средство, усиливающее мобилизацию стволовых клеток

Формула изобретения

Применение иммобилизованной на низкомолекулярном полиэтиленгликоле 1500 Да направленным потоком ускоренных электронов 2,5 МэВ гиалуронидазы в качестве средства для усиления мобилизации стволовых клеток.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и медицине, конкретно к клеточным технологиям и фармакологии.

Известны средства, способные усиливать мобилизацию стволовых клеток при экстремальных воздействиях, патологических состояниях и при введении в организм модификаторов функций стволовых клеток (СК) [1]. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является препарат нативной гиалуронидазы [1, 2].

Недостатками данного средства являются побочные эффекты и осложнения [3, 4], связанные с иммуногенностью гиалуронидазы, представляющей собой вещество белковой природы. В частности, системные и местные аллергические реакции различной интенсивности при ее парентеральном введении, представляющем собой единственно возможный путь назначения данного фермента. Кроме того, стимуляция процессов мобилизации стволовых клеток с помощью препарата нативной гиалуронидазы является недостаточно эффективной.

Известно средство, представляющее собой иммобилизированную с помощью ионизирующего излучения (нанотехнологии электронно-лучевого синтеза) гиалуронидазу [5].

Нами впервые выявлена его способность значительно усиливать мобилизацию стволовых клеток.

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение показаний к применению иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы.

Поставленная задача достигается применением иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы в качестве средства для усиления мобилизации стволовых клеток при экстремальных воздействиях, патологических состояниях и при введении в организм факторов, вызывающих мобилизацию стволовых клеток.

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве средства для усиления мобилизации стволовых клеток иммобилизированную с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазу.

Используемое нами оригинальное средство иммобилизированной с помощью ионизирующего излучения (электронно-лучевого синтеза) гиалуронидазы [5] было разработано и получено ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент» (г.Новосибирск) совместно с НИИ фармакологии СО РАМН (г.Томск). Иммобилизацию гиалуронидазы осуществляли на иизкомолекулярном полиэтиленгликоле (1500 Да) направленным потоком ускоренных электронов с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза от 2 до 10 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час. Показано, что данное средство при его парентеральном и пероральном введении способно увеличивать резерв стволовых клеток в организме [5].

Известно, что экстремальные воздействия и развитие определенных заболеваний сопровождаются активацией механизмов компенсации «глубокого» резерва, связанных со стволовыми клетками (СК) [6, 7]. При этом зачастую может происходить мобилизация в кровь клеток-предшественников, способных в дальнейшем участвовать в регенерации пораженных органов-мишеней. Однако активация указанных механизмов в ряде случаев оказывается недостаточной для «успешной» адаптации организма [7, 8]. В связи с вышеизложенным усиление мобилизации СК при экстремальных воздействиях и определенных заболеваниях, а также при введении различных фармакологических агентов - модификаторов функциональной активности СК, представляется актуальной задачей, решение которой может стать важным этапом в повышении эффективности терапии различных дегенеративных заболеваний.

Показана эффективность препарата нативной гиалуронидазы в качестве средства для усиления мобилизации СК при экстремальных воздействиях, патологических состояниях и при введении в организм факторов, вызывающих мобилизацию стволовых клеток [1, 2]. Однако возможность достижения указанного технического результата появляется только при использовании данного средства в высоко токсичных дозах [9]. В этом случае «барьер», предотвращающий появление резорбтивных эффектов нативной гиалуронидазы при ее использовании в терапевтических дозах, представленный системой факторов деградации фермента в тканях и сыворотке крови, оказывается не способным к его полной инактивации [10].

Вместе с тем известно, что иммобилизизация гиалуронидазы с помощью ионизирующего излучения на низкомолекулярном носителе сопровождается появлением новых физико-химических свойств у данного фермента, позволяющим получать вещество, способное в безопасных дозах, в том числе при его пероральном использовании, оказывать выраженные резорбтивные (системные) эффекты [5]. При этом известна низкая токсичность и безопасность пегилированных (иммобилизированных на полиэтиленгликоле) белковых средств [11].

В то же время известно, что процесс манипуляции разнородными субстанциями на молекулярном уровне [11, 12], в том числе с использованием физических факторов, обладающих высокой энергией, может сопровождаться существенными изменениями стереохимической структуры исходных веществ и в конечном итоге приводить к модификации их свойств, характер которой зачастую является непредсказуемым.

Факт применения иммобилизированной гиалуронидазы (имГД) с достижением нового технического результата, заключающегося в усилении мобилизации различных типов стволовых клеток при экстремальных воздействиях, патологических состояниях и при введении в организм факторов, вызывающих мобилизацию стволовых клеток, для специалиста является не очевидным.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на мышах линии CBA/CaLac в количестве 197 штук, массой 20-22 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН.

Для фармакологической мобилизации СК использовали: Г-КСФ (наиболее изученный и эффективный фактор мобилизации СК) в дозе 125 мкг/кг [1, 6] и СТСЕ-0214 (пептид-аналог SDF-1-фактора) в дозе 10 мкг/кг [1, 13]. Выбор факторов мобилизации СК объясняется различными спектрами их специфической активности, механизмами действия и их биологическим назначением. Используемые дозы данных веществ были определены в предварительных экспериментах как максимально эффективные.

В качестве экстремальных воздействий и патологических состояний были выбраны модели, отличающиеся по вызывающим их причинам и различные по механизмам развивающихся изменений на разных уровнях организации, а также эффектам и исходам: иммобилизациоиный стресс (ИС) - 12 часовая иммобилизация мягкими вязками в положении лежа на спине [14], посттипоксическая энцефалопатия [6] и хронический токсический гепатит, вызваемый введением тетрохлоруглерода [8]. При этом схожесть многих звеньев патогенеза различных заболеваний и наличие единых регуляторных и адаптивных механизмов макроорганизма позволяет экстраполировать получаемые на данных моделях результаты на большинство известных патологических состояний [1].

В ходе экспериментов в костном мозге и периферической крови определяли содержание различных прогениторных элементов (СК). Методом клонирования в полувязкой среде определяли содержание коммитированных мезенхимальных клеток-предшественников (фибробластных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф)) и стволовых кроветворных клеток (СКК) - гранулоцитарно-эритро-макрофагально-мегакариоцитарных единиц (КОЕ-ГЭММ) [15], а с помощью метода лимитирующих разведений количество мезенхимальных (истинных) стволовых клеток (МСК) [1, 6, 8, 9].

Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1.

Эксперименты выполнялись на интактных мышах. Контрольным животным подкожно вводили гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) («Нейпоген», Hoffman-la-Roche, Щвейцария) в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сутки в течение 3 дней в эквивалентном объеме (0,2 мл). Опытным мышам на фоне введения Г-КСФ в аналогичном режиме per os 1 раз в сутки в течение 2 дней вводили иммобилизированную гиалуронидазу (имГД) (ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент», г.Новосибирск) в дозах: 1000, 250 и 50 ЕД/кг. Кроме этого часть опытных животных совместно с Г-КСФ получали внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2 дней препарат нативной гиалуроиидазы («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1000 Е/кг и 50 ЕД/кг (в 0,5 мл физиологического раствора).

Введение Г-КСФ приводило к возрастанию числа КОЕ-Ф как в костном мозге (до 181%), так и в периферической крови (до 475%) мышей на 3 сутки исследования. При этом дополнительное введение препарата нативной гиалуронидазы существенно потенцировало мобилизующую активность Г-КСФ, но только при ее использовании в дозе 1000 ЕД/кг (табл.1).

Иммобилизираванная гиалуронидаза, в отличие от ее нативного аналога, во всех случаях (дозах) стимулировала индуцируемый Г-КСФ выход прогенитерных элементов в кровь. Причем наибольшая эффективность данного средства регистрировалась при использовании минимальной дозы (составляющей 50 ЕД/кг), когда она кратно превосходила таковую даже при применении Г-КСФ совместно с 1000 ЕД/кг нативной гиалуронидазы. При этом наибольшее число циркулирующих КОЕ-Ф в данном случае в динамике отмечалось на 5 сутки эксперимента и составляло 2022% от контрольных значений (в 12,13 раза выше, чем при использовании только Г-КСФ, и почти в 7 раз больше, чем при введении Г-КСФ и препарата нативной гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг). На 8 сутки наиболее выраженное стимулирующее действие иммГД также отмечалось в группах с дозами фермента 250 и 50 ЕД/кг. Содержание КОЕ-Ф при этом в периферической крови достигало соответственно 342% и 334% от фона и 195% и 191% от уровня данного показателя в группе мышей, получавших только Г-КСФ (табл.1).

Таким образом, имГД, в большей степени при ее использовании в чрезвычайно низких дозах, обладала значительно более выраженной потенцирующей мобилизующие свойства Г-КСФ активностью, чем препарат нативной гиалуронидазы при его использовании в максимально эффективной, но токсической дозе.

Пример 2.

Интактным животным на фоне однократного внутривенного введения белка СТСЕ-0214 (пептида-аналога SDF-1-фактора) в дозе 10 мкт/кг («Sigma», США) дополнительно 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили препарат нативной гиалуронидазы («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1000 ЕД/кг либо перорально препарат имГД (ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент», г.Новосибирск) в дозе 50 ЕД/кг (в 0,5 мл физиологического раствора).

На 3 сутки после начала эксперимента в костном мозге регистрировалось увеличение числа стволовых кроветворных клеток (КОЕ-ГЭММ). В то же время имело место и увеличение количества данных элементов в периферической крови (до 433,3% от фона). Введение нативной гиалуронидазы отменяло влияние фактора СТСЕ-0214 на содержание СКК в костном мозге, но приводило к значительно более выраженному увеличению числа данных родоначальных клеток в периферической крови, достигающему 747,6% от фона (табл.2).

В то же время применение препарата имГД на фоне введения белка СТСЕ-0214 вызывало наиболее выраженное повышение количества циркулирующих СКК (до 574% от контрольных значений у мышей, которым вводили только СТСЕ-0214) (табл.2).

Таким образом, имГД значительно усиливала мобилизирующий эффект субстанции СТСЕ-0214 (пептида-аналога SDF-1-фактора) в отношении стволовых кроветворных клеток.

Пример 3.

Иммобилизациоиный стресс (ИС) у животных вызывали путем 12- часовой иммобилизации на спине с помощью мягких вязок [14]. При этом опытным животным сразу после воздействия 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили препарат нативной гиалуронидазы («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1000 ЕД/кг (максимально эффективная доза), и перорально либо внутрибрюшинно препарат иммобилизированной гиалуронидазы (имГД) (ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент», г.Новосибирск) в дозе 50 ЕД/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.

В ходе эксперимента иммобилизационный стресс на 3 сутки после воздействия приводил к повышению в костном мозге количества КОЕ-Ф и СКК. При этом в периферической крови наблюдалось увеличение содержания стволовых кроветворных клеток. Однако введение препарата нативной гиалуронидазы еще в большей степени увеличивало содержание КОЕ-Ф, СКК и МСК в периферической крови (табл.3). В то же время наиболее высокие значения количества циркулирующих прогениторных клеток имели место при использовании в качестве средства для усиления мобилизации препарата имГД. Причем эффективность данного вещества была одинаково высокой при обоих путях его введения (табл.3).

Таким образом, введение имГД на фоне моделирования иммобилизационного стресса, в дозе в 20 раз ниже максимально эффективной дозы для препарата нативной ГД, приводило к значительно более выраженной мобилизации стволовых клеток различных классов.

Пример 4.

Постгипоксическую энцефалопатию моделировали с помощью термокамеры объемом 500 мл [6]. Мыши помещались в термокамеру, крышка закрывалась, и мыши оставались там до атонального судорожного припадка или остановки дыхания, определяемой визуально, в течение 10-15 секунд. После извлечения из термокамеры и восстановления самостоятельного дыхания, через 5-10 минут, мыши вновь помещались в термокамеру также до наступления агонального состояния (генерализованного судорожного припадка или остановки дыхания). Опытным животным сразу после воздействия 1 раз в сутки внутрибрюшинно вводили препарат нативной гиалуронидазы («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1000 ЕД/кг, и перорально препарат имГД (ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент», г.Новосибирск) в дозе 100 ЕД/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.

Развитие энцефалопатии сопровождалось мобилизацией стволовых кроветворных клеток, а также появлением тенденции к увеличению содержания МСК в периферической крови. Введение препарата нативной гиалуронидазы увеличивало количество КОЕ-Ф, СКК и МСК в периферической крови (табл.4). Однако применение имГД оказывало мобилизующий эффект в отношении всех типов СК, значительно превосходящий таковой при использовании неконъюгированного с носителем фермента (табл.4).

Пример 5.

У мышей хронический гепатит (ХГ) моделировали внутрижелудочным введением тетрахлоруглерода (ТХУ) в виде 20% раствора на оливковом масле в объеме 0,2 мл/мышь живого веса в течение 3 недель дважды в неделю [8]. При этом опытным животным сразу после моделирования ХГ 1 раз в 2 дня в течение 6 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1000 ЕД/кг (в 0,5 мл физиологического раствора), и перорально препарат имГД (ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент», г.Новосибирск) в дозе 20 ЕД/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным в аналогичном режиме вводили 0,5 мл физиологического раствора.

В ходе эксперимента при моделировании хронического токсического гепатита отмечалось увеличение количества КОЕ-Ф и МСК в костномозговой ткани. При этом имело место также повышение содержания данных прогениторных элементов и в периферической крови, свидетельствующее об их мобилизации из тканей-депо на фоне стимуляции процессов их пролиферации (табл.5).

В то же время введение препаратов гиалуронидазы сопровождалось еще большим возрастанием числа СК в костном мозге и еще более значительным увеличением их количества в периферической крови (табл.5). Причем указанные изменения были существенно выраженными, именно, в группе мышей, получавших препарат имГД, несмотря на то, что при этом использовалась доза фермента в 50 раз меньше.

Таким образом, введение иммобилизированной гиалуронидазы при экспериментальном хроническом гепатите приводило к резкой стимуляции процессов мобилизации мезенхимальных клеток-предшественников различной степени зрелости в кровь на фоне увеличения количества СК в костном мозге, связанного, по-видимому, с повышением интенсивности процессов их размножения.

Исходя из полученных результатов следует, что применение иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы на фоне моделирования экстремальных воздействий, патологических состояний и при введении в организм факторов, вызывающих выход СК в кровь, приводит к значительному повышению уровня мобилизации стволовых клеток. Причем потенцирующие мобилизацию СК свойства имГД проявляются в низких дозах и выражены существенно в большей степени, чем у препарата нативной гиалуронидазы при ее применении в максимально эффективной, но токсичной дозе.

Предлагаемое средство может быть использовано в регенеративной медицине с целью реализации неинвазивной стратегии проведения клеточной терапии дегенеративных заболеваний, основанной на принципе фармакологической стимуляции эндогенных стволовых клеток [7], либо для получения трансплантационного материала из периферической крови, максимально обогащенного прогениторными элементами [16].

Источники информации

1. Патент (RU) на изобретение № 2330674, «Способ усиления мобилизации стволовых клеток». Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. и др.

2. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. Механизмы мобилизации мезенхимальных клеток-предшественников гранулоцитарным колониестимулирующим фактором и гиалуролидазой // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2007. - № 12. - С.652-656.

3. Anderson J.A. Allergic reactions to drugs and biologic agents. JAMA. - 1992 - Vol.268. - p.2845-2857.

4. De Swarte R.D., Drug allergy. In: Patterson R. et.al. Allergic Diseases Diagnosis and Management, 4th ed. Philadelphia, Pa: JB Lippincott. - 1993 - p.396-551.

5. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. - 2009. - № 11. - С.6-9.

6. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Гипоксия и система крови. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006. - 142 с.

7. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы // Наука в России - Москва: Изд-во «Наука», 2009. - Том. 169. - № 1. С.4-8.

8. Эпштейн О.И., Зюзьков Г.Н., Сотникова Н.В. и др. Механизмы гепатопротекторного эффекта препарата сверхмалых доз антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - № 4. - С.194-198.

9. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. и др. Роль гиалуронидазы в регуляции функций мезенхимальных клеток-предшественников // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007. - № 2. - С.115-119.

10. Stern R. Devising a pathway for hyaluronan catabolism: are we there yet? // Glycobiology. - 2003. - Vol.13. - № 12. - P.105-115.

11. Сейфулла Р.Д., Тимофеев А.Б., Орджоникидзе З.Г. и др. Проблемы использования нанотехнологии в фармакологии // Экспер. и клин. фарм. 2008. - Том 71. - № 1. - С.61-69.

12. Евдокимов Ю.М. Пространственно упорядоченные формы ДНК и ее комплексов - основа создания наноконструкций для медицины и биохетнологий // Российские нанотехнологии. - 2006. - № 1-2. - С.256-264.

13. Perez L.E., Alpdogan О., Shieh J.H. еt.аl. Increased plasma levels of stromal-derived factor-1 (SDF-1/CXCL12) enhance human thrombopoiesis and mobilize human colony-forming cells (CFC) in NOD/SCID mice // Exp. Hematol. - 2004 Mar; 32(3):300-7.

14. Дыгай A.M., Шахов В.П. Роль межклеточных взаимодействий в регуляции гемопоэза. - Томск: Изд-во ТГУ, 1989. - 224 с.

15. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.

16. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Влияние трансплантации мононуклеаров периферической крови, полученных с использованием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и гиалуронидазы, на регенерацию кроветворной ткани при миелосупрессии // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2009. - № 3. - С.136-142.

Таблица 1
Динамика содержания КОЕ-Ф в костном мозге и периферической крови мышей линии CBA/CaLac при введении 125 мкг /кг Г-КСФ (1), 125 мкг/кг Г-КСФ+1000 ЕД/кг нативной ГД (2), 125 мкг/кг Г-КСФ+50 ЕД/кг нативной ГД (3), 125 мкг/кг Г-КСФ+1000 ЕД/кг имГД (4), 125 мкг/кг Г-КСФ+250 ЕД/кг имГД (5), 125 мкг/кг Г-КСФ+50 ЕД/кг имГД (6), (X+m)
Сроки исследования, сутки	КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов	КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. мононуклеаров
фон	8,17±0,48	2,0±0,26
3-е	1	14,83±1,14*	9,5±0,21*
2	13,4±1,6*	12,5±0,24*#
3	12,67±1,15*	9,0±0,89*
4	18,67±1,09*#&	12,17±1,28*#
5	16,5±0,99*#&	10,33±1,26*#
6	25,83±0,95*#&	13,17±0,6*#
5-е	1	9,83±0,4	2,5±0,34
2	10,3±0,4	4,5±0,24#
3	7,33±0,42	2,83±0,42
4	15,67±0,92*#&	8,67±0,42*#&
5	11,5±1,08*#	10,83±1,35*#&
6	19,83±0,91 *#&	30,33±2,03*#&
8-е	1	9,67±0,99	3,5±0,22*
2	8,8±0,91	4,6±0,22*#
3	9,83±0,54	3,33±0,33*
4	9,5±0,43	4,5±0,56*#
5	10,67±0,49*	6,83±0,2*#&
6	12,33±0,56*#&	6,67±0,21*#
* - отмечена достоверность различия показателя от его фонового значения при p<0,05;
# - отмечена достоверность различия показателя от его значения в группе животных, получавших им Г-КСФ при p<0,05;
& - отмечена достоверность различия показателя от его значения при введении Г-КСФ и препарат нативной гиалуронидазы при p<0,05.

Таблица 2
Динамика содержания стволовых кроветворных клеюк в костном мозге и периферической крови при введении СТСЕ-0214 (1) и при дополнительном введении 1000 ЕД/кг нативной гиалуронидазы (2), либо имГД в дозе 50 ЕД/кг, (M±m)
	СКК (КОЕ-ГЭММ) в костном мозге, на 105 миелокариоцитов	СКК (КОЕ-ГЭММ) в периферической крови, на 105 мононуклеаров
фон	5,8±0,97	2,1±0,24
1	8,4±0,36 *	9,1±2,3 *
2	7,62±1,2	15,7±1,07*#
3	10,3±1,0*&	52,2±1,2 *#&
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05;
# - отмечена достоверность различий с показателями в группе животных, получавших только Г-КСФ при р<0,05;
& - отмечена достоверность различия показателя от его значения при введении препарата нативной гиалуронидазы при р<0,05.

Таблица 3
Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при иммобилизационном стрессе и при введении препаратов гиалуронидазы на фоне иммобилизациопного стресса, (M±m)
	КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов	КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. мононуклеаров	СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов	СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров	МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов	МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров
фон	5,4±0,21	0,57±0,1	7,8±0,41	2,4±0,7	12,0±3,0	9,0±3,0
Контроль (ИС)	7,2±0,53*	0,71±0,2	10,1±0,3*	4,6±0,2*	14,0±4,0	13,0±3,0
ИС+натив пая ГД	7,45±0,4*	1,6±0,21*#	9,85±1,2	5,87±0,5*#	12,0±3,0	18,0±3,0*
ИС+имГД внутрибрюшинно	8,05±0,4*	5,7±0,21*#&	12,9±2,2	10,4±0,3 *#&	18,0±3,0	37,0±2,0*#&
ИС+имГД per os	8,2±0,21 *	5,6±0,3*#&	13,7±0,8	11,3±0,2* #&	18,0±3,0	36,0±2,0*#&
*- отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05;
# - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05;
& - отмечена достоверность различий с группой животных, получавших препарат нативной гиалуронидазы при р<0,05.

Таблица 4
Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при развитии энцефалопатии и при введении препаратов гиалуронидазы на фоне моделирования энцефалопатии, (M±m)
	КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов	КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. мононуклеаров	СКК в кост ном мозге, на 105 миелокариоцитов	СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров	МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов	МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров
фон	8,7±0,68	1,34±0,1	9,1±0,63	1,4±0.6	31,0±4,0	12,0±3,0
энцефалопатия (ЭП)	17,2±1,3*	2,4±1,0	29,8±3,4*	8.87±1,2*	59,0±9,0*	20,0±4,0
ЭП+нативная ГД	28,9±2,7* #	4,6±1,2*#	25,3±1,7*	16,0±2,6*#	47,0±8,0	28,0±4,0*
ЭП+имГД	27,1±1,5*#	14.4±1,7*#&	22,4±2,1*	37,0±0,9*#	46,0±5,0	44,0±3,0*&
*- отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05;
# - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05;
& - отмечена достоверность различий с группой животных, получавших препарат нативной гиалуронидазы при р<0,05.

Таблица 5
Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при развитии хронического гепатита и при введении препаратов гиалуронидазы на фоне моделирования гепатита, (M±m)
	КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов	КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. мононуклеаров	МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов	МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров
фон	15,17±1,3	6,5±0,99	24,0±4,0	31,0±7,0
ХГ	28,7±3,4*	9,1±0,48*	66,0±8,0*	64,0±10,0*
ХГ+нативная ГД	39,2±2,1*#	14,09±0,7*#	84,0±18,0*	88,0±4,0*#
ХГ+имГД	46,8±1,9*#&	46,4±1,1*#&	90,0±12,0*	192,0±10,0*#&
*- отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05;
# - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05;
& - отмечена достоверность различий с группой животных, получавших препарат нативной гиалуронидазы при р<0,05.