пиперазиновая соль бис(оксиметил)фосфиновой кислоты, обладающая антигельминтной активностью

Формула изобретения

Пиперазиновая соль бис(оксиметил)фосфиновой кислоты общей формулы (I):



обладающая антгельминтной активностью.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к химии азотсодержащих гетероциклов и фосфорорганических соединений, а именно к солям пиперазина с бис(оксиметил)фосфиновой кислотой, которые могут быть использованы в качестве антгельминтного средства в ветеринарной и медицинской практике для лечения нематодозов.

Известно, что пиперазин в виде гексагидрата и его солей с органическими и неорганическими кислотами (адипинат, дигидрохлорид, моногидрохлорид, сульфат, дитиокарбамат, тартрат, фосфат, цитрат) применяются для лечения животных, больных гельминтозами: крупного рогатого скота (неоаскаридоз), лошадей (параскаридоз, оксиуроз), свиней (аскаридоз, эзофагостомоз, трихоцефалез), плотоядных (токсокароз, токсаскаридоз, унцинариоз), кроликов (пассалуроз), птиц (аскаридиоз, гангулетеракидоз, амидостомоз, тетрамероз) (Кузьмин А. А. Антгельминтнки в ветеринарной медицине. М., Аквариум, 2000, 144 с. ) [1], (Набиев Ф.Г., Ахмадеев Р.Н. Лекарственные препараты для ветеринарии. Ч.2. Казань, 2000, 592 с.) [2], (Паразитология и инвазионные болезни животных. М., Колос, 2000, 743 с.) [3], а также в медицинской практике в качестве противоглистного средства (Машковский М.Д. Лекарственные средства. Ч. 2. М., Медицина, 1993, 688 с.) [4].

Несмотря на широкое использование солей пиперазина в качестве средств профилактической и лечебной дегельминтизации получить 100%-ные показатели экстенс- и интенсэффективности не удается, поэтому эти препараты применяются неоднократно, а в ряде случаев для повышения эффективности они назначаются в сочетании с другими антгельминтными препаратами (фенотиазин). Производные пиперазина оказывают местное реактогенное действие на слизистые оболочки кишечника, усиливающееся тем, что у больных животных в слизистой оболочке кишечника возникают механические повреждения, вызванные гельминтами, нарушаются структуры гисто-гематического барьера. Все это создает условия для проникновения патогенной микрофлоры.

Цель изобретения - новое, более эффективное соединение, обладающее антгельминтным действием, не оказывающее местного реактогенного действия на слизистые оболочки кишечника, способствующее быстрому оздоровлению животных и расширяющее арсенал известных антгельминтных средств.

Таким соединением является пиперазиновая соль бис(оксиметил)фосфиновой кислоты формулы (I).

Соединение (I) получают взаимодействием пиперазин гексагидрата с бис(оксиметил)фосфиновой кислотой в мольном соотношении 1:2 в среде органических растворителей, в которых растворимы исходные реагенты и не растворим конечный продукт (из них наиболее дешевым и доступным является метанол).

ПРИМЕР 1. Раствор 87,75 г бис(оксиметил)фосфиновой кислоты в 270 мл метанола прибавляют по каплям при перемешивании к раствору 67,60 г пиперазин гексагидрата в 375 мл метанола. Температура реакционной смеси при этом повышается с 5 до 28^oС. Реакционную смесь нагревают до кипения, кипятят 10 мин и оставляют стоять 12-15 ч. Выпавшую в осадок соль отфильтровывают, промывают метанолом и сушат в вакууме (10-12 мм рт. ст.) до постоянного веса при 50^oС. Выход пиперазиновой соли бис(оксиметил)фосфиновой кислоты 102,0 г или 86,64 %. Т.пл. 215-217^oС.

Элементный анализ: Найдено, %: С 24,87; Н 7,89; N 7,09; Р 17,31

C₈H₂₄N₂О₈P₂2H₂О Вычислено, %: С 25,67; Н 7,54; N 7,49; Р 16,55.

ЯМР ³¹Р: 36,14 м.д.

Сравнительное исследование эффективности пиперазиновой соли бис(оксиметил)фосфиновой кислоты (ПОМФ) и пиперазин адипината (ПА) при нематодозах проводилось в течение двух лет на 216-ти животных (поросята, жеребята, щенки) и 105-ти курах. Полученные результаты приведены в таблице 1.

При лечении поросят, больных аскаридозом, эзофагостомозом и трихоцефалезом, препараты ПА и ПОМФ давали двукратно (утром и вечером) в дозе 0,3 г/кг. Перед началом опытов и через 15 дней после начала лечения фекалии животных исследовали по флотационному методу. Подсчитывали количество яиц нематод в 1 г фекалий; также проводили вскрытие животных, выделявших яйца нематод после дегельминтизации.

Как видно из таблицы 1, при применении ПА для лечения больных аскаридозом поросят из 30 животных освободились от инвазии 28, при этом экстенсэффективность (ЭЭ) составила 93,3%, интенсэффективность (ИЭ) - 97,6%. Индекс инвазированности (ИИ) снизился в 41 раз и составил 160,2 экз. яиц в 1 г фекалий. При вскрытии двух поросят, продолжавших выделять яйца аскарид после лечения, в тонком отделе кишечника у одного было обнаружен 1, а у другого 2 живых гельминта. При применении исследуемого ПОМФ все 30 поросят через 15 дней не выделяли яйца аскарид; показатели ЭЭ и ИЭ в этом случае составили 100%.

При применении ПА для лечения эзофагостомоза поросят через 15 дней из 25 животных 21 прекратили выделение яиц паразита (ЭЭ 84,0%, ИЭ 94,1%, таблица 1). У оставшихся четырех поросят ИИ составлял 260,8 экз. яиц эзофагостом в 1 г фекалий. При вскрытии животных были обнаружены соответственно 3, 5, 8 и 12 живых эзофагостом в ободной и слепой кишках. Применение ПОМФ дало следующие результаты: 24 из 25 больных животных освободились от инвазии (ЭЭ 96,0%, ИЭ 98,9%); у оставшегося больного животного ИИ составил 6 экз. яиц в 1 г фекалий, при вскрытии в его ободной кишке были обнаружены две живые эзофагостомы.

При применении ПА для лечения больных трихоцефалезом поросят через 15 дней 18 из 25 животных освободились от инвазии (ЭЭ 72,0%, ИЭ 92,2%, таблица 1). У оставшихся 7 поросят ИИ составил 312,4 экз. яиц в 1 г фекалий. При вскрытии этих животных в слепых кишках были обнаружены от 3 до 21 экземпляров власоглав. Значительно лучше показатели при применении исследуемого ПОМФ: из 25 больных животных освободились от гельминтов 21 (ЭЭ 84,0%, ИЭ 97,3%). У оставшихся четырех ИИ составил 111,3 экз. яиц в 1 г фекалий, при вскрытии этих животных в слепых кишках обнаружены единичные трихоцефалы (от 2 до 7 экз.).

При лечении больных параскаридозом и оксиурозом жеребят ПА-ом ЭЭ составил 84,6 и 93,3% соответственно, а ИЭ - 95,2 и 98,8% соответственно. Применение исследуемого ПОМФ позволило достичь 100%-ных показателей ЭЭ и ИЭ (таблица 1), при этом исследование прианальных соскобов у всех животных показало отсутствие инвазии.

При лечении инвазированных токсокарами щенков ПА-ом (2-кратно по 0,2 г/кг) из 12 животных 10 освободились от гельминтов (ЭЭ 83,3%, ИЭ 96,9%). У оставшихся двух щенков ИИ составил 60,1 экз. яиц в 1 г фекалий. При применении ПОМФ все животные освободились от токсокар (ЭЭ и ИЭ 100%, таблица 1).

При применении ПА для лечения больных аскаридиозом кур (2-кратно по 0,5 г/кг) из 40 кур 39 освободились от аскаридий (ЭЭ 97,5%, ИЭ 97,7%). У одной птицы ИИ снизился до 90,3 экз. яиц в 1 г помета; при вскрытии в тонком отделе кишечника были обнаружены 2 живые аскаридии. При использовании исследуемого ПОМФ все 40 птиц освободились от инвазии (ЭЭ и ИЭ 100%, таблица 1).

Таким образом, при лечении поросят, больных эзофагостомозом и трихоцефалезом, пиперазиновая соль бис(оксиметил)фосфиновой кислоты в дозах, в которых применяется пиперазин адипинат, оказалась более эффективной. При лечении препаратом ПОМФ животных, больных аскаридозом, параскаридозом, оксиурозом, токсокарозом, кур, больных аскаридиозом, удалось достичь 100%-ной эффективности дегельминтизации, тогда как широко применяемый пиперазин адипинат ни в одном случае не позволил достигнуть 100-ных показателей (таблица 1).

Комплексные морфологические (гистологические, гистохимические. ультраструктурные, морфометрические) характеристики изучали на материале, взятом у больных цыплят в возрасте 105-110 суток (тонкий отдел кишечника, печень). Предварительно подопытные цыплята (105 голов) в возрасте 45-50 суток были заражены инвазионными яйцами Ascaridia galli в дозе 500 яиц на голову. Последующее проявление аскаридиозной инвазии было подтверждено гельминтоовоскопическим методом по истечении 60 суток после заражения.

Больные цыплята были разделены на 3 группы по 35 голов в каждой Первая группа была контрольной, цыплятам второй группы давали ПОМФ в дозе 0,5 г на голову в течение двух дней, цыплятам третьей группы в той же дозе и последовательности давали ПА.

Подопытные птицы были убиты на третьи, девятые и двадцатые сутки эксперимента по 11 голов на каждый срок исследования.

Гистологические исследования проводили по общепринятым и специальным методикам (Меркулов Г. А. Курс патолого-гистологической техники. М., Медицина, 1969, 423 с.) [5]. Гликоген и нейтральные полисахариды определяли по (Шабадаш А.Л. Рациональная методика гистохимического обнаружения гликогена и ее теоретическое обоснование Изв. АН СССР, Сер. биол., 1947, - 6, стр.745-760) [6] применяет аскорбиновую кислоту по (Пирс Э. Гистохимия теретическая и прикладная. М., Иностранная лит-ра, 1962, 956 с.) [7], ядрышковые протеины по (Мамаев Н. Н., Гудкова А.Я., Аминова Х.К. Метод оценки биосинтезирующей функции кардиомиоцитов человека. Арх. анат. , 1989, в. 5, с. 9-72) [8]. Ультраструктурные исследования проводили по общепринятой методике (Г. Гайер. Электронная гистохимия. М., Мир, 1974, 488 с.) [9] с применением электронного микроскопа ПЭМ-100 при инструментальном увеличении от 6000 до 80000. Морфометрические исследования проводили с помощью окуляр-сетки и окуляр-микромера МОВ-1-15Х (Автандилов Г.Г., Яблучанский Н.И., Губенко В.Г. Системная стериометрия в изучении патологического процесса. М., Медицина, 1981, 192 с. ) [10].

Гистологические изменения в пораженных гельминтами участках тонкого кишечника характеризовались проявлением выраженного десквамативного катарального воспаления со значительными разрушениями структуры ворсинок, крипт и подслизистой основы.

Ультраструктурные изменения столбчатых эпителиоцитов у большинства птиц отличались резким просветлением матрикса цитоплазмы, укорочением и разрушением микроворсинок. Резкое расширение просвета цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума, диссоциация рибосом на их поверхности в сочетании с деструктивными изменениями в митохондриях, снижением уровня ядерно-цитоплазматического транспорта свидетельствовали о глубоком нарушении синтетической и транспортной функций эпителиальных клеток. Аллергическая перестройка в ворсинках и криптах проявлялась разволокнением их ретикулярной основы, обильной инфильтрацией ее эозинофильными гранулоцитами, мукоидным и фибриноидным набуханием стенок мелких сосудов. В укороченных криптах заметно ослабевала митотическая активность (таблица 2). Атрофия и разрежение ганглиозных клеток мышечно-кишечных сплетений отражало глубокие нарушения эфферентной иннервации кишечной стенки.

В печени больных аскаридиозом птиц были отмечены признаки выраженного проявления холестатическо-гепатоцеллюлярного синдрома, сопровождаемого в отдельных участках атрофией гепатоцитов (таблица 3). У больных птиц отмечали низкое содержание в клетках печени гликогена, аскорбиновой кислоты. В отечной разволокненной соединительнотканной основе стромы органа располагались клеточные инфильтраты с примесью эозинофильных гранулоцитов.

Следовательно, аскаридиозная инвазия, вызванная паразитированнем половозрелых гельминтов, наряду с механическими повреждениями воспалительной, аллергической перестройкой структур слизистой оболочки кишки и печени приводила к значительным нарушениям гисто-гематических барьеров.

Эффективное нематоцидное действие испытуемого препарата проявилось на третьи сутки после применения прекращением воспалительных процессов, явлений гиперсекреции слизи, усилением митотической активности в герминативной зоне кишечных крипт (таблица 2).

Ультраструктурная реорганизация в большинстве столбчатых эпителиоцитов ворсинок проявлялась восстановлением слоя микроворсинок, уплотнением матрикса цитоплазмы, насыщением поверхности канальцев эндоплазматического ретикулума рибосомами, появлением активно функционирующих митохондрий, что отражало активизацию затрат энергии на синтетические и транспортные функции клетки.

Резкое ослабление гидратации соединительно-тканой основы собственно слизистой пластинки кишечной стенки сочеталось с уменьшением и разрежением клеточных скоплений, в первую очередь за счет эозинофильных гранулоцитов. На 9-е сутки в слизистой оболочке кишечника отмечали повышенную митотическую активность в регенераторной зоне крипт (8,42,1) (таблица 2). Прекращение гиперсекреции слизи, резкое ослабление аллергической перестройки тканей кишечника сочетались с восстановлением структуры эпителия ворсинок и исчерченной каемки и с увеличением объема ядер нейроцитов мышечно-кишечных сплетений. На 20-е сутки после дегельминтизации отмечали полное восстановление структуры кишечной стенки и прежде всего эпителиальной и соединительной тканей ворсинок и крипт. Происходило дальнейшее усиление митотической активности клеток крипт (таблица 2); полностью восстанавливалась структура мышечно-кишечных сплетений.

Воздействие испытуемого препарата оказало благоприятное действие на процессы структурной реорганизации печени. Оно проявлялось в ослаблении в начальные сроки (3 дня) и исчезновении на 9-е и 20-е сутки проявлений белкового, жирового гепатоза, в нарастании процесса полиплоидизации ядер гепатоцитов (таблица 3) и синтетической активности клеток паренхим органа.

Применение в качестве антигельминтного средства ПА показало меньшую по сравнению с действием ПОМФ терапевтическую активность На 3-и сутки после дегельминтизации у подопытных птиц в слизистой оболочке кишечника сохранялись очаги кровоизлияний, эрозии и признаки умеренно выраженного катарально-десквамативного энтерита. Ультраструктура столбчатых эпителиоцитов ворсинок характеризовалась сохранением альтеративных излияний со стороны микроворсинок, синтетических и энергообразующих структур цитоплазмы. В небольших по величине кишечных криптах незначительно увеличилась митотическая активность (2,60,3, таблица 2). Усиление метахроматической реакции на глюкозаминогликаны в стенках кровеносных сосудов, накопление эозинофильных гранулоцитов и наличие кровоизлияний в соединительнотканной основе ворсинок и крипт отражало сохранение токсико-аллергической перестройки тканей органа.

На слизистой оболочке тонкого кишечника на 9-е сутки ослабевали, а на 20-е исчезали проявления катарального воспаления. В отдельных участках слизистой оболочки кишечника на 9-е сутки сохранялись единичные кровоизлияния и очаги эрозии. Гистологические изменения в кишечных ворсинках характеризовались неравномерной протяженностью. деформированностью и отеком соединительнотканной основы преимущественно в их апикальной зоне. Полное восстановление структуры исчерченной каемки, столбчатых эпителиоцитов и соединительно-тканой основы ворсинок происходило только на 20-е сутки. Репаративные процессы в эпителии увеличивающихся кишечных крипт проявлялись возрастанием митотической активности клеток и составляли на 9-е сутки 3,40,68, а на 20-е - 8,52,6 митоза в одной крипте (таблица 2). На 9-е сутки после дегельминтизации в соединительнотканой основе ворсинок большинства крипт и подслизистой основе кишечника сохранялись признаки аллергической перестройки в виде мукоидного набухания стенки кровеносных сосудов, разволокнения и отека ретикулярной основы и инфильтрации ее эозинофильными гранулоцитами.

Ганглиозные клетки мышечно-кишечных нервных сплетений даже на 20-е сутки сохраняли признаки атрофии, а их нервные отростки по-прежнему оставались истонченными.

В печени подопытных птиц во все сроки эксперимента сохранялись проявления умеренно выраженной белковой и жировой дистрофии. сопровождаемые явлениями холестаза. Меньший уровень роста показателей кариометрии (таблица 3) ядер гепатоцитов в сочетании с пониженным содержанием в них эухроматина в ядрах отражало замедление темпов полиплоидизации по сравнению с показателями у птиц, подвергшихся дегельминтизации ПОМФ. Сравнительно низкие показатели синтетической активности в гепатоцитах на 3-9-е сутки у птиц, подвергшихся лечению ПА-ом, свидетельствовали о сохранении в эти сроки токсического влияния на печень не только паразитов, но и самого препарата.

Исследования токсичности пиперазиновой соли бис(оксиметил)фосфиновой кислоты, проведенные на мышах, крысах, цыплятах, показали, что пероральное введение препарата в дозах до 40 г/кг не вызывало гибели этих животных.

Производственные испытания влияния пиперазиновой соли бис(оксиметил)фосфиновой кислоты на яйценоскость спонтанно больных кур-несушек (300 голов) по сравнению с пиперазин адипинатом и авертином показали, что снижение яйценоскости за 10 дней после применения в случае ПОМФ оставило 6,6%, в случае ПА - 12,1%, в случае авертина - 32%.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют, что пиперазиновая соль бис(оксиметил)фосфиновой кислоты (ПОМФ) помимо более высокой терапевтической эффективности по сравнению с применяемыми в настоящее время препаратами пиперазинового ряда не оказывает токсического и местного реактогенного действия на организм больных животных, не снижает их продуктивности и способствует более быстрому выздоровлению. Предлагаемое соединение расширяет арсенал применяемых антгельминтных средств.