стабилизатор ферментативной активности пероксидазы

Формула изобретения

Стабилизатор ферментативной активности пероксидазы, представляющий собой наноразмерные частицы кобальтовой феррошпинели, компоненты которой изменяются в интервале Co_0,7±0,05Fe _2,3±0,05O₄÷Co_1±0,05 Fe_2±0,05O₄, суспендированные в натрий-фосфатном буферном растворе в концентрации 0.01-10 мг/мл.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для повышения коэффициента полезного действия ферментов, так как низкая биокаталитическая эффективность ферментов зачастую задерживает развитие крупномасштабных биопроизводств, способных конкурировать с традиционными химическими процессами.

Известны в основном два способа повышения активности и продления срока хранения ферментативных препаратов.

Первый способ относится к обработке ферментативного препарата различными веществами.

Известен способ ферментативной стабилизации органического осадка (SU 1227604, 1986), включающий введение смеси ферментов, содержащих амилазу, протеазу, глюконазу, перемешивание и выдерживание при 25-40°С и рН 5-8 в течение 5-10 часов с последующим разделением на стабилизированный ил и иловую воду, отличающийся тем, что с целью повышения степени стабилизации и уменьшения потребности в ферментах, в смесь осадка и ферментов вводят стабилизатор - комплексообразователь - динатрийгидрогенэтилендиаминтетраацетат.

Основным недостатком стабилизатора является низкая степень стабилизации, в результате необходимо вводить большое количество комплексообразователя в смесь ферментов и проводить термическую обработку.

Известен способ стабилизации водного раствора или суспензии металлопротеазы и стабилизированный водный раствор или суспензия металлопротеазы, отличающийся тем, что в водный раствор или суспензию в качестве стабилизатора вводят N-защищенную аминокислоту (бензилоксикарбониламинокислоту) в молярной концентрации, превышающей более чем в 30-500 и даже 900 раз молярную концентрацию металлопротеазы (RU 2167937, 1996).

Основным недостатком стабилизатора является необходимость большого количества последнего, значительно превышающего молярную концентрацию металлопротеазы. Кроме того, при приготовлении раствора фермента необходимы операции с контролируемыми температурами и два стабилизатора: ионы кальция и аминокислота.

Известны «Stabilized Agueous enzyme compositions», включающие введение в раствор, содержащий водные амилолитические ферменты в качестве стабилизатора, активаторов - водорастворимой кальциевой соли и алифатического гликоля (НО-СНСНО) или пропандиола (US Patent 3819528, 1974).

Основным недостатком этих веществ является низкий уровень стабилизации и активации фермента.

Известен способ стабилизации и активации гидролитических ферментов, в частности амилосубтилина или ксиланазы, включающий введение в качестве стабилизатора водного раствора 5-метилрезорцина в концентрации 0.05-1.0 мГ/мл (предпочтительно 0.5-1 мГ/мл для амилосубтилина и 0.05-0.2 мГ/мл для ксиланазы) и инкубирование полученной смеси при температуре 50°С в течение 10 мин (RU 2238318, 2004).

Основным недостатком технического решения является малое время, в течение которого фермент остается стабильным.

Известны стабилизаторы тетраметилбензол или люминал (в темноте), которые позволяют пероксидазе хрена сохранять ферментативную активность на постоянном уровне в течение 84 дней. Однако при выдерживании на свету через 42 дня их активность падает на 80% и составляет только 20%, кроме того, тетраметилбензол является канцерогеном (Schuetz, Andreas; Winkler Michael; Welleir Michael G; Niessner, Reinhard Proc. SPIE vol.3105, P.332-340, Chemical, Biochemical and environmental Fiber Sensors IX, Robert A. Lieberman; Ed (SPIE Homepage).

Известен способ хранения пероксидазы хрена и глюкооксидазы в присутствии стабилизатора - поливинилового спирта (ПВА), однако он позволяет сохранять активность более 75% только в течение 15 дней, при этом в контроле с Micro-o-Protect (PBSM) сохраняется только 40% (Scott Boyd, Kristy Letcher, Hiroshi Yamazaki Stabilization Effect of Polyvinil Alcohol on Horseradish peroxidase, Glucose oxidase, -Galactosidase and Alkaline Phosphatase (Biotechnology Techniques, vol.10, № 9 (1996), pp.693-698.

Второй способ повышения активности и продления срока хранения основан на иммобилизации фермента на стабилизаторах-носителях различного вида и в ряде случаев дополнительной обработке ферментативного препарата специально подобранными веществами. Улучшение биокаталитической эффективности может быть достигнуто путем управления структурой стабилизатора-носителя фермента.

Известен способ стабилизации протеазы Bacillus SUBTILIS, включающий иммобилизацию препарата на стабилизаторе - специальной целлюлозной матрице - и промывание водным раствором солей органических кислот. Такая обработка существенно увеличивает стабильность препарата при хранении (SU 1597390, 1990).

Основным недостатком стабилизатора является сложность при изготовлении и активировании 2,4,6-трихлор-1,3,5-сим-триазином целлюлозной матрицы.

Известен способ стабилизации фермента инвертазы при иммобилизации. Для этого инвертазу включают в структуру стабилизатора - органического геля (Aziz Tanriseven, Senay Dogan. Immobilization of invertase within calcium alginate gel capsules / Process Biochemistry 2001, 36, pp.1081-1083).

Существенным недостатком стабилизатора являются трудности при изготовлении органических гелевых матриц, цена которых очень высока.

Известен способ иммобилизации группы ферментов, в том числе содержащей инвертазу на стабилизаторах - гранулах активированного угля, покрытых полиаминами. С поверхностью носителя фермент связан ковалентно с помощью специальных сшивающих реагентов (US Patent 4438196, 1984).

Основные недостатки стабилизатора заключаются в сложности, многостадийности и большой трудоемкости его изготовления. Кроме того, сшивающие реагенты способны уменьшать ферментативную активность.

Известен способ приготовления биокатализаторов, при осуществлении которых инвертаза иммобилизована на стабилизаторах - неорганических глинистых носителях (каолин, бентонит) путем адсорбции (FR 2020527, 1970).

Недостатком стабилизатора является малая активность фермента в его присутствии.

Известен биокатализатор для получения инвертного сахара и способ получения инвертного сахара, в котором инвертаза, выделенная из микроскопических грибов или дрожжей, иммобилизована на поверхности стабилизатора - твердого носителя, в качестве которого используют алюмосиликатный носитель в виде пеноматериала, гранул, сотовых монолитов или пеноматериал из нержавеющей стали, или углеродсодержащий материал в виде гранул, сотовых монолитов или волокнистого слоя из углеродных нитей с заданной площадью удельной поверхности и содержанием углерода не менее 0,1 мас.% (RU 2224020, 2003).

Основными недостатками этого технического решения являются трудности, связанные с изготовлением носителя, которое предусматривает, например, осаждение двухвалентного соединения никеля на ячеистый алюмосиликатный пеноматериал, его восстановление в токе водорода до металлического никеля, а затем проведение процесса каталитического пиролиза пропан-бутановой смеси до образования каталитического волокнистого углерода. Сложным является также процесс иммобилизации на стабилизаторе растворимой инвертазы, который проводится в статическом режиме в течение суток при перемешивании, после чего следует процесс промывания биокатализатора.

Известно изобретение «Биокатализатор для инверсии сахарозы, носитель для биокатализатора, способ приготовления биокатализатора и способ инверсии сахарозы», в котором вместо фермента инвертазы используют дрожжевые мембраны с инвертазной активностью не менее 15 ЕА/мг, которые иммобилизуют на гранулированном углеродсодержащем носителе, изготовленном на основе сапропелей и имеющим макропористую структуру со средним диаметром пор 1-2 мкм, объемом пор 1.0-1.6 см³/г и площадью удельной поверхности не менее 80 м²/г (RU 22794751, 2006).

Основным недостатком технического решения является использование сложного и многоступенчатого процесса приготовления стабилизатора-носителя, включающего изготовление гранул, их сушку, карбонизацию и газификацию во вращающемся реакторе при 600°С с последующей активацией при 800°С в атмосфере водяного пара.

Известен биокатализатор, состоящий из глюкоамилазы, иммобилизованной на активированном угле, и способ его приготовления (US Patent № 4289853, 1981).

Основным недостатком этого технического решения является сложный многоступенчатый способ изготовления стабилизатора - активированного угля с площадью удельной поверхности 600-1000 м²/г, включающий модификацию поверхности угля обработкой концентрированными кислотами, в основной азотной, последующую выдержку в растворе бифункционального сшивающего агента, затем контактирование с раствором глюкоамилазы. В результате образуется только 10-30% пор, пригодных для размещения молекул фермента и предложенный биокатализатор имеет недостаточно высокие ферментативную активность и стабильность, сохраняя 80% первоначальной активности при хранении в течение месяца при 30°С.

Известно изобретение «Биокатализатор для осахаривания крахмала, способ его приготовления, твердый носитель для иммобилизации глюкоамилазы и способ осахаривания крахмала», в котором фермент глюкоамилаза иммобилизован на твердом носителе - зауглероженном алюмосиликате с углеродным покрытием не менее 1.5 мас.% углерода, при этом носитель имеет площадь удельной поверхности не менее 2 м²/г (RU 2167197, 2001).

Основным недостатком этого технического решения является сложный способ изготовления стабилизатора-носителя на основе зауглероженного алюмосиликата, включающий прокаливание при 900°С, нанесение соединений никеля, восстановление и зауглероживание носителя в процессе пиролиза пропан-бутановой смеси с целью получения структуры из большого числа мезопор заданного размера, в которых должны располагаться молекулы фермента глюкоамилазы. Кроме того, биокаталитическая активность материала, изготовленного в соответствии с предложенным техническим решением, низка, так как использование носителя в виде пеноматериала или сотовых изделий в реакторе с неподвижным слоем катализатора создает застойные зоны, снижающие эффективность катализатора.

Известно изобретение «Биокатализатор для осахаривания декстрина, способ его приготовления и способ осахаривания декстрина», в котором фермент глюкоамилаза иммобилизован на твердом гранулированном углеродном носителе, приготовленном из сажи и обладающим мезопористой структурой со средним размером пор 100-400 Å и объемом пор 0.7-0.9 см ³/г (RU 2281328, 2006).

Основным недостатком этого технического решения является сложный процесс изготовления стабилизатора, включающий высокотемпературную карбонизацию и газификацию технического углерода - сажи с последующей активацией водяным паром.

В последние годы в качестве стабилизаторов-носителей для иммобилизации ферментов используют наночастицы, в том числе магнитные. Наночастицы являются практически идеальным средством оптимизации структуры для иммобилизации ферментов, так как они обладают минимальными диффузионными ограничениями и максимальной площадью поверхности на единицу массы, что резко увеличивает возможность нагружения ферментами.

Известен способ иммобилизации алкалинфосфатазы на стабилизаторе - наночастицах оксида железа (Fe₂O₃) со средним размеров 40 нм в результате карбодиимидной модификации. Ферментативный препарат проявил более высокую стабильность в течение 16 недель, однако его каталитическая активность составила всего 20-40% от исходного уровня (Z.M.Saiyed, S.Sharma, R.Godawat et al. Activity and stability of alkaline phosphatase (ALP) immobilized onto magnetic nanoparticles (Fe₂O₃). Journal of Biotechnology, 131 (2007), pp.240-244).

Известен способ повышения активности фермента глюкозооксидазы путем его иммобилизации различными методами на стабилизаторе - наноразмерных (9÷13 нм) частицах оксида железа Fe₃O₄ , полученных термическим соосаждением. В результате свободный фермент сохранял биокаталитическую активность в течение малого времени 20 дней (контроль), после активации наночастицами путем ацетилирования - 28 дней, а путем карбоимидирования - 33 дня (Gilles К.Konasci, Joseph Irudayaraj, Gregory McCarty Activity of glucose oxidase functionalized onto magnetic nanoparticles. Biomagnetic Research and Technology 2005, 3:1: http://www.biomagres.com/content/3/1/1).

Подобные результаты получены также для холестеролоксидазы, иммобилизованной на наноразмерных частицах Fe₃O ₄. Свободная холестеролоксидаза через 15 дней хранения теряла свою биокаталитическую активность, а связанная с наночастицами сохраняла в эти сроки 59% активности, а через 30 дней 27% активности, что недостаточно (G.K.Konassi, J.Irudayaraj, G.McCarty. Examination of Cholesterol oxidase attachment to magnetic nanoparticles. Journal of Nanobiotechology, 2005, 3:1).

Известен способ иммобилизации липазы дрожжей путем глуторальной сшивки на стабилизаторе - магнитных наночастицах -Fe₂O₃, средний размер которых составляет 20±10 нм (Ansil Dyal, Katja Loos, Mayumi Noto et al. Activity of Candida Rugosa Lipase Immobilized on -Fe₂O₃ Magnetic Nanoparticles / Journal of the American Chemical Society. 2003, v.125 (7), pp.1684-1685).

Основной недостаток стабилизатора состоит в том, что в результате иммобилизации липаза существенно снижает свою ферментативную активность.

Известен стабилизатор липазы - магнитные наночастицы Fe₃O₄ со средним диаметром 12.7 нм, при использовании которых активность липазы сохраняется на постоянном уровне в течение 42 суток, в то время как в контроле активность фермента исчезает через 13 дней (Shih-Hung Huang, Min-Hung Liao, Dong-Hwang Chen. Direct Binding and Characterization of lipase onto Magnetic Nanoparticles. Biotechnol. Prog. 2003, v.19, pp.1096-1100).

Основной недостаток стабилизатора - малые сроки сохранения активности, составляющие по нашим данным примерно 20 суток.

Известен способ сохранения ферментативной активности, использующий в качестве стабилизатора наноразмерные (31 нм) полиакриламидные частицы, содержащие пероксидазу хрена и флуоресцентный краситель. Однако при этом фермент сохраняет всего 15% своей активности, что является существенным недостатком стабилизатора (Alan К. Poulsen, Anne Marie Sharff-Poulsen, Lars F. Olsen, Horseradish peroxidase embedded in Polyacrylamide nanoparticles enables detection of reactive oxygen species / Analytical Biochemistry 366 (2007) 29-36.

Известен стабилизатор-матрица из гидратированных наночастиц оксида кремния (Silica) со средним размером 31 нм, иммобилизующий внутри себя фермент пероксидазу хрена (Т.К.Jain, I.Roy, Т.К.De, A.Maitra, Nanometer Silica Particles Encapsulating Active Compounds. A Novel Ceramic Drug Carrier, J.Am. Chem. Soc, 1998, 120 (43), 11092-11095). К сожалению, данные об активности фермента приведены за очень короткое время, равное 15 минутам.

Наиболее близким техническим решением является способ иммобилизации, при котором пероксидаза хрена инкапсулирована стабилизатором - наночастицами золота (R.Kumar, A.N.Maitra, P.K.Patanjali, P.Sharma. Hollow gold nanoparticles encapsulating peroxidase. Biomaterials 26 (2005), 6743-6753). Основными недостатками стабилизатора являются малая величина биокаталитической активности (10%), которую сохраняет фермент, и высокая цена наночастиц из золота.

Целью настоящего изобретения является стабилизация ферментативной активности пероксидазы, а именно увеличение сроков сохранения повышенной биокаталитической активности при заданной намагниченности, в частности, необходимой для магнитного осаждения.

Поставленная цель достигается использованием в качестве стабилизатора ферментативной активности пероксидазы магнитоуправляемых наноразмерных частиц кубической кобальтовой феррошпинели, компоненты которой изменяются в интервале Со_0,7±0,05Fe_2,3±0,05 O₄÷Co_1±0,05Fe_2±0,05 O₄, суспендированные в натрий-фосфатном буферном растворе в концентрации 0.01-10 мг/мл.

Для получения наноразмерных частиц кобальтовой феррошпинели используют реакцию:

В качестве исходных материалов для синтеза применяют реактивы марок Ч, ХЧ и ЧДА. Все они, за исключением карбоната натрия, являются кристаллогидратами. С целью предотвращения нагрева смеси реагентов (см. р.) и агрегации наночастиц дополнительно вводят инертный компонент - хлорид натрия - в соотношениях m _см.р..:m_NaCl=1:1; 1:2, 1:4 и 1:5. Полученную смесь герметизируют в закаленных стальных барабанах со стальными шарами диаметром 5 мм. Механохимический синтез проводят в планетарной мельнице МПВ (ускорение 60 g) при соотношении масс порошка и шаров m_n:m_m=1:20 в течение различного времени (t=5÷60 мин). Полученный продукт промывают на фильтре дистиллированной водой до полного удаления солей и высушивают при комнатной температуре, после чего обрабатывают ультразвуком и центрифугируют (УЗДН-2Т и «Bekman J2-21»).

Фазовый состав, морфологию, дисперсность и параметры структуры наноразмерных порошков определяют с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА, установка «Schimadzu XRD-6000», CuK -излучение) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ, прибор ЭМ-125), площадь удельной поверхности (S) - методом тепловой десорбции азота («СОРБИ N 4.1»), химический состав - методом рентгеновского флуоресцентного анализа (РФА, установка «Schimadzu XRF-1800»). Данные рентгеноструктурного анализа обрабатывают, используя программу полнопрофильного анализа POWDER CELL 2,5. Из значений площади удельной поверхности и плотности частиц рассчитывают их средний диаметр.

При исследовании магнитных свойств синтезированной феррошпинели кобальта используют методы анализа температурных зависимостей начальной магнитной проницаемости на частоте 10 кГц, а также кривых намагничивания и их производных, полученных в импульсных магнитных полях напряженностью до 3 Тл по методике, аналогичной описанной В.Ю.Креслиным и Е.П.Найденым (ПТЭ. 2001. № 5. С.63).

Исследование конечных продуктов механохимического синтеза показывает, что порошок кобальтовой феррошпинели состоит из наноразмерных сферических частиц со средним диаметром 9.2 нм. Конечный продукт содержит 96-99 об.% феррошпинели кобальта кубической сингонии и небольшое количество аморфной фазы. Площадь удельной поверхности порошка кобальтовой феррошпинели равна 113 м²/г.

Химический состав порошка феррошпинели кобальта при соотношении массы смеси реагентов и массы инертного компонента, равном 1:2, установленный методом рентгенофлуоресцентного анализа, заметно отличается от стехиометрического, и его химическая формула может быть представлена в виде Со _0,7±0,05Fe_2,3±0,05O₄. Увеличение содержания инертного разбавителя в два раза приводит к получению порошков практически стехиометрического состава (Co_1±0,05 Fe_2±0,05O₄). Присутствие примесей марганца (~0,14 ат.%) и хрома (0.22-0.38 ат%) вызвано в основном намолом материала мелющих тел - шаров из стали ШХ15. Магнитоуправляемость наноразмерных порошков определяется магнитными свойствами частиц кобальтовой феррошпинели, удельная намагниченность которых в зависимости от состава равна 20-22 Гс·см³/г.

Суспензию частиц нанопорошков феррита кобальта в натрий-фосфатном буфере (рН=7.0) получают методом ультразвуковой дезинтеграции (Bandelin HD2070). К суспензии наночастиц (1 мг/мл) добавляют раствор пероксидазы хрена («Merck», Германия) до конечной концентрации 1 мкМ и инкубируют в течение 24 часов на роторе (Multi RS - 60) при 25°С.

Ферментативную активность определяют по окислению орто-фенилендиамина (1,2-фенилендиамин) перекисью водорода в присутствии пероксидазы хрена (Т.М.Hamilton, A.A.Dobie-Galuska, S.M.Wietstock. The O-Phenylenediamine - Horseradish Peroxidase System: Enzyme Kinetics in the General Chemistry Laboratory // Journal of Chemical Education, vol.76, № 5, May 1999; M. Диксон, Э.Уэбб. Ферменты. Пер. с англ. - М.: Мир, 1982. - Т.1. - 392 с). Реакцию проводят при 25°С в 20 мМ натрий-цитратном буфере (рН 5.0). Удельную активность фермента выражают в мкМ/мин продукта на 1 мг фермента.

Для исследования возможных модифицирующих эффектов наночастиц кобальтовой феррошпинели на каталитические свойства пероксидазы хрена измеряют удельную активность при изменении рН среды реакции в интервале от 3.0 до 9.0.

Для исследования изменения активности фермента при хранении исследуемые пробы пероксидазы хранят в термостате при 37°С в течении 255 суток.

Количественное соотношение компонентов в кобальтовой феррошпинели определяется известными условиями механохимического синтеза, изложенными выше. При понижении степени разбавления хлоридом натрия менее 1:2 образуется многофазный продукт, кроме кобальтовой феррошпинели образуется фаза -FeOOH и другие, состав и свойства такого продукта сложно контролировать. При повышении степени разбавления хлоридом натрия более 1:4 состав кобальтовой шпинели соответствует Co_1±0,05 Fe_2±0,05O₄, но существенно снижается выход целевого продукта, что невыгодно.

Для оценки влияния наночастиц кобальтовой феррошпинели на остаточную удельную активность фермента наночастицы вводят в буферный раствор в заданной концентрации и определяют удельную ферментативную активность после хранения в течение различного времени по сравнению с контролем. Измерения удельной активности пероксидазы в присутствии ферримагнитных частиц в интервале рН реакционного буфера 3.0-9.0 показывают, что рН-оптимум реакции окисления орто-фенилендиамина пероксидазой хрена находится при значении рН=5.0 и не сдвигается в присутствии ферримагнитных частиц. Сдвиг рН реакционной среды от оптимального значения в кислую или щелочную область приводит к значительному снижению удельной активности пероксидазы хрена, как в опытной, так и контрольной группах. Поэтому в дальнейшем все измерения удельной активности пероксидазы проводят при рН=5.0.

Концентрационные границы содержания наноразмерных частиц кобальтовой феррошпинели в буферном растворе определяются следующими соображениями. При содержании наночастиц, равном 0.01 мг/мл, заметное отличие от контроля, в качестве которого выбран буферный раствор с ферментом без наночастиц, наблюдается примерно на 43 сутки (табл.1) При такой продолжительности испытания контроль практически полностью теряет свою ферментативную активность, а раствор с наночастицами сохраняет 22% ферментативной активности вплоть до 69 суток, после чего эксперимент прекращают. Такой же результат был получен при содержании наночастиц в буферном растворе, равном 10 мг/мл (табл.1). Снижение и повышение концентрации наночастиц в растворе до 0.005 мг/мл и 12 мг/мл соответственно существенно не изменяет эти результаты (табл.1), поэтому значения 0.01 и 10 мг/мл были приняты за граничные концентрации.

Поскольку концентрация наночастиц кобальтовой шпинели в буферном растворе, равная 1 мг/мл, является оптимальной и позволяет ферменту сохранить высокую активность через 69 суток, оценку максимальных сроков сохранения активности проводят при указанной концентрации, а измерения удельной ферментативной активности проводят вплоть до 255 суток.

Установлено, что остаточная удельная активность фермента при хранении в течение 105-255 суток составляет примерно 40-42% и не имеет тенденции к снижению (табл.2). При этом в контроле фермент теряет свою активность на 43 сутки (табл.2).

Использование кобальтовой феррошпинели в выбранных экспериментальным путем границах содержания основных элементов и ее концентрации в буферном растворе обеспечивает достаточно высокий уровень стабилизации ферментативной активности пероксидазы и сроки хранения, существенно превышающие таковые для свободной периксидазы и пероксидазы с наночастицами золота.

Таблица 1
Влияние концентраций наночастиц Co0,7±0,05Fe 2,3±0,05O4 на стабильность пероксидазы хрена при хранении при 37°С
Концентрация Co0,7±0,05Fe2,3±0,05 O4, мг/мл	Остаточная удельная активность фермента при хранении, %
	Количество суток
	1 сутки	12 суток	25 сутки	43 сутки	69 сутки
12	75	72	72	48	20
10	80	75	76	51	22
1	90	93	93	78	60
0.1	91	84	67	33	32
0.01	93	72	40	22	22
0.005	96	80	63	10	0
0 (контроль)	100	83	66	3	0

Таблица 2
Влияние наночастиц кобальтовой феррошпинели на ферментативную активность пероксидазы хрена при хранении (Т=37°С, концентрация в буферном растворе 1 мг/мл)
Сорт наночастиц	Остаточная удельная активность фермента при хранении, %
Количество суток
1	12	15	23	25	38	43	48	59	69	71	83	107	182	210	226	255
Co 0,7±0,05Fe2,3±0,05O4	90	93	94	94	93	80	78	73	69	60	56	51	42	43	42	42	40
Co1±0,05 Fe2±0,05O4	92	93	94	93	93	81	76	74	71	58	56	52	43	44	43	42	42
Контроль	100	90	79	71		22		0	0		0	0	0