биокатализатор для получения инвертного сахара и способ получения инвертного сахара

Формула изобретения

1. Биокатализатор для получения инвертного сахара инверсией сахарозы, включающий фермент инвертазу и твердый носитель, на поверхности которого иммобилизована инвертаза, отличающийся тем, что носителем является неорганический носитель, на поверхности которого синтезирован слой волокнистого углерода, при этом содержание углерода составляет не менее 0,1 мас.%.

2. Биокатализатор по п.1, отличающийся тем, что в качестве неорганического носителя используют алюмосиликатный носитель с удельной поверхностью не менее 0,1 м²/г.

3. Биокатализатор по пп.1 и 2, отличающийся тем, что носитель выполнен в форме гранул.

4. Биокатализатор по пп.1 и 2, отличающийся тем, что носитель выполнен в форме сотовых монолитов.

5. Биокатализатор по пп.1 и 2, отличающийся тем, что носитель выполнен в форме пеноматериала.

6. Биокатализатор по п.1, отличающийся тем, что в качестве неорганического носителя используют материал из нержавеющей стали в виде пеноматериала.

7. Биокатализатор по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что инвертазой является фермент, выделенный из микроскопических грибов Aspergillus oryzae с величиной активности не менее 5 ЕА/мг белка.

8. Биокатализатор по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что инвертазой является фермент, выделенный из пекарских дрожжей Sac.cerevisiae с величиной активности не менее 170 ЕА/мг белка.

9. Способ получения инвертного сахара инверсией сахарозы в присутствии биокатализатора, включающего фермент инвертазу и твердый носитель, отличающийся тем, что используют биокатализатор по любому из пп.1-8.

10. Способ получения инвертного сахара инверсией сахарозы по п.9, отличающийся тем, что процесс проводят в непрерывном режиме в реакторе проточного типа.

11. Способ получения инвертного сахара инверсией сахарозы по пп.9 и 10, отличающийся тем, что процесс проводят при температуре не ниже 50С.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биокатализаторам, способам их приготовления и способам получения инвертного сахара инверсией сахарозы и может быть использовано в пищевой промышленности для производства кондитерских изделий и напитков.

Известно, что процесс инверсии сахарозы (тростникового сахара), молекула которой состоит из фрагментов глюкозы и фруктозы, осуществляется ферментом инвертазой. Этот фермент выделяют из дрожжей, микроскопических грибов и бактерий. Как отмечалось выше, инвертный сахар применяют, в основном, в кондитерской промышленности, при этом существенно замедляется высыхание и затвердевание кондитерской продукции (конфет, начинок для конфет, пастилок, вафель). Использование инвертазы в иммобилизованном состоянии является перспективным способом получения инвертного сахарного сиропа в промышленном масштабе, поскольку процесс осуществляется в непрерывном режиме при многократном использовании стабилизированного фермента, при этом чистота и качество сиропа заметно повышаются.

Известны способы приготовления биокатализаторов путем включения инвертазы в структуру органического геля, например в капсулы альгинатного геля [Aziz Tanriseven, Senay Dogan. Immobilization of imvertase within calcium alginate gel capsules. Process Biochemistry 36 (2001) 1081-1083]. Биокатализатор характеризуется относительно высокой стабильностью: за 36 суток активность сохранилась на прежнем уровне. Биокатализатор, приготовленный путем включения инвертазы в полиакриламидный гель, также обладал высокой стабильностью: за 450 суток непрерывной работы при 30^oС активность инвертазы уменьшилась на 10% [Креэн М.И., Кестнер А.И., Каск К.А. Применение связанной инвертазы для гидролиза сахаразы. Труды ТПИ, Сер. А., 1973. 331. С. 131-140. ] Последний из описанных способ получения биокатализатора и полученный биокатализатор были положены в основу создания пилотной установки с реактором объемом 50 л. Были проведены полупромышленные испытания на кондитерской фабрике и заводе безалкогольных напитков. Результаты этих испытаний, положенные в основу экономического анализа, показали перспективность и целесообразность промышленного внедрения разработанной технологии (Введение в прикладную энзимологию, 1982, с.375).

Существенным недостатком известных способов является применение дорогостоящих и труднодоступных в больших количествах органических гелевых матриц, а также плохие гидродинамические характеристики слоя биокатализатора при длительном использования в проточных реакторах: при высоких концентрациях сахарозы гидравлическое сопротивление в слое биокатализатора резко возрастает, что ведет к уплотнению слоя и деформации гранул биокатализатора.

Известен способ приготовления биокатализаторов иммобилизацией ферментов, в том числе инвертазы на гранулированном активированном угле, покрытом полиаминами, путем ковалентного связывания ферментов с поверхностью носителя при помощи многофункциональных сшивающих реагентов (Патент США 4438196, С 12 Р 019/20, C 12 N 011/02, C 12 N 011/08, C 12 N 011/066, 20.03.1984).

Однако данный способ является многостадийным, сложным и достаточно трудоемким.

Известны также различные биокатализаторы, приготовленные иммобилизацией инвертазы на неорганических глинистых носителях (каолин, бентонит) путем адсорбции (Патент Франции 2020527, 1970). Поскольку адсорбция является самым простым и технологичным способом приготовления биокатализаторов, то приготовление эффективных адсорбентов для инвертазы является актуальной проблемой.

Наиболее близким является биокатализатор и способ его получения, описанный в патенте (Патент России 2158761, C 12 N 11/00, 10.11.2000). Этот способ заключается в том, что для приготовления биокатализатора используют не индивидуальный фермент, а изолированные стенки дрожжевых клеток, полученные в результате автолиза дрожжей и обладающие инвертазной активностью величиной 7-11 ЕА/мг дрожжевых клеточных стенок (1 единица активности (ЕА) выражается в мкмолях образовавшейся глюкозы за 1 мин при указанной температуре). Иммобилизацию клеточных стенок осуществляют либо путем адсорбции на целлюлозе, либо включением в поливиниловые нити механической смеси клеточных стенок с бентонитом. Активность полученных в прототипе биокатализаторов составляет 12-98 ЕА/г биокатализатора; удельная активность биологически активной субстанции - стенок дрожжевых клеток - 0,024-0,15 ЕА/мг. Потеря половины первоначальной активности биокатализатора, которая характеризуется временем полуинактивации (t_1/2), происходит в течение 6-45 суток в процессе инверсии 75%-ного сахарного сиропа при 55^oС. Конверсия (степень превращения) сахарозы достигает 80%. Наилучшие результаты по активности и стабильности биокалализатора получены в условиях непрерывной инверсии 75%-ного сахарного сиропа при 55^oС в колоночном реакторе, заполненном нитевидным биокатализатором, при скорости подачи субстрата в реактор 7 л/ч (117 мл/мин), однако степень инверсии сахарозы не превышает 60%.

Изобретение решает задачу увеличения активности и стабильности биокатализатора инверсии сахарозы, а также упрощения способа его приготовления.

Поставленная задача решается тем, что предлагается биокатализатор для инверсии сахарозы, включающий инвертазу в виде ферментного препарата, выделенного как из микроскопических грибов Aspergillus oryzae, так и из автолизированных пекарских дрожжей Sacharomyces cerevisiae, и твердый носитель, на поверхности которого иммобилизована инвертаза. Носителем является неорганический носитель, на поверхности которого синтезирован слой волокнистого углерода с содержанием углерода не менее 0,1 мас.%.

В качестве неорганического твердого носителя используют алюмосиликатный носитель, выполненный в виде гранул, сотовых монолитов, пеноматериала, или материал из нержавеющей стали в виде пеноматериала, или углеродсодержащий материал в виде гранул или сотовых монолитов с удельной поверхностью не менее 0,1 м²/г.

Задача решается также способом приготовления биокатализатора для инверсии сахарозы путем адсорбции инвертазы на поверхности твердого углеродсодержащего носителя. При этом содержание углерода на поверхности носителя составляет не менее 0,1 мас.%, и носитель выполнен в виде гранул, сотовых монолитов, пеноматериала.

Задача решается также использованием для иммобилизации твердого неорганического углеродсодержащего носителя. В качестве неорганического твердого носителя используют алюмосиликатный носитель, выполненный в виде гранул, сотовых монолитов, пеноматериала, или материал из нержавеющей стали в виде пеноматериала или углеродсодержащий материал в виде гранул или сотовых монолитов с удельной поверхностью не менее 0,1 м²/г, на поверхности которого синтезирован углеродный слой величиной не менее 0,1 мас.%. Этот углеродный слой имеет морфологию волокнистого углерода и образован сплетенными углеродными нитями различной толщины и длины.

В зависимости от метода синтеза в структуре углеродного слоя преобладают либо мезопоры до 1000А, либо макропоры выше 1 мкм.

Было показано, что синтез слоя волокнистого углерода на поверхности носителей алюмосиликатной природы существенно улучшает их адсорбционные свойства по отношению к биологически активным субстанциям, в том числе к ферментам. В предлагаемом изобретении для приготовления адсорбента инвертазы в качестве основы используют неорганический носитель с удельной поверхностью не менее 0,1 м²/г, выполненный в форме гранул, сотовых монолитов, пенистых материалов. На поверхность этого носителя методом осаждения наносят соединения никеля(2+), которые восстанавливают в токе водорода до частиц металлического никеля, затем проводят пиролиз пропан-бутановой смеси, в результате чего на поверхности носителя образуется слой волокнистого углерода. При этом удельная поверхность носителя (в м²/г адсорбента) возрастает в десятки раз. Это происходит за счет того, что в структуре образовавшегося на поверхности углеродного слоя имеется большое количество мезопор. Именно в таких порах, подходящих по размеру для ферментов, происходит более прочная (относительно известных носителей) адсорбция ферментов и стабилизации структуры их молекул.

Иммобилизация инвертазы заключается в проведении процесса ее физической адсорбции на поверхности, например, путем погружения носителя в буферный раствор фермента, выдерживания его там в течение необходимого времени при периодическом перемешивании. Следует еще раз отметить, что адсорбционная иммобилизация ферментов на твердом носителе - наиболее простой способ получения биокатализаторов. При этом активность фермента сохраняется на высоком уровне, так как с данном способе отсутствуют токсические сшивающие реагенты, которые могут оказывать дезактивирующее действие на ферментативную активность. Кроме того, адсорбция на носителе с соответствующими по размеру порами обеспечивает прочное связывание фермента на поверхности и высокую стабильность приготовленного биокатализатора.

Задача решается также способом инверсии сахарозы в присутствии биокатализатора, включающего инвертазу и твердый носитель, при этом используют биокатализатор, в котором инвертаза иммобилизована путем адсорбции на поверхности углеродсодержащих адсорбентов.

Процесс проводят в непрерывном режиме с использованием реактора проточного типа. Процесс инверсии сахарозы проводят при температуре 25-50^oС.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для приготовления биокатализатора в качестве твердого носителя используют углеродсодержащий алюмосиликат, содержащий 3,3 мас.% углерода, с макроструктурой пенокерамики, на котором путем адсорбции проводят иммобилизацию инвертазы, выделенной из микроскопических грибов Aspergilus oryzae. С помощью полученного биокатализатора проводят процесс инверсии 25%-ного сахарного сиропа при 25-50^oС.

1. Стадия получения адсорбента. В качестве носителя для синтеза слоя волокнистого углерода используют алюмосиликатный пеноматериал с характерным диаметром ячейки 2 мм и удельной поверхностью 0,1 м²/г. На внешнюю поверхность данного материала методом осаждения наносят соединения никеля (2+), которые восстанавливают в токе водорода до металлического никеля, затем проводят процесс каталитического пиролиза пропан-бутановой смеси до образования слоя каталитического волокнистого углерода, при этом удельная поверхность носителя увеличивается в 97 раз и составляет 9,7 м²/г.

2. Стадия получения инвертазы. Из ферментного препарата Амилоризин П10Х в буферный раствор рН 4,6 экстрагируют суммарный белок. Затем проводят фракционирование путем осаждения белка 40-60%-ным сульфатом аммония. После диализа проводят хроматографическую очистку белкового раствора на ДЕАЕ-целлюлозе. Удельная активность растворимой инвертазы, полученной данным способом, составляет не менее 5 ЕА/мг при 50^oС.

3. Стадия приготовления биокатализатора. Процесс иммобилизации растворимой инвертазы осуществляют в статическом режиме путем адсорбции, которую проводят при 20-22^oС следующим образом: буферный раствор (0,05 М ацетатный буфер, рН 4,6) инвертазы контактирует с носителем в соотношении 10:1 (по весу) в течение 1 суток при периодическом перемешивании. Величину адсорбции определяют по разности количеств белка в растворе до и после проведения процесса адсорбции и выражают в мг белка на 1 г носителя. Полученный биокатализатор промывают 10-кратным избытком буферного раствора и используют в реакции инверсии 25%-ного раствора сахарозы при 20-50^oС.

Полученный биокатализатор имеет следующие характеристики:

- величина адсорбции инвертазы 1,9 мг белка/г адсорбента;

- удельная ферментативная активность составляет 1,2 ЕА/мг биологически активной субстанции (фермента), что в 12-83 раза превышает удельную активность в прототипе;

- активность биокатализатора 2,5 ЕА/г биокатализатора;

- стабильность: время полуинактивации t_1/2 составляет 30 суток (см. фиг. 1) при периодической работе биокатализатора при 50^oС и хранении при 20-22^oС.

4. Способ инверсии сахарозы. Процесс инверсии сахарозы проводят при 20^oС-50^oС в проточном режиме с использованием неподвижного слоя биокатализатора, через который со скоростью 7-115 мл/мин прокачивается 25%-ный сахарный сироп.

Пример 2. Для приготовления биокатализатора в качестве твердого носителя используют углеродсодержащий алюмосиликат, содержащий 3,3 мас.% углерода, с макростуктурой пенокерамики, на котором путем адсорбции проводят иммобилизацию инвертазы, выделенную из автолизированных пекарских дрожжей S.cerevisiae. С помощью полученного биокатализатора проводят непрерывный процесс инверсии сахарного сиропа при температуре 20-50^oС.

1. Способ приготовления адсорбента аналогичен примеру 1.

2. Способ получения инвертазы. Пекарские дрожжи подвергают процессу автолиза в течение 20 ч при 55^oС и рН 4,6. Отмытые клеточные стенки, полученные при автолизе, обрабатывают ультразвуком и центрифугируют. Инвертазу выделяют из надосадочной жидкости, полученной при центрифугировании, методом осаждения этанолом. Удельная активность растворимой инвертазы, полученной данным способом, составляет не менее 170 ЕА/мг при 50^oС.

3. Способ получения биокатализатора аналогичен примеру 1.

Свойства полученного биокатализатора следующие:

- величина адсорбции 4,0 мг/г носителя;

- удельная ферментативная активность составляет 4 ЕА/мг биологически активной субстанции (фермента), что в 40-287 раз превышает удельную активность в прототипе;

- активность биокатализатора 17 ЕА/г биокатализатора (в прототипе 12-98 ЕА/г биокатализатора);

- стабильность: время полуинактивации t_1/2 составляет более 120 суток (см. фиг. 1), что в ~3 раза превышает максимальную стабильность в прототипе (в прототипе максимальная стабильность характеризуется временем полуинактивации 45 дней).

4. Способ инверсии сахарозы аналогичен примеру 1.

Пример 3. Для приготовления биокатализатора в качестве твердого носителя используют углеродсодержащий алюмосиликат, содержащий 6,5 мас.% углерода, в виде сотового монолита, на котором путем адсорбции проводят иммобилизацию инвертазы, выделенной из автолизированных пекарских дрожжей S.cerevisiae. Процесс инверсии 25%-ного сахарного сиропа проводят при 20-50^oС.

1. Способ приготовления адсорбента. В качестве носителя для синтеза слоя волокнистого углерода используют алюмосиликатные блочные носители с макроструктурой сотового монолита с характерными размерами - диаметром 19,5 мм; длиной 20 мм. Носитель имеет 52 канала квадратного сечения 1,9х1,9 мм с толщиной внутренних перегородок 0,5 мм. Удельная поверхность носителя составляет 24 м²/г. Способ синтеза слоя каталитического волокнистого углерода на поверхности алюмосиликатного сотового монолита аналогичен описанному в примере 1. Удельная поверхность адсорбента увеличивается в 2,4 раза и составляет 57 м²/г.

2. Способ получения инвертазы аналогичен примеру 2.

3. Способ получения биокатализатора. Процесс иммобилизации растворимой инвертазы осуществляют в динамических условиях путем адсорбции, которую проводят при 20-22^oС при медленной циркуляции со скоростью 7 мл/мин буферного раствора (0,05 М ацетатный буфер, рН 4,6) инвертазы через сотовый монолит в течение 18-20 ч. Величину адсорбции определяют аналогично описанному в примере 1. Полученный биокатализатор промывают 3-кратным избытком буферного раствора и используют в реакции инверсии 25%-ного раствора сахарозы при 20-50^oС.

Свойства полученного биокатализатора следующие:

- величина адсорбции 0,2 мг/г,

- удельная ферментативная активность составляет 47 ЕА/мг белка, что на 3 порядка превышает удельную активность в прототипе;

- активность биокатализатора 9 ЕА/г биокатализатора;

- стабильность: время полуинактивации t_1/2 составляет 21 день при периодической работе биокатализатора при 50^oС и хранении при 20-22^oС.

4. Способ инверсии сахарозы аналогичен примеру 1.

Пример 4. Для приготовления биокатализатора в качестве твердого носителя используют углеродсодержащий алюмосиликат, содержащий 0,4 мас.% углерода, в виде сотового монолита, на котором путем адсорбции проводят иммобилизацию инвертазы, выделенной из автолизированных пекарских дрожжей S.cerevisiae. Процесс инверсии 25%-ного сахарного сиропа проводят при 20-50^oС.

1. Способ приготовления адсорбента. В качестве носителя для синтеза слоя волокнистого углерода используют алюмосиликатные блоки с макроструктурой сотового монолита диаметром 9,2 мм и длиной 1,5 мм. Носитель имеет 37 каналов квадратного сечения размером 0,8х0,8 мм с толщиной внутренних перегородок 0,4 мм. Удельная поверхность носителя составляет 0,2 м²/г. Способ синтеза слоя каталитического волокнистого углерода на поверхности данного носителя аналогичен описанному в примере 1. Удельная поверхность адсорбента увеличивается в 10 раз и составляет 2,0 м²/г.

2. Способ получения инвертазы аналогичен примеру 2.

3. Способ получения биокатализатора аналогичен примеру 1.

Свойства полученного биокатализатора следующие:

- величина адсорбции 0,06 мг/г,

- удельная ферментативная активность составляет 100 ЕА/мг белка, что на 3 порядка превышает удельную активность в прототипе;

- активность биокатализатора 6 ЕА/г биокатализатора;

- стабильность: время полуинактивации t_1/2 составляет 21 день при периодической работе биокатализатора при 50^oС и хранении при 20-22^oС.

4. Способ инверсии сахарозы аналогичен примеру 1.

Пример 5. Для приготовления биокатализатора в качестве твердого носителя используют углеродсодержащий алюмосиликат, содержащий 2,6 мас.% углерода, в виде гранул, на котором путем адсорбции проводят иммобилизацию инвертазы, выделенной из автолизированных пекарских дрожжей S.cerevisiae. Процесс инверсии 25%-ного сахарного сиропа проводят при 20-50^oС.

1. Способ приготовления адсорбента. В качестве носителя для синтеза поверхностного слоя волокнистого углерода используют алюмосиликатные гранулы размером 0,5-1 мм. Удельная поверхность носителя составляет 0,1 м²/г. Способ синтеза слоя каталитического волокнистого углерода аналогичен описанному в примере 1. Удельная поверхность адсорбента увеличивается в 34 раза и составляет 3,4 м²/г.

2. Способ получения инвертазы аналогичен примеру 2.

3. Способ получения биокатализатора аналогичен примеру 1.

Свойства полученного биокатализатора следующие:

- величина адсорбции 0,08 мг/г адсорбента;

- удельная ферментативная активность составляет 380 ЕА/мг белка, что на 4 порядка превышает удельную активность в прототипе;

- активность биокатализатора 50 ЕА/г биокатализатора (в прототипе 12-98 ЕА/г биокатализатора);

- стабильность: биокатализатор полностью сохраняет активность через 30 дней хранения.

4. Способ инверсии сахарозы аналогичен примеру 1.

Пример 6. Для приготовления биокатализатора в качестве твердого носителя используют углеродсодержащий алюмосиликат, содержащий 8,0 мас.% углерода, с макроструктурой ячеистого материала (пенокерамики), на котором путем адсорбции проводят иммобилизацию инвертазы, выделенной из автолизированных пекарских дрожжей S. cerevisiae. Процесс инверсии 25%-ного сахарного сиропа проводят при 20-50^oС.

1. Способ приготовления адсорбента. В качестве носителя для синтеза слоя волокнистого углерода используют алюмосиликатный материал с ячеистой макроструктурой (диаметр ячейки 2 мм; толщина стенки 1 мм), на внешней поверхности которого предварительно уже синтезирован слой КВУ толщиной более 1 мкм (содержание углерода на носителе при этом составило 3,0 мас.%). Удельная поверхность такого носителя составляет 12,0 м²/г. На углеродную поверхность этого носителя методом осаждения наносят соединения никеля (2+), которые восстанавливают в токе водорода до металлического никеля, затем проводят процесс каталитического пиролиза пропанбутановой смеси способом, описанным в примере 1, до образования дополнительного, еще одного слоя каталитического волокнистого углерода. При этом содержание углерода на носителе увеличивается на 5,0 мас.% и составляет суммарно 8 мас.%. Удельная поверхность адсорбента увеличивается в 2 раза и достигает 25 м²/г.

2. Способ получения инвертазы аналогичен примеру 2.

3. Способ получения биокатализатора аналогичен примеру 1.

Свойства полученного биокатализатора следующие:

- величина адсорбции 0,26 мг/г адсорбента;

- удельная ферментативная активность составляет 271 ЕА/мг белка, что на 4 порядка превышает удельную активность в прототипе;

- активность биокатализатора 70,5 ЕА/г биокатализатора (в прототипе 12-98 ЕА/г биокатализатора);

- стабильность: биокатализатор полностью сохраняет активность в течение 7 дней хранения при 18-20^oС.

4. Способ инверсии сахарозы аналогичен примеру 1.

Пример 7. Для приготовления биокатализатора в качестве твердого носителя используют углеродсодержащий металл, содержащий 39,3 мас. % углерода, с макроструктурой пенокерамики, на котором путем адсорбции проводят иммобилизацию инвертазы, выделенной из автолизированных пекарских дрожжей S.cerevisiae. Процесс инверсии 25%-ного сахарного сиропа проводят при 20-50^oС.

1. Способ приготовления адсорбента. В качестве носителя для синтеза слоя волокнистого углерода используют материал из нержавеющей стали с ячеистой макроструктурой с характерным диаметром ячейки 0,7 мм и толщиной стенки 0,1-0,2 мм. На металлическую поверхность данного материала методом осаждения наносят соединения никеля (2+). Способ синтеза слоя каталитического волокнистого углерода аналогичен описанному в примере 1.

2. Способ получения инвертазы аналогичен примеру 2.

3. Способ получения биокатализатора аналогичен примеру 1.

Свойства полученного биокатализатора следующие:

- величина адсорбции 1,5 мг/г адсорбента;

- удельная ферментативная активность составляет 2,5 ЕА/мг белка, что на порядок превышает удельную активность в прототипе;

- активность биокатализатора 3,8 ЕА/г биокатализатора;

- стабильность: биокатализатор полностью сохраняет активность через 7 дней хранения при 18-20^oС.

4. Способ инверсии сахарозы аналогичен примеру 1.

Как видно из приведенных примеров, предложенное изобретение позволяет не только существенно упростить способ приготовления биокатализатора для процесса получения инвертного сахара, но значительно увеличить удельную активность и стабильность полученного биокатализатора, что позволяет осуществить процесс инверсии сахарозы в непрерывном режиме и сделать его экономически выгодным.