхности носителя со сложноэфирными фрагментами, отличающийся тем, что в качестве поверхностно-модифицированного носителя используются наночастицы Fe3O4 .

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биоорганической химии, а именно к способу ковалентной иммобилизации биомолекул на поверхности наноматериалов, содержащих этерифицированные карбоксильные группы, и его применению при создании иммобилизованных ферментных препаратов. Изобретение может быть использовано в биотехнологии, в том числе в пищевой промышленности.

В данной области известно большое число технических решений, среди которых наибольшее распространение получили химические способы иммобилизации, заключающиеся в ковалентном связывании биомолекул с предварительно активированным носителем. Предварительная активация носителя предусматривает модификацию его поверхности путем обработки химическими соединениями, имеющими реакционноспособные функциональные группы (NH2, -NH-NH2, -ОН и др.), посредством которых реализуется химическое присоединение биомолекул. Однако в своей массе эти технические решения обладают рядом недостатков, а именно: использование дорогостоящих материалов и реактивов для иммобилизации, трудоемкость методик.

Известен способ иммобилизации (см. пат. РФ № 94024389, МПК C12N 11/00, заявл. 29.06.1994, опубл. 10.06.1996) биообъектов на поверхности стекла (керамики), заключающийся в обработке поверхности носителя раствором алкоксибензоата металла. В качестве растворителя используют полярный апротонный растворитель, в частности тетрагидрофуран, диметоксиэтан. Концентрация раствора составляет 0,05-0,8 моль/л. Раствор алкоксибензоата металла наносят на поверхность центрифугированием или окунанием и сушат на воздухе при температуре 15-30°С. В качестве биообъекта используют глюкозооксидазу, которую в виде 3%-ного раствора наносят на модифицированную поверхность. Степень фиксации составляет 90%. Главными недостатками данного подхода являются низкая плотность функциональных групп на поверхности носителя, что приводит к невысокой эффективности ковалентного связывания, а также трудоемкость процедуры иммобилизации.

Известен также способ получения иммобилизованного протеолитического фермента (см. пат. РФ № 1041567, МПК C12N 11/10, опубл. 15.09.1983), предусматривающий растворение содержащего альдегидные группы носителя в буферном растворе и последующее присоединение протеолитического фермента. В качестве носителя используют ксилоуронид, растворенный в 0,1 М трисоксиметиламинометановом буфере (рН 8,5), а присоединение фермента осуществляют при соотношении носитель-фермент 1:1. К основным недостаткам данного способа относятся следующие: дефицитный и дорогостоящий носитель - ксилоуронид, низкая стабильность целевого продукта, необходимость хранения препарата при низкой температуре (0-4°С).

Также известен подход к получению иммобилизованного фермента, заключающийся в следующем (см. пат. РФ № 586182, МПК C07G 7/02, заявл. 30.08.1974, опубл. 30.12.1977). Фермент вводят в водную или спиртовую среду вместе с сочетающим агентом - карбодиимидом, используя в качестве носителя карбоксилсодержащий материал, например, полипропиленовую ткань с привитыми группами акриловой кислоты, частично гидролизованный полиэтилентерефталат, в форме тканей, пленок, гранул, волокон и т.д. При этом в случае проведения иммобилизации в водной среде при значениях рН порядка 5 в соответствующем буфере, когда фермент полностью растворим, в качестве сочетающего агента применяют водорастворимые карбодиимиды, например, 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-м-п-толуолсульфонат и т.д. Основной недостаток этого способа иммобилизации связан с низкой удельной активностью полученных препаратов.

Наиболее близким к заявляемому изобретению - прототипом - является изобретение, описывающее ковалентную иммобилизацию биомолекул на поверхности полимерных материалов, содержащих этерифицированные карбоксильные группы (см. пат. РФ № 2321574, МПК С07В 43/06, заявл. 06.04.2006, опубл. 10.04.2008). Данный способ основан на решении проведения модификации поверхности биочипа путем двухстадийной обработки, причем одна из стадий осуществляется в газовой фазе. Это позволяет снизить вероятность отслаивания модифицирующего слоя от поверхности носителя и увеличить количество иммобилизованных биообъектов. На первой стадии обработки поверхности чипа проводят аминолиз поверхностных сложноэфирных групп полимера, для чего подложку обрабатывают в газовой фазе аминосиланом (аминопропилтриэтоксисилан, аминопропилтриметоксисилан). На второй стадии формируют большое количество функциональных групп, необходимых для иммобилизации биомолекул, путем проведения совместной поликонденсации соответствующего силана с триалкоксисилановыми фрагментами.

На заключительном этапе формирования чипа выбирают способ нанесения и иммобилизации биомолекул на модифицированную поверхность подложки и проводят иммобилизацию.

Основным недостатком данного решения следует считать тот факт, что ковалентная иммобилизация описана только для органических полимерных носителей, таких как полиметилметакрилат, поливинилхлорид, поликарбонат, по-либутилметакрилат, сополимеры бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол и акрилонитрил.

Задачей технического решения является упрощение процедуры иммобилизации ферментных препаратов и улучшение их физико-химических характеристик.

Технический результат достигается за счет использования в качестве матрицы наночастиц Fe3O4, а также недорогих и доступных реактивов. Совокупность предложенных операций позволяет получать иммобилизованные ферментные препараты, отличающиеся от известных аналогов рядом признаков, прежде всего удельной активностью фермента, оптимальными значениями рН и температур.

Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц Fe3O4 для иммобилизации биологических веществ включает выполнение следующих операций. На первом этапе осуществляется получение наночастиц магнетита, содержащих на поверхности электрофильные сложноэфирные группы, путем взаимодействия полиметилметакрилата, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля. Вторая стадия заключается в формировании на поверхности наночастиц слоя аминопропилтриэтоксисисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Полученные наночастицы служат для последующей иммобилизации ферментов с использованием конденсирующего агента карбодиимида.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Смесь полиметилметакрилата, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля нагревают при перемешивании в атмосфере азота до 220°С, после чего к смеси добавляют раствор гидроксида натрия в диэтиленгликоле, через несколько минут образовавшиеся наночастицы Fe3O4 со сложноэфирными группами отделяют центрифугированием. Полученные магнитные наночастицы защищены от агрегации в силу межчастичных взаимодействий и влияния среды, а также модифицированы и пригодны для иммобилизации биологических веществ посредством конденсирующего агента. Вторая стадия заключается в формировании на поверхности наночастиц слоя аминопропилтриэтоксисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Следует отметить, что на второй стадии присутствие воды в системе должно быть ограничено, поскольку ее наличие приводит к гидролизу аминопропилтриэтоксисилана и образованию олигомерных силанов. Поэтому в отдельной камере объемом 50 см3 наночастицы (5,0 мг) покрывают газообразным 3-аминопропилтриэтоксисиланом (1 см3) при атмосферном давлении и температуре 70°С в течение 60 минут. После остывания образец обрабатывают этиловым спиртом три раза по 1 см3 и высушивают на воздухе. Далее частицы (5,0 мг) обрабатывают 0,5%-ным раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана (растворитель - смесь этанол:вода 1:1) в течение двух часов при температуре 50°С. На этом этапе происходит совместная поликонденсация силана с триалкоксисилановыми группами. По окончании процесса модификации наночастицы Fe3O4 несколько раз промывают растворителем вода - этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц с концентрацией 5 мг/см3 в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,8).

Далее 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в 0,1М фосфатном буфере в течение двух часов при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза 0,025М фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл 0,1М фосфатного буфера. На следующей стадии растворяют 500 мкг способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для   иммобилизации биологических веществ, патент № 2425879 -химотрипсина в 500 мкл 0,1М фосфатного буфера и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии наночастиц в 0,1М фосфатном буфере при температуре 30°С в течение двух часов. По окончании иммобилизации наночастицы промывают 0,025М фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Полученный иммобилизованный препарат хранится в виде суспензии наночастиц с ковалентно связанным ферментом в 1000 мкл 0,1М фосфатного буфера. Физико-химические характеристики химотрипсина, иммобилизованного на наночастицах Fe3O4, представлены в табл.1. В качестве контроля в данном случае используют химотрипсин, иммобилизованный на немодифицированных наночастицах Fe3O4 адсорбционным способом.

Таблица 1
Физико-химические параметры иммобилизованного химотрипсина
Способ иммобилизации Содержание белка в иммобилизован-ном препарате, мкг/мг носителя Удельная активность фермента, ед./мг белка Удельная активно-сть фермента, % от нативного Оптимум, рНТемпературный оптимум, °С
Иммобилизация на модифицированных наночастицах Fe3 O414,5 30,5 76,37,5-9,0 40
Контрольный опыт 9,822,5 56,37,4-9,0 35

Пример 2

Получение наночастиц Fe3O4 с поверхностными сложноэфирными группами и их модификацию силаном осуществляют аналогично примеру 1. Затем готовят суспензию наночастиц (5 мг/см3) в 200 мМ фосфатном буфере (рН 7,0). В качестве иммобилизуемого протеолитического фермента используют термолизин. Для его иммобилизации 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в 200 мМ фосфатном буфере в течение двух часов при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза 200 мМ фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл 200 мМ фосфатного буфера. Затем подготавливают раствор термолизина, растворив 1000 мг фермента в 1000 мкл 200 мМ фосфатного буферного раствора, который инкубируют с 500 мкл суспензии наночастиц в 200 мМ фосфатном буфере при температуре 45°С в течение трех часов. По окончании иммобилизации наночастицы Fe3O4 промывают 200 мМ фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Полученный иммобилизованный препарат хранится в виде суспензии наночастиц с ковалентно связанным ферментом в 1000 мкл 200 мМ фосфатного буфера (рН 7,0). Физико-химические характеристики термолизина, иммобилизованного на наночастицах Fe3O4 , представлены в табл.2. В качестве контроля используют термолизин, иммобилизованный на немодифицированных наночастицах Fe3 O4 адсорбционным способом.

Таблица 2
Физико-химические параметры иммобилизованного термолизина
Способ иммобилизации Содержание белка в иммобилизо-ванном препарате, мкг/мг носителя Удельная активно-сть фермента, ед./мг белка Удельная активно-сть фермента, % от нативного Оптимум, рНТемпературный оптимум, °С
Иммобилизация на модифицированных наночастицах Fe3 O421,5 38,9 76,46,9-8,6 45
Контрольный опыт 13,224,0 47,27,6-8,2 30

Пример 3

Для получения наночастиц Fe3O4 со сложноэфирными группами на поверхности и их модификации силаном осуществляют последовательность операций, аналогичную примеру 1, после чего готовят суспензию наночастиц (5 мг/см3) в 100 мМ фосфатном буфере (рН 6,8). Иммобилизуемым объектом является протеолитический фермент эластаза. 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в 100 мМ фосфатном буфере в течение двух часов при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза 100 мМ фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл 100 мМ фосфатного буфера. На следующем этапе иммобилизации растворяют 1000 мг эластазы в 1000 мкл 100 мМ фосфатного буфера и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии модифицированных наночастиц в 100 мМ фосфатном буфере при температуре 40°С в течение четырех часов. По окончании иммобилизации наночастицы промывают 100 мМ фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Полученный иммобилизованный препарат хранится в виде суспензии наночастиц с ковалентно связанным ферментом в 1000 мкл 100 мМ фосфатного буфера (рН 6,8). Физико-химические характеристики эластазы, иммобилизованной на наночастицах Fe 3O4, представлены в табл.3. В качестве контроля используют эластазу, иммобилизованную на немодифицированных наночастицах Fe3O4 адсорбционным способом.

Таблица 3
Физико-химические параметры иммобилизованной эластазы
Способ иммобилизации Содержание белка в иммобилизо-ванном препарате, мкг/мг носителя Удельная активность фермента, ед./мг белка Удельная активно-сть фермента, % от нативного Оптимум рНТемпературный оптимум, °С
Иммобилизация на модифицированных наночастицах Fe3 O411,3 5,8 70,76,5-7,2 35
Контрольный опыт 7,74,5 54,86,8-7,1 28

Таким образом, иммобилизация протеолитических ферментов на поверхности модифицированных наночастиц Fe3O4 позволяет получить гетерогенные ферментные препараты с высокой удельной активностью по сравнению с известными способами иммобилизации ферментов на органических полимерных носителях. Преимущества данного изобретения перед прототипом следующие:

- обеспечение возможности использования в качестве носителя для иммобилизации наночастиц, обладающих рядом преимуществ перед макрообъектами;

- повышение удельной активности иммобилизованных препаратов;

- оптимизация условий функционирования иммобилизованных препаратов;

- упрощение технологии получения иммобилизованных препаратов.

Класс C12N11/14 ферменты или микробные клетки, иммобилизованные на или в неорганическом носителе

биокатализатор для переэтерификации жиров и способ его получения -  патент 2528778 (20.09.2014)
фотобиокатализатор для образования водорода и фотокаталитический способ получения водорода -  патент 2511053 (10.04.2014)
способ иммобилизации l-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах -  патент 2460790 (10.09.2012)
биокатализатор, способ его приготовления и способ получения инвертного сиропа с использованием этого катализатора -  патент 2451546 (27.05.2012)
стабилизатор ферментативной активности пероксидазы -  патент 2445271 (20.03.2012)
фотобиокатализатор для получения восстановленных форм никотинамидных коферментов nadh или nadph и фотокаталитический способ получения nadh или nadph -  патент 2416644 (20.04.2011)
биокатализатор, способ его приготовления и способ получения инвертного сиропа с использованием этого биокатализатора -  патент 2372403 (10.11.2009)
способ получения композиции, содержащей высушенные бактерии, и ее применение -  патент 2370525 (20.10.2009)
ферментативная модификация триглицеридных жиров -  патент 2366693 (10.09.2009)
способ получения иммуносорбента -  патент 2363732 (10.08.2009)

Класс C07B43/04 аминогрупп

Наверх