способ получения биологически активных веществ, обладающих антиагрегационным и гипотензивным действием

Формула изобретения

Способ получения средства, обладающего антиагрегационной и гипотензивной активностью, включающий экстрагирование растительного сырья - надземной части с корнями марьянника лугового - 50%-ным этиловым спиртом в присутствии карбоната кальция при нагревании на кипящей водяной бане в соотношении растительный материал : экстрагенг 1 : 10, три раза по 60 мин, упаривание объединенных извлечений, хроматографическое разделение на полиамидном сорбенте с использованием последовательно воды и 50%-ного этилового спирта, упаривание спиртовой фракции в вакууме до сухого остатка.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской и химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в медицине при разработке лекарственных средств с антиагрегационной и гипотензивной активностью.

Одной из актуальных проблем медицинской науки и практического здравоохранения является профилактика и лечение заболеваний крови и сердечно-сосудистой системы. Социальная значимость этой проблемы обусловлена широким распространением и тяжестью заболеваний. В связи с этим, поиск и разработка новых лекарственных средств и субстанций из растительного сырья, обладающих малой токсичностью, является актуальной задачей.

Среди дикорастущих растений, влияющих на сердечно-сосудистую систему, выделяются виды семейства Норичниковые - наперстянка крупноцветковая (Digitalis grandiflora Mill. ), очанка Ростковиуса (Euphrasia rostkoviana Hayne), льнянка обыкновенная (Linaria vulgaris Mill.), марьянник луговой (Melampyrum pratense L. ). Они широко используются как в научной, так и в народной медицине, гомеопатии, ветеринарии [1]. Несмотря на широкое распространение данных видов, на территории России большинство из них не образует плотных зарослей, пригодных для промышленного использования, и только марьянник луговой имеет достаточную сырьевую базу. Он широко распространен в центральных и северных районах России в зоне хвойных и смешанных лесов, образует обширные заросли. Надземная часть марьянника лугового издавна применяется в качестве эффективного седативного, гипотензивного, нейролептического средства [2, 3]. Из нее готовятся водные извлечения (настои и отвары), спиртовые извлечения (настойки), но они содержат довольно низкое количество биологически активных веществ [Таблица 1].

Фитохимический анализ надземной части с корнями марьянника лугового позволил установить наличие в ней таких биологически активных веществ, как флавоноиды (лютеолин, цинарозид), иридоиды (аукубин), фенолкарбоновые кислоты (хлорогеновая, кофейная), алкалоиды, полисахариды [4, 5], которые принимают участие в комплексном фармакологическом действии.

Из способов получения комплексных природных продуктов, оказывающих антиагрегационное действие в отношении тромбоцитов, известен метод получения сухого экстракта льнянки обыкновенной, которая также относится к семейству Норичниковых. Он заключается в длительной экстракции биологически активных веществ водно-спиртовой смесью (30 дней), замораживании экстракта в криогенном сублимационном аппарате КС-30 при температуре (-25^oС)-(-30^oС), высушивании в две стадии в условиях вакуума 40-60 мм рт.ст. при температуре +36-38^oС [6].

Этот способ целесообразно принять за прототип вследствие наличия общих операций, сходного вида биологической активности, ботанического родства сырьевых источников.

Прототип имеет следующие недостатки:

трудоемкость способа получения, связанная с необходимостью использования специального оборудования для криогенной сублимационной сушки;

длительность способа получения (около 30 дней);

отсутствие параметров стандартизации и возможности контроля качества продукта;

сырьевой источник препарата Linaria vulgaris L. не образует плотных зарослей, что затрудняет заготовку сырья и ограничивает возможности промышленного получения препарата;

отсутствие в препарате гипотензивной активности;

биологически активные вещества льнянки обыкновенной обладают сосудосуживающим действием, повышают артериальное давление, возбуждают холинреактивные системы [7], что не позволяет их использовать для разработки антиагрегационных средств с гипотензивным эффектом.

Целью изобретения является способ получения биологически активных веществ, обладающих антиагрегационным и гипотензивным действием из растительного сырья, имеющего достаточную сырьевую базу, отличающийся простотой, повышенным содержанием биологически активных веществ в продукте, отсутствием стадии криогенной сушки.

Цель достигается тем, что в качестве источника сырья используют надземную часть с корнями (трава) марьянника дугового - Melampyrum pratense L.

Воздушно-сухую траву (надземная часть с корнями) измельчают до размера частиц 10 мм и экстрагируют 3 раза по 60 минут 50%-ным этиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент 1: 10 в круглодонной колбе с обратным холодильником на кипящей водяной бане в присутствии карбоната кальция (0,5 г на 100 г сырья), нейтрализующего свободные органические кислоты, разрушающие природные гликозиды в процессе экстрагирования. Спиртовые извлечения объединяют, процеживают через ватно-марлевый тампон, спирт отгоняют, водный остаток упаривают в вакууме до объема 200 мл, смешивают с полиамидным сорбентом и вносят в хроматографическую колонку (3,580 см). Колонку последовательно промывают водой и 50%-ным этиловым спиртом, собирая отдельно спиртовую и водную фракции. Спиртовую фракцию упаривают в вакууме до получения сухого остатка (комплекс флавоноидов). Водную фракцию упаривают в вакууме до сухого остатка, который растворяют в 70%-ном этиловом спирте, при стоянии из полученного раствора выпадает аморфный осадок кремового цвета. Осадок отфильтровывают, растворяют в воде и добавляют ацетон, выпадает осадок белого цвета (комплекс полисахаридов). Спиртовый раствор после отделения осадка полисахаридов разбавляют водой до 1 литра и осаждают примеси балластных веществ избытком ацетона, фильтруют. Фильтрат последовательно пропускают через слой окиси алюминия (3,5/4 см) и полиамида (3,5/4 см), отгоняют в вакууме до сухого остатка (комплекс иридоидов).

Содержание экстрактивных веществ, сухой остаток и влажность определяют по методике ГФХЗ [8].

Анализ на содержание флавоноидов

1. Качественное обнаружение

0,05 Полученного вещества растворяют в 10 мл 40%-ного этилового спирта. К 5 мл полученного раствора прибавляют 3 мл 2%-ного раствора алюминия хлорида, появляется желтое окрашивание.

К 5 мл полученного раствора прибавляют 5 капель концентрированной хлористоводородной кислоты и 10 мг кристаллического магния, нагревают на кипящей водяной бане 3 мин, появляется оранжево-красное окрашивание (цианидиновая реакция).

2. Количественное определение флавоноидов

Около 0,05 г (точная навеска) комплекса флавоноидов помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 10 мл 50%-ным этанола и доводят объем раствора до метки 50%-ным этанолом, перемешивают (раствор А). 5 мл (точный объем) раствора А количественно переносят в мерную колбу на 50 мл, добавляют 3 мл 2%-ного раствора хлористого алюминия, доводят объем до метки 50%-ным этанолом, перемешивают. Через 30 минут измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 385 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 5 мл раствора А, доведенного 50%-ным этанолом до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухой препарат в % (Х%) вычисляют по формуле:



где E_1cм ^1% =3612,2 - удельный показатель поглощения комплекса цинарозида с хлористым алюминием при длине волны 385 нм; D - оптическая плотность исследуемого раствора; m - масса сырья в граммах; W - влажность в %.

Анализ на содержание иридоидов

1. Качественное обнаружение

0,05 г Полученного вещества растворяют в 5 мл дистиллированной воды. К 5 мл полученного раствора прибавляют 5 капель реактива Трим-Хилла (смесь, состоящая из 5 мл концентрированной хлористово дородной кислоты, 10 мл 0,2%-ного раствора сульфата меди и 100 мл ледяной уксусной кислоты), нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин, появляется синее окрашивание.

2. Количественное определение иридоидов

Проводят по реакции с реактивом Трим-Хилла по методу Грегора и Симхена [9].

Анализ на содержание полисахаридов

Качественное обнаружение

К 0,05 г препарата прибавляют 1 мл 10%-ного раствора NaOH, нагревают на кипящей водяной бане 5 минут, появляется желтое окрашивание.

К 0,05 г препарата прибавляют 1-2 мл 10%-ного соляной кислоты, кипятят в течение 1-2 мин и прибавляют 5 мл реактива Фелинга (смесь равных объемов растворов А и В. Раствор А: 34,66 г перекристаллизованного сульфата меди растворяют в воде, подкисленной 2-3 каплями разведенной серной кислоты, и разбавляют водой до 500 мл. Раствор В: 173 г натрия - калия тартрата и 50 г едкого натра растворяют в 400 мл воды, после охлаждения разбавляют водой до 500 мл), нагревают до кипения, появляется оранжево-красный осадок.

Пример: 100 г воздушно-сухой травы (надземная часть с корнями) марьянника лугового измельчают до размера частиц диаметром 10 мм, помещают в круглодонную колбу на 2 литра, прибавляют 1000 мл 50%-ного этанола и 0,5 г карбоната кальция, нагревают на кипящей водяной бане один час с обратным холодильником, охлаждают, спиртовое извлечение сливают, а процесс экстракции повторяют дважды в аналогичных условиях. Спиртовое извлечение объединяют (3 л), процеживают через ватно-марлевый тампон, спирт отгоняют, водный остаток упаривают в вакууме до объема 200 мл, смешивают с полиамидным сорбентом (50 г), полученным по методу Литвиненко В.И. [10], высушивают при температуре 40^oС и вносят в хроматографическую колонку (3.580 см), заполненную на 1/3 объема полиамидным сорбентом. Колонку последовательно промывают водой (3 л) до отрицательной реакции на иридоиды (контроль - реакция с реактивом Трим-Хилла) и 50%-ным этанолом (3 л) до отрицательной реакции на флавоноиды ( контроль - цнанидиновая реакция), собирая отдельно спиртовую и водную фракции.

Спиртовую фракцию упаривают в вакууме до сухого остатка (комплекс флавоноидов). Выход целевого продукта 0,8 г, т.е. 0,8% от количества исходного сухого сырья. Комплекс флавоноидов представляет собой темно-коричневый порошок, без запаха, слабого горького вкуса, дает качественные реакции на флавоноиды. Содержание флавоноидов в продукте 8,81%, влажность 9,46%.

Водную фракцию упаривают в вакууме до сухого остатка, который растворяют в 70% этаноле, охлаждают, при стоянии выпадает аморфный осадок кремового цвета. Осадок отфильтровывают, растворяют в 50 мл воды и добавляют 100 мл ацетона, выпадает осадок белого цвета. Осадок отфильтровывают, промывают ацетоном, высушивают (комплекс полисахаридов). Комплекс полисахаридов представляет собой белый порошок, без запаха, сладкого вкуса, дает качественные реакции на полисахариды. Выход целевого продукта 3,0 г, т.е. 3% от количества исходного сухого сырья. Влажность 0,32%.

Спиртовый раствор после отделения осадка полисахаридов разбавляют дистиллированной водой до объема 300 мл и добавляют 1,5 л ацетона. Выпавший осадок отфильтровывают. Фильтрат последовательно пропускают через слой окиси алюминия (3.54 см) и полиамидного сорбента (3,54 см), выпаривают в вакууме до сухого остатка (комплекс иридоидов). Выход целевого продукта 1,0, т.е. 1% от количества исходного сухого сырья. Комплекс иридоидов представляет собой коричневый порошок, без запаха, горького вкуса, дает качественные реакции на иридоиды. Содержание иридоидов в продукте 8,5%, влажность 7,96%.

Исследовано влияние полученных продуктов в концентрации 0,2 мг/мл на агрегацию тромбоцитов крови собак, вызванную добавлением 1 мкмоль/мл плазмы аденозиндифосфорной кислоты (АДФ). В качестве препаратов сравнения использовали сухие экстракты марьянника лугового, полученные экстракцией сырья водой и 50%-ным этиловым спиртом. Контролем служил раствор аспирина и дипиридамола в концентрации 0,2 мг/мл.

Как следует из таблицы 2, наиболее высокую антиагрегационную активность проявляет комплекс флавоноидов, процент агрегации тромбоцитов снижается на 33,3%, комплекс полисахаридов замедляет агрегацию тромбоцитов на 12%. Комплекс иридоидов и препараты сравнения (сухие экстракты марьянника) практически не обладают антиагрегационным действием. Антиагрегационная активность комплекса флавоноидов сопоставима с активностью таких лекарственных средств, как аспирин и дипиридамол. Сухой экстракт льнянки (прототип) замедляет агрегацию тромбоцитов на 50% по сравнению с аденозиндафосфатдинатриевой солью (АДФ) при добавлении 0,1 мл экстракта с 1 мкмоль АДФ на 1 мл плазмы, богатой тромбоцитами [6].

Испытают на гипогензивную активность проводились in vivo на кошках [11], в качестве препаратов сравнения использовали сухие экстракты марьянника лугового, полученные экстракцией сырья водой и 50%-ным этиловым спиртом. Контролем служил раствор папаверина гидрохлорида в дозе 3 мг/кг (0,1 ЛД₅₀). Он вызывает достоверное снижение артериального давления на 34,4% продолжительностью 2 мин. Результаты исследований приведены в таблице 3.

Установлено, что препараты сравнения (сухие экстракты марьянника лугового) в дозе 50 мг/кг не проявляют гипотензивной активности. Комплексы флавоноидов и иридоидов, (в этой же дозе), через 2 мин после введения снижают артериальное давление на 26,0 и 23,3%, а через 5 мин на 11,0 и 8,7% соответственно. Сухие экстракты марьянника оказывают гипотензивное действие в дозе 100 мг/кг. Сухой экстракт (экстрагент 50%-ный этанол) снижает артериальное давление через 2 мин на 28,2%, а сухой водный экстракт на 27,7%, через 5 мин на 15,4 и 15,6% соответственно. Комплекс полисахаридов в дозах 5, 20, 50 мг/кг не проявляет гипотензивной активности.

Источники информации

1. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование, семейства Caprifoliaceae - Plantaginaceae. - М.: Наука, 1990, 328 с.

2. Кучеров Е. В., Каримова С.Г., Лазарева Д.Н. и др. Марьянник - новое лекарственное растение // Вопросы рационального использования растительных ресурсов Южного Урала. - Уфа, 1963, с. 24-27.

3. Рабинович М.И. Влияние марьянника лугового на сердечно-сосудистую деятельность // 3-я Уральская конференция физиологов, биохимиков и фармакологов, посвященная 40-летию Удмуртской АССР. - Ижевск, 1960, с. 192-193.

4. Каримова С. Г. Действующие вещества марьянника лугового или обыкновенного (Melampyrum pratense L.) и марьянника гребенчатого (Melampyrum cristatum L.) // Дикорастущие и интродуцируемые полезные растения в Башкирии. - Уфа, 1961, вып.1, с. 137-142.

5. Галишевская Е.Е., Петриченко В.M. и др. Изучение иридоидов марьянника лугового, произрастающего на Урале. // Перспективы развития естественных наук в высшей школе. Т.1. - Пермь, 2001, с. 201-205.

6. АС 1034742 от 22.05.83; опубл. 15.08.83, БИ 30.

7. Рабинович М.И. Материалы экспериментальной и клинической фармакологии препаратов некоторых растений рода Linaria Мill.: Автореф. дисс... д-ра вет. наук. Омск, 1965, 23 с.

8. Государственная фармакопея СССР. - ХI-е изд. - М.: Медицина, т. 1, 2 (1987, 1990).

9. Grger G., Simchen P. 1967. Zur Kennis iridoider pflanzensteffe / Die Pharmazie, 22, 6, s.315.

10. Литвиненко В. И., Максютина Н.П., Колесников Д.Г. Получение полиамидного сорбента. Мед. промышленность СССР, 1962, т. 11, 3, с.40-43.

11. Березина М. П., Василевская Н.Е., Авербах М.С. и др. Большой практикум по физиологии человека и животных. Под общ. ред. Л.Л. Васильева и И.А. Ветюкова. - М.: Высшая школа, 1961, с.675.4