средство, увеличивающее продолжительность жизни

Формула изобретения

Применение иммобилизированной с помощью электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы в качестве средства, замедляющего процессы естественного старения организма и увеличивающего продолжительность его жизни.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и медицине, конкретно к геронтологии и фармакологии.

Существуют средства различного происхождения с разными механизмами действия, увеличивающие продолжительность жизни [1]. Эффективность данных средств в каждом конкретном случае определяется преимущественно их специфическими терапевтическими свойствами в отношении тех патологических процессов, которые напрямую либо опосредованно являются причиной смерти конкретного организма.

Недостатками данных средств является их высокая избирательность, заключающаяся во влиянии лишь на конкретные, частные, причины смерти (нарушение деятельности сердца, мозгового кровоснабжения и др.) [1, 2].

Существуют сведения литературы о средствах, замедляющих процессы естественного старения в целом [1]. Однако применение многих из них не имеет под собой объективных доказательств их эффективности и научного обоснования и не соответствует принципам доказательной медицины. Использование других - геропротекторов [1, 2] характеризуется чрезвычайно выраженной индивидуальной чувствительностью биологических объектов к этим средствам и является низкоэффективным, даже несмотря на имеющиеся теоретические предпосылки их эффективности.

Известно средство, представляющее собой иммобилизированную с помощью ионизирующего излучения (нанотехнологии электронно-лучевого синтеза) гиалуронидазу, обладающее способностью увеличивать резерв стволовых клеток в организме [3].

Нами впервые обнаружена способность иммобилизированной гиалуронидазы значительно замедлять процессы естественного старения организма и увеличивать продолжительность его жизни.

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение показаний к применению иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы.

Поставленная задача достигается применением иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы в качестве средства для замедления процессов естественного старения организма и увеличения продолжительности его жизни.

Новым в предлагаемом изобретении является применение иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы в качестве средства замедления процессов естественного старения организма и увеличения продолжительности его жизни.

Используемое нами оригинальное средство иммобилизированной с помощью электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы [3] было разработано и получено НИИ фармакологии СО РАМН (г.Томск) совместно с ООО «Саен-тифик Фьючер Менеджмент» (г.Новосибирск).

Старение организма представляет собой естественный процесс, определяемый целым рядом, в том числе неизвестных, факторов, заканчивающийся заключительным этапом индивидуального развития - гибелью биологического объекта [1]. Среди изученных факторов естественного старения живых существ можно отметить: генетически детерминированные процессы, предопределяющие возрастные особенности обмена веществ, стрессы, латентные заболевания, свободные радикалы, накопление продуктов распада белков, перекиси липидов, ксенобиотическая нагрузка (чужеродные вещества), изменение концентрации водородных ионов, температурные повреждения, кислородное голодание, разрыв лизосом с высокой активностью действия некоторых ферментов, накопление ряда других продуктов жизнедеятельности организма и др. [1]. Указанная мультифакториальность процесса старения не позволяет существенно увеличивать сроки жизни при воздействии на какое-либо ограниченное количество его патогенетических звеньев. В связи с этим значительное замедление темпа старения и увеличение продолжительности жизни сложноорганизованного биологического объекта можно ожидать лишь от средств, изменяющих состояние «живой системы» (организма) в целом.

Гиалуронидаза является ключевым ферментом, определяющим метаболизм гиалуроновой кислоты, которая представляет собой наиболее распространенный гликозаминогликан в организме: входит в состав межклеточного матрикса тканей, а также гликокаликса клеток и их рецепторов к различным биологически активным веществам [4, 5]. Известна способность препаратов данного фермента, в том числе иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы, повышать проницаемость различных тканевых барьеров для экзогенных и эндогенных веществ, оказывать лечебное действие в отношении контрактур, рубцов и др., стимулировать гемопоэз, анаболические процессы и функции стволовых клеток (СК) [3, 6, 7]. При этом последнее обстоятельство проявляется в увеличении резерва данных регенераторно-компетентных элементов в организме. Однако дальнейшая судьба этих СК, их участие в процессах клеточного самообновления, связанное с возможностью реализации ростового потенциала и регенерацией тканей в ответ на физиологическую убыль клеток, остается неизвестна, так же как и не существует сведений о возможности управления процессами естественного старения организма путем модификации свойств гиалуроновой кислоты.

Факт применения иммобилизированной гиалуронидазы (имГД) с достижением нового технического результата, заключающегося в значительном замедлении процессов естественного старения и увеличении продолжительности жизни организма, для специалиста является неочевидным.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на мышах обоего пола линии CBA/CaLac в количестве 94 штук. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН.

Критерием увеличения продолжительности жизни служило среднее значение срока наступления естественной смерти интактных животных. Для оценки процессов естественного старения использовали методы гистологического исследования различных органов и тканей организма (головной мозг, печень, сердце, почки, семенники, тимус, голеностопные суставы) и методы оценки их функционального состояния [8, 9, 10].

Пример 1

Препарат иммобилизированной гиалуронидазы вводили интактным мышам линии CBA/CaLac, начиная с 9 месяца жизни, 1 раз в месяц в дозе 10 ЕД/мышь (объем раствора составлял 0,3 мл). Контрольным животным в эквивалентном объеме (0,3 мл) вводили физиологический раствор.

Морфологическое исследование органов проводили на 16 и 20-м мес жизни экспериментальных животных. Кусочки органов фиксировали в 10%-фармалине и заливали в парафин. Депарафинизированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином [8]. Кроме того, в указанные сроки с помощью стандартных биохимических методов определяли содержание глюкозы, общего белка, холестерина и креатинина в крови [9], используя полуавтоматический биохимический анализатор «Cormay», глюкометр «Optilite» и наборы к ним. На 20 мес жизни проводили также оценку функционального состояния центральной нервной системы путем изучения условно-рефлекторной деятельности животных с помощью методики УРПИ (условного рефлекса пассивного избегания) [10]. Для этого вырабатывали условный рефлекс пассивного избегания и через 7 суток проверяли его воспроизводимость.

В ходе эксперимента первый случай смерти среди мышей, получавших физиологический раствор, отмечался на 18 мес жизни (17,2 мес), а средняя продолжительность жизни животных данной группы составила 20,2 мес.

В группе животных, которым вводили имГД, гибель началась на 23 мес жизни, а среднее значение продолжительности жизни составило 27,1 мес, что было на 34,2% выше такового в контроле (табл.1).

При этом масса тела опытных животных во все сроки исследования, начиная с 16 мес жизни, значительно превосходила таковую у контрольных мышей (табл.1).

Таблица 1
Влияние препарата иммобилизированной гиалуронидазы на продолжительность жизни и массу тела мышей линии CBA/CaLac
Возраст, мес	Контрольные мыши (физ. раствор)	Опытные мыши (имГД)
Смертность, %	Масса тела, г (X±m)	Смертность, %	Масса тела, г (X±m)
2,5	0	22,3±1,2	0	22,4±0,7
9	0	43,7±2,4	0	42,9±3,6
16	0	42,6±3,7	0	43,7±2,2
17	14	39,8±1,6	0	43,6±1,9
18	29	36,4±0,78	0	46,7±2,5*
19	43	34,1±0,9	0	42,1±2,4*
20	57	32,6±1,8	0	42,3±0,8*
21	71	30,4±3,7	12	40,6±2,7*
22	86	22,3±4,1	12	39,8±1,5*
23	100		24	38,9±0,9
24			37	39,7±1,3
25			37	38,8±1,4
26			37	36,7±0,7
27			45	35,4±0,9
28			62	33,6±0,5
29			78	34,7±1,2
30			86	31,7±2,9
31			100
* - отмечена достоверность различия показателя от его значения у контрольных животных в возрасте 20 мес при р<0,05

Исследование патоморфологической картины органов контрольных мышей в 16 мес жизни не выявило существенных структурных особенностей сердца, головного мозга и печени. При этом в семенниках, почках, суставах и тимусе отмечались признаки старения. В частности, имела место некоторая атрофия сперматогенного эпителия, резкое истончение эпифизарной пластинки роста большеберцовой кости, незначительное обызвествление эпителия проксимальных канальцев нефронов почек и выраженные признаки инволюции тимуса (дольки тимуса были либо полностью замещены жировой тканью, либо их размеры значительно уменьшены с отсутствием деления на дольковую и мозговую зоны, встречаются тельца Гассаля с явлениями ороговения). Вместе с тем в 20 мес жизни патоморфологические изменения различных органов и систем были еще в большей степени выражены. При этом отмечалось: обызествление мягкой мозговой оболочки мозга на фоне незначительной дистрофии нервных клеток; большое количество обызествленных кардиомиоцитов в сердечной мышце; выраженная атрофия сперматогенного этителия; незначительная жировая дистрофия печени; полное замещение костной тканью эпифизарных пластинок роста большеберцовых костей; воспалительная реакция вокруг очагов отложения кальция в проксимальных канальцах нефронов почек и полная инволюция тимуса.

Изучение морфологии органов у животных, получавших имГД, позволило выявить значительное замедление развития признаков их структурных изменений. В 16 мес жизни в данной группе мышей, в отличие от контрольной, не отмечалось атрофии сперматогенного эпителия, изменений нефронов, были незначительно истончены эпифизарные пластинки роста большеберцовых костей и слабо выражена возрастная инволюция тимуса (размеры долек уменьшены, но деление на дольковую и мозговую зоны сохранено). В то же время в 20 месячном возрасте у мышей данной группы имели место: атрофия сперматогенного эпителия, обызвествление проксимальных канальцев нефрона, единичные обызвествленные кардиомиоциты, более значительное истончение пластинок роста костей и инволюция тимуса. Однако указанные изменения были существенно менее выражены, чем таковые в контрольной группе, и у этих животных не наблюдалось признаков дистрофии печени.

Изучение биохимических показателей крови также выявило различия между исследуемыми группами. Так, у мышей, не получавших специфической терапии, отмечалось значительное увеличение содержания глюкозы, общего холестерина и некоторое возрастание концентрации креатинина в крови на фоне незначительного, но достоверного уменьшения количества общего белка относительно аналогичных параметров у мышей линии CBA/CaLac в возрасте 2,5 мес. Указанные изменения, по-видимому, свидетельствовали о развитии сахарного диабета, нарушении белкового и жирового обмена, а также экскреторной функции почек у мышей 20-ти месячного возраста. Вместе с тем у животных опытной группы имело место лишь некоторое повышение уровня содержания глюкозы в крови, но не достигающее статистической значимости (табл.2).

Таблица 2
Влияние препарата иммобилизированной гиалуронидазы на биохимические показатели крови у мышей линии CBA/CaLac в возрасте 20 месяцев (Х±m)
Возраст, мес	Контрольные мыши (физ. раствор)	Опытные мыши (имГД)
Глюкоза, моль/л	Общий белок, г/л	Общий холестерин, ммоль/л	Креатинин, мкмоль/л	Глюкоза, моль/л	Общий белок, г/л	Общий холестерин, ммоль/л	Креатинин, мкмоль/л
2,5	6,4±0,7	15,9±0,9	3,2±0,3	46,9±3,5	6,4±0,7	15,9±1,3	3,2±0,3	46,9±5,5
20	14,5±1,6*	12,2±0,7*	8,6±0,7*	97,6±5,7*	8,3±0,8	14,7±0,6	4,2±0,5	59,7±6,8
* - отмечена достоверность различия показателя от его значения у животных в возрасте 2,5 месяцев при р<0,05

Кроме того, было выявлено и существенное влияние препарата на условно-рефректорную деятельность ЦНС животных в возрасте 20 мес. В частности, уровень воспроизведения условного рефлекса у контрольных животных на 7 сут после его выработки составлял всего 53%, ay мышей, получавших заявляемое средство, он был равен 85% (табл.3).

Таблица 3
Влияние препарата иммобилизированной гиалуронидазы на воспроизведение условно-рефлекторного навыка у мышей линии CBA/CaLac в возрасте 20 месяцев (Х±m)
Группы	Уровень воспроизведения рефлекса1
Интактные мыши в возрасте 2,5 мес	0,92±0,1
Контрольные мыши (физ. раствор) в возрасте 20 мес	0,53±0,13*
Опытные мыши (имГД) в возрасте 20 мес	0,86±0,17#
1 - доля животных с сохраненным рефлексом * - отмечена достоверность различия показателя от его значения у интактных животных в возрасте 2,5 мес при р<0,05 # - отмечена достоверность различия показателя от его значения у контрольных животных в возрасте 20 мес при р<0,05

В целом полученные результаты свидетельствуют о значительном увеличении продолжительности жизни экспериментальных животных под влиянием имГД на фоне торможения у них развития патоморфологических, биохимических и функциональных изменений, отражающих формирование нарушений, характерных для процесса старения [1].

Таким образом, иммобилизированная с помощью электронно-лучевого синтеза гиалуронидаза обладает выраженными «антисенесцентивными» («anti» греч. - против, «senescentia» лат. - старение) свойствами и может быть охарактеризована как «антисенесцентивное средство». При этом механизмами действия препарата, очевидно, является активация систем клеточного самообновления, определяемая повышением степени реализации ростового потенциала стволовых клеток [3], и оптимизация обменных процессов в тканях за счет модуляции эффектов эндогенных биологически активных веществ и повышения восприимчивости клеток-эффекторов к регуляторным стимулам [11].

Литература

1. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. В 2-х томах - 2-е изд., перераб. и доп. - СПБ: Наука, 2008. - Т.2. - 435 с.

2. Практическая гериатрия (Избранные клинические и организационные аспекты) /Под ред. Л.Б.Лазебника. - М.: Межвед. науч. совет по геронтологии и гериатрии при РАМН и МЭ РФ - ЗАО Объеденная редакция «Боргес», 2002. - 555 с.

3. Патент (RU) на изобретение № 2405822 «Средство, увеличивающее резерв стволовых клеток в организме» (опубл. 10.12.2010, Бюл. № 34) Авторы: Артамонов А.В., Бекарев А.А., Верещагин Е.И., Дыгай А.М., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Удут В.В.

4. Stem R. Devising a pathway for hyaluronan catabolism: are we there yet? // Gly-cobiology. - 2003. - Vol.13. - № 12. - P.105-115.

5. Henry С.В., Duling, B.R. Permeation of the luminal capillary glycocalyx is determined by hyaluronan // Am. J. Physiol. - 1999. - № 277. - P.508-514.

6. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 15 изд. перераб., испр. и доп. - М: ООО «Издательство Новая волна», 2005.

7. Патент (RU) на изобретение № 2378007 «Средство, обладающее анаболическим действием», 2010 г. (опубл. 10.01.2010, Бюл. № 1). Авторы: Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В.

8. Колб В.Г., Камышников B.C. Клиническая биохимия. - Минск, 1982. - 366 с.

9. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. Медицина, Ленинградское отделение, 1969. - 422 с.

10. Патент (RU) на изобретение № 2240604 «Способ моделирования постгипоксической энцефалопатии и связанных с ней нарушений в системе крови», 2004 г. (опубл. 20.11.2004 г., Бюл. № 32). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Суслов Н.И.

11. Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Влияние иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы на чувствительность прогениторных клеток к регуляторным факторам. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2011. - № 1.