способ лечения млекопитающего, нуждающегося в противораковом лечении и способ получения производных 13- дезоксиантрациклина

Формула изобретения

1. Способ лечения млекопитающего, нуждающегося в противораковом лечении, отличающийся тем, что млекопитающему вводят без ограничения по суммарной кумулятивной дозе эффективное противораковое количество, по меньшей мере, одного соединения, представленного формулой I

где R₁ – Н или ОН; R₂ – Н, ОН или ОМе; R₃ – Н или ОН; R₄ - Н или ОН; R₅ – углевод или замещенный углевод.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарная кумулятивная доза превышает, по меньшей мере, в 1,5 раза дозу равной противораковой активности антрациклина, содержащего 13-кетогруппу.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве соединения используют 13-дезоксидаунорубицин.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что соединение имеет формулу

5. Способ получения производных 13-дезоксиантрациклина формулы I

где R₁ – Н или ОН; R₂ – Н, ОН или ОМе; R₃ – Н или ОН; R₄ - Н или ОН; R₅ – углевод или замещенный углевод,

отличающийся тем, что готовят раствор 13-тозилгидразонантрациклина, добавляют восстанавливающий агент, нагревают реакционную смесь в колбе с обратным холодильником, затем охлаждают, добавляют насыщенный водный раствор NaHCO₃, добавляют к реакционной смеси растворитель, представленный галогензамещенным углеводородом, фильтруют реакционную смесь, подкисляют полученный фильтрат, хроматографируют фильтрат и выделяют целевой продукт.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что посредством восстанавливающего агента 13-кетоструктуру восстанавливают до метиленовой группы.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что к раствору 13-тозилгидразонантрациклина в безводном метаноле добавляют р-толуолсульфокислоту и цианборгидрид натрия в качестве восстанавливающего агента, нагревание в колбе с обратным холодильником проводят осторожно в атмосфере инертного газа, в частности азота, в качестве растворителя к реакционной смеси добавляют хлороформ, подкисление фильтрата проводят хлористым водородом в диэтиловом эфире, хроматографию фильтрата осуществляют на колонке с силикагелем, при этом отделяют соль, элюируют гидрофобные примеси, образованные в результате разложения солей, смешанным раствором хлороформа и метанола, 13-дезоксиантрациклиновые продукты элюируют метанолом и метанольный элюат дополнительно очищают посредством препаративной ВЭЖХ.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что восстановление проводят при рН раствора 6,5 или менее.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанное нагревание проводят при температуре приблизительно 65 - 75С.

10. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанное нагревание проводят при температуре приблизительно 68 - 72С.

11. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанное нагревание проводят при температуре до приблизительно 75С.

12. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанное нагревание проводят в отсутствие кислорода.

13. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанное нагревание проводят в отсутствие воды.

14. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанное нагревание проводят в атмосфере азота.

15. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанный продукт получают с выходом приблизительно 70 - 80%.

16. Способ по п.5, отличающийся тем, что растворяют гидрохлорид 13-тозилгидразондоксорубицина и р-толуолсульфокислоту в безводном метаноле, добавляют к раствору цианборгидрид натрия, нагревают реакционную смесь до температуры приблизительно 68 - 72С, осторожно нагревают полученный раствор в колбе с обратным холодильником в течение приблизительно одного часа в атмосфере азота, реакционную смесь концентрируют и охлаждают в замораживателе до температуры приблизительно 0 - 4С, добавляют насыщенный водный раствор бикарбоната натрия к реакционной смеси, добавляют хлороформ, безводный сульфат натрия, отфильтровывают соли, образованные в результате добавления безводного сульфата натрия после встряхивания, подкисляют фильтрат хлористым водородом в диэтиловом эфире, пропускают раствор через колонку с силикагелем, далее промывают колонку хлороформом/метанолом до тех пор, пока элюат не станет бесцветным, элюируют метанолом фракции, содержащие продукт, упаривают метанольный элюат, растворяют осадок, полученный после упаривания, в 30%-ном растворе ацетонитрила в аммоний-формиатном буфере, выделяют продукт препаративной ВЭЖХ с использованием колонки, содержащей фенильные группы, отделяют продукт от других примесей с использованием градиента ацетонитрил/формиат аммония и лиофилизируют очищенную с помощью ВЭЖХ фракцию с получением 13-дезоксидоксорубицина гидрохлорида, определенного общей формулой I, в которой R₁ - H; R₂ - ОМе; R₃ - ОН; R₄ – ОН; R₅ –

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение касается производных 13-дезоксиантрациклина как производных, которые не проявляют кардиотоксические побочные эффекты, и способов получения данных производных 13-дезоксиантрациклина.

Уровень техники

Антрациклины обладают самым широким спектром активности в отношении форм рака человека в сравнении со всей остальной химиотерапией рака. Наиболее хорошо известными антрациклиновыми противораковыми лекарственными веществами являются доксорубицин и даунорубицин, которые содержат 13-кетогруппу. Среди указанных лекарственных веществ доксорубицин, описанный в патенте США № 3590028, имеет широкий спектр противоракового применения в качестве одного из наиболее эффективных лекарственных веществ при саркомах и карциномах в дополнение к лейкозам, лимфомам и массивным опухолям.

Близкий структурный аналог, даунорубицин, описанный в патенте США № 3616242, не является эффективным при саркомах и карциномах и данное различие, по-видимому, обусловлено отсутствием группы 14-ОН в молекуле даунорубицина. Однако даунорубицин применяют при лечении острых лейкозов.

Тем не менее, кумулятивная кардиотоксичность ограничивает применение данных лекарственных веществ. В этом плане кардиотоксичность обыкновенно ограничивает продолжительность лечения доксорубицином до приблизительно 9 месяцев при обычныхдозах. Суммарная кумулятивная доза доксорубицина или даунорубицина обычно не может превышать 550 мг/м² (см. статью Е.А.Lefrak и соавт., Cancer, 32:302, 1973). Даже при рекомендованной максимальной суммарной кумулятивной дозе или около нее (430-650 мг/м²) у 60% пациентов имеется значительная и постоянная сердечная дисфункция и у 14% развивается застойная сердечная недостаточность (см. статью A. Dresdale и соавт., Cancer, 52:51, 1983). Таким образом, при использовании данных лекарственных веществ для ингибирования роста раковых опухолей пациент может умереть от застойной сердечной недостаточности вследствие сильного кардиотоксического побочного эффекта лекарственных веществ.

Кроме кардиотоксических эффектов самих соединений известные процессы получения антрациклиновых соединений имеют относительно низкие выходы порядка приблизительно 30% (см. статью Smith и соавт., J. Med. Chem., 21:280-283, 1978).

Успешное действие доксорубицина при ликвидации опухолей и ограничения его клинического применения явилось основой для исследователей всего мира в попытках создания улучшенного доксорубицина. В этом плане существовала давняя ощутимая необходимость в аналоге доксорубицина, у которого отсутствовали бы ограничения по кумулятивной необратимой кардиотоксичности. Несмотря на то, что в течение последних более чем 25 лет было синтезировано более 2000 аналогов, ни один из них не обеспечивал существенного преимущества относительно доксорубицина (см. работу R.D. Weiss. Антрациклины. Будет ли когда-нибудь найден улучшенный доксорубицин? (The anthracyclines: Will we ever find a better doxorubicin?), Seminars in Oncology, 19:670-686, 1992).

В последние более чем 25 лет были проведены обширные исследования по выяснению механизма кардиотоксичности антрациклинов. Популярной теорией, которая была разработана, является свободно-радикальная теория. Согласно данной теории кардиотоксичность антрациклинов является результатом образования свободных радикалов хиноновой структурой молекулы антрациклина (см. статьи J. Dorowshow и соавт., J. Clin. Invest., 68:1053, 1981; D.V.Unverferth и соавт., Cancer Treat. Rev., 9:149, 1982; J. Goodman и соавт., Biochem. Biophys. Res. Commun., 77:797, 1977; J.L.Zweier, J. Biol. Chem, 259:6056, 1984).

Однако данная теория не подтвердилась, поскольку не удалось предотвратить кумулятивную кардиотоксичность с помощью ловушек свободных радикалов и антиоксидантов (см. работы D. Ргоррег и Е. Maser, Восстановление карбонила даунорубицина в печени и сердце кролика (Carbinyl reduction of daunorubicin in rabbit liver and heart), Pharmacology and Toxicology, 80:240-245, 1997; J.F.VanVleet и соавт., Am. J. Pathol., 99:13, 1980; D.V.Unverferth и соавт., Am. J. Cardiol., 56:157, 1985; С. Myers и соавт., Seminars in Oncology, 10:53, 1983; R.H.M. Julicher и соавт., J. Pharm. Parmacol., 38:277, 1986 и Е.А.Porta и соавт., Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol., 41:125, 1983).

Другими словами было обнаружено, что ингибирование образования свободных радикалов не устраняет кардиотоксичность данных антрациклинов (см. статью P.S.Mushlin и соавт., Fed. Proc., 45:809, 1986). Dr. Richard D. Olson и Dr. Phillip S. Mushlin последние 15 лет посвятили изучению механизма антрациклининдуцированной кардиотоксичности и разработали "теорию метаболитов", которая, как ожидается, теперь станет превалирующей теорией (см. работу R.D.Olson и P.S.Mushlin, Кардиотоксичность доксорубицина. Анализ превалирующих гипотез (Doxorubicin cardiotoxicity: Analysis of prevailing hypotheses), FASEB Journal, 4:3076-3086, 1990). Согласно данной теории кардиотоксичность антрациклинов опосредуется 13-ОН-метаболитом исходного соединения.

Данное исследование показывает, что кардиотоксичность доксорубицина и даунорубицина, проявляющаяся как уменьшение сократимости миокарда, зависит от метаболического восстановления 13-кетоструктуры до 13-дигидрометаболита. В тест-системах, где доксорубицин не метаболизируется в значительной степени до 13-дигидросоединения, кардиотоксические эффекты наблюдаются только при очень высоких концентрациях (200-400 мкг/мл) (см. статьи P.S.Mushlin и соавт., Fed. Proc., 44:1274, 1985; R.D.Olson и соавт. Fed. Proc., 45:809, 1986).

Если доксорубицину позволяют оставаться в тест-системах даже в течение коротких периодов времени, происходит некоторое метаболическое превращение и образуется 13-дигидрометаболит в достаточном количестве для того, чтобы начинала развиваться кардиотоксичность (см. статьи L. Rossini и соавт., Arch. Toxicol. suppl., 9:474, 1986; M. Del Tocca и соавт., Pharmacol. Res. Commun., 17:1073, 1985). Таким образом, накоплены фактические доказательства того, что кардиотоксичность таких лекарственных веществ, как доксорубицин и даунорубицин, является результатом сильных кардиотоксических эффектов, оказываемых их 13-дигидрометаболитами (см. статьи Р. Mushlin и соавт., Rational Drug Therapy, 22:1, 1988; S. Kuyper и соавт., FASEP Journal, 2:A1133, 1988; R. Boucek и соавт., J. Biol. Chem., 262:15851, 1987 и R. Olson и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:3585, 1988).

В противоположность вышеизложенному 13-дигидрометаболиты доксорубицинол и даунорубицинол вызывают кардиотоксичность в тех же самых тест-системах при относительно низких концентрациях (1-2 мкг/мл, R.D.Olson и соавт., Proceed. Am. Assoc. Cancer Res., 26:227, 1985; R.D. Olson и соавт., Proceed. Am. Assoc. Cancer Res., 28:441, 1987).

В свете вышеизложенного доксорубицин под действием внутриклеточной карбонилредуктазы превращается в доксорубицинол, в котором 13-кетогруппа восстановлена до спирта, как показано ниже:

Данная теория предлагает объяснение отсроченной природы кардиотоксичности антрациклинов. Недавно вышел обзор исследований Olson и Mushlin и показан ряд точек зрения (D. Рrорреr и Е. Maser, Восстановление карбонила даунорубицина в печени и сердце кролика (Carbonyl reduction of daunorubicin in rabbit liver and heart, Pharmacology and Toxicology, 80:240-245, 1997).

Например, исследования подтверждают наличие прямой связи между внутрисердечным накоплением С 13-спиртового метаболита и нарушением как сократимости, так и расслабления сердечной мышцы. Кроме того, при регулярном длительном введении доксорубицина его 13-спиртовой метаболит, доксорубицинол, селективно накапливается в сердечной ткани крысы или кролика. Исследования дополнительно демонстрируют, что кардиотоксический эффект даунорубицинола in vitro значительно превышает кардиотоксический эффект исходного лекарственного вещества.

Более того, исследования показывают, что доксорубицинол был в 30 раз более активным, чем доксорубицин при ингибировании сердечной сократимости в папиллярных мышцах кролика. Более того, исследования продемонстрировали, что механизм сердечной дисфункции связан с ингибированием АТФазы, поскольку доксорубицинол, но не доксорубицин является сильным ингибитором Са²⁺- Мg²⁺-АТФазы саркоплазматического ретикулюма, Мg²⁺-АТФазы митохондрий и Na⁺-K⁺-ATФaзнoй активности сарколеммы. Кроме того, даунорубицинол, но не даунорубицин был обнаружен в сердечной ткани через два дня после введения даунорубицина в исследованиях на животных.

Недавно механизм, лежащий в основе индуцируемой спиртовыми метаболитами антрациклинов кардиотоксичности, был объяснен в работе Minotti и соавт. Вторичный спиртовой метаболит доксорубицина необратимо инактивирует аконитазу/железорегуляторный белок-1 в цитозольных фракциях миокарда человека (The secondary alcohol metabolite of doxorubicin-1 irreversibly inactivates aconitase/iron regulatory protein-1 in cytosolic fractions from human myocardium), FASEB Journal, 12, в печати, 1998. Minotti и соавт. продемонстрировали, что доксорубицинол, но не доксорубицин нарушает метаболизм железа и необратимо инактивирует железорегуляторный белок-1 (IRP-1). В результате этого железо становится недоступным для ферментов, которым необходимо железо. Инактивация данных ферментов приводит к кардиотоксичности.

С данными открытиями согласуется факт использования хелатора дексразоксана для снижения кардиотоксичности доксорубицина (см. статью G. Weiss и соавт., Модуляция экспрессии рецептора трансферрина с помощью дексразоксана (ICRF-187) посредством активации железорегуляторного белка (Modulation of transferrin receptor expression by dexrazoxane (ICRF-187) via activation of iron regulatory protein, Biochemical Pharmacology, 53:1419-1424, 1997). Дексразоксан, по-видимому, стимулирует активность IRP-1, который противодействует эффекту доксорубицинола.

Olson и Mushlin сформулировали идею, заключающуюся в том, что аналог 13-кетоантрациклина, который не может образовывать спиртовой метаболит, не должен быть кардиотоксичным. Наиболее привлекательной возможностью было восстановление 13-кетогруппы до метиленовой группы. Не имеется известных ферментов, которые будут метаболизировать данную группу до спирта. Результаты, полученные с антрациклином акларубицином, согласовывались с данной идеей.

Акларубицин имеет множество модификаций по сравнению с доксорубицином, включая отсутствие 14-ОН-группы. Данное лекарственное вещество не было эффективным в отношении сарком или карцином, что согласуется с отсутствием 14-ОН-группы. Однако оно было эффективным в отношении острых лейкозов. Акларубицин также не содержит 13-кетоструктуры, но при этом включает 13-метиленовую группу.

Данное лекарственное вещество коммерчески используют во Франции и Японии. У акларубицина, по-видимому, отсутствует необратимая кумулятивная кардиотоксичность. Пациенты получали до 3,000 мг/м² при отсутствии проявлений сердечной дисфункции или кардиомиопатии (см. статью D.C. Case и соавт. Фаза II исследований акларубицина при остром миелобластном лейкозе (Phase II study of aclarubicin in acute myeloblastic leukemia, American Journal of Clinical Oncology, 10:523-526, 1987). Специалисты в данной области не имели правильных представлений об отсутствии кардиотоксичности акларубицина и некорректно предположили, что данный эффект обусловлен его распределением и фармакокинетикой. Однако Olson и Mushlin считали это подтверждением важности отсутствия 13-кетоструктуры для кардиотоксичности.

На фигуре 1 представлена схема, которая иллюстрирует путь, приводящий к кардиотоксичности.

Сущность изобретения

Целью данного изобретения является получение доказательств того, что производные 13-дезоксиантрациклина не проявляют кардиотоксичность.

Другим объектом данного изобретения является разработка усовершенствованных способов получения таких производных 13-дезоксиантрациклина.

Следующим объектом данного изобретения является получение предшественников определенных производных 13-дезоксиантрациклина и способы получения предшественников.

В соответствии с данными и другими целями и преимуществами, объекты данного изобретения представляют производные 13-дезоксиантрациклина, имеющие формулу I:

где R¹ - Н или ОН; R² - Н, ОН или ОМе; R³ - Н или ОН; R⁴ - Н или ОН и R⁵ -углевод или замещенный углевод. Настоящее изобретение также представляет фармацевтически приемлемые соли соединений формулы I. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, полученные из фармацевтически приемлемых неорганических и органических кислот и оснований. Примеры подходящих кислот включают хлористоводородную (соляную), бромистоводородную, серную, азотную, перхлорную, фумаровую, яблочную, фосфорную, гликолевую, молочную, салициловую, янтарную, толуол-р-сульфоновую, винную, уксусную, лимонную, метансульфоновую, муравьиную, бензойную, малоновую, нафталин-2-сульфоновую, трифторуксусную и бензолсульфоновую кислоты. Соли, полученные из соответствующих оснований, включают щелочи, такие как натриевая и аммиачная.

Объект настоящего изобретения также представляет способы лечения млекопитающего-хозяина, которому требуется противораковое лечение. Эффективное противораковое количество, по меньшей мере, одного соединения формулы I, приведенной ниже, вводят хозяину в эффективном количестве.

где R¹ - Н или ОН; R² - Н, ОН или ОМе; R³ - Н или ОН; R⁴ - Н или ОН и R⁵ -углевод или замещенный углевод.

Другие объекты данного изобретения представляют способ получения производных 13-дезоксиантрациклина. Способ включает образование кислого раствора 13-тозилгидразонантрациклина с цианборгидридом в качестве восстанавливающего агента. Раствор осторожно нагревают в колбе с обратным холодильником. Реакционную смесь охлаждают. К раствору добавляют насыщенный водный NаНСО₃, а затем растворитель, представленный галогензамещенным углеводородом. Смесь фильтруют. Фильтрат подкисляют. Фильтрат подвергают препаративной хроматографии для выделения производных 13-дезоксиантрациклина.

Кроме того, целью данного изобретения является преодоление вышеописанных недостатков известных процессов получения производных 13-дезоксиантрациклина.

Соответственно другим объектом данного изобретения является разработка усовершенствованных способов получения производных 13-дезоксиантрациклина, которые обеспечивают повышенный выход по сравнению с известными процессами.

Согласно этому дальнейшие аспекты данного изобретения представляют способ получения производных 13-дезоксиантрациклина.

В общем виде антрациклины имеют формулу I,

в которой R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ такие, как описано выше. Антрациклины легко превращаются в 13-тозилгидразоны в соответствии с известными способами. 13-тозилгидразоны антрациклинов восстанавливают до производных 13-дезоксиантрациклина цианборгидридом натрия в кислых условиях. Продукты очищают препаративной хроматографией без стадий экстракции. Было показано, что способы имеют выход от приблизительно 70% до приблизительно 80%.

Дополнительные объекты данного изобретения представляют способ получения производных 13-дезоксиантрациклина. Способ включает образование кислого раствора 13-тозилгидразонантрациклина с цианборгидридом. Раствор осторожно нагревают в колбе с обратным холодильником. Реакционную смесь охлаждают. К раствору добавляют насыщенный водный раствор NаНСО₃, а затем растворитель, представленный галогензамещенным углеводородом. Смесь фильтруют. Фильтрат подкисляют, Фильтрат подвергают препаративной хроматографии для выделения производных 13-дезоксиантрациклина.

Следующие объекты данного изобретения представляют способ получения производных 13-дезоксиантрациклина. Способ включает получение раствора путем растворения приблизительно 1 г гидрохлорида 13-тозилгидразондоксорубицина и приблизительно 2,4 г р-толуолсульфокислоты в приблизительно 50 мл безводного метанола. В раствор добавляют приблизительно 0,8 г цианборгидрида натрия. Раствор нагревают до температуры от приблизительно 68С до приблизительно 72С. Раствор осторожно кипятят в колбе с обратным холодильником в течение приблизительно одного часа под атмосферой азота. Реакционную смесь концентрируют до приблизительно 20 мл. Реакционную смесь охлаждают в замораживателе до температуры от приблизительно 0С до приблизительно 4С. Приблизительно 2 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия добавляют в реакционную смесь. В реакционную смесь добавляют приблизительно 200 мл хлороформа. В реакционную смесь добавляют безводный сульфат натрия. Соли отфильтровывают. Фильтрат подкисляют хлоридом водорода в диэтиловом эфире. Раствор пропускают через колонку с силикагелем. Затем колонку промывают хлороформом/метанолом до тех пор, пока элюат не станет бесцветным. Фракцию, содержащую продукт, элюируют метанолом. Метанольный элюат выпаривают. Остаток, полученный при выпаривании, растворяют в 30% ацетонитриле в аммоний-формиатном буфере. Продукт выделяют препаративной ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), используя колонку, содержащую фенильные группы. Продукт отделяют от других примесей, используя градиент ацетонитрила/формиата аммония. Фракцию, очищенную с помощью ВЭЖХ, затем лиофилизируют, получая приблизительно 600 мг 13-дезоксидоксорубицина гидрохлорида.

Перечень чертежей и иных материалов

На фиг.1 представлена схема, иллюстрирующая пути биосинтеза, приводящие к кардиотоксичности.

На фиг.2 приведен график, представляющий концентрацию доксорубицинола в препаратах правого предсердия и желудочка, инкубированных в 175 мкМ варианта соединения, соответствующего данному изобретению, или доксорубицина в зависимости от времени.

На фиг.3 приведен график, представляющий поглощение [³H]-тимидина клетками HL-60 в присутствии варианта соединения, соответствующего данному изобретению, или доксорубицина и показывающий ингибирование роста клеток.

На фиг.4 приведен график, представляющий поглощение [³H]-тимидина клетками Р388 в присутствии варианта соединения, соответствующего данному изобретению, или доксорубицина и показывающий ингибирование роста клеток.

На фиг.5 приведен график, представляющий поглощение [³H]-тимидина клетками MCF7 в присутствии варианта соединения, соответствующего данному изобретению, или доксорубицина и показывающий ингибирование роста клеток.

На фиг.6 приведен график, представляющий поглощение [³H]-тимидина клетками MDA-MB-231 в присутствии варианта соединения, соответствующего данному изобретению, или доксорубицина и показывающий ингибирование роста клеток.

На фиг.7 приведен график, иллюстрирующий эффект Соединения В, соответствующего данному изобретению, и даунорубицина на сократительную функцию.

На Фигурах 8.1, 8.2 и 8.3 представлены соответственно микрофотографии при 200х увеличении, иллюстрирующие гистопатологию ткани левого желудочка, полученной у кроликов, которых лечили в течение 20-23 недель вариантом соединения, соответствующего данному изобретению, кроликов, которых лечили доксорубицином, или контрольного образца и показывающие вакуолизацию миоцитов и потерю миофибрилл в образце с использованием доксорубицина, не отмечаемую при использовании Соединения А, соответствующего данному изобретению, или в контрольных образцах.

На Фигурах 9-13 приведены графики, представляющие процент выживания мышей, больных лейкемией, при введении им соединений, соответствующих изобретению, в различных дозах.

На Фигурах 14-20 приведены графики и диаграммы, отражающие показатели состояния кроликов при изучении на данных моделях кардиотоксичности доксорубицина, GPX-150 и GPX-100.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В данном изобретении используется тот факт, что 13-дезоксиформы доксорубицина, даунорубицина и других подобных антрациклинов не будут метаболически превращаться в кардиотоксические 13-дигидроформы, представляя таким образом возможность введения соединений, соответствующих данному изобретению, в некардиотоксических количествах без ограничения суммарной кумулятивной дозы.

Данное изобретение включает улучшенный доксорубицин, имеющий формулу А:

далее обозначаемый как Соединение А.

Улучшенное Соединение А было синтезировано из доксорубицина путем восстановления 13-кетоструктуры до метиленовой группы. Эксперименты in vitro продемонстрировали, что улучшенное Соединение А не метаболизировалось сердечной тканью до доксорубицинола в тех же условиях, при которых доксорубицин превращался в данный метаболит.

В нижеописанных экспериментах in vitro исследовали биотрансформацию улучшенного доксорубицина, соответствующего данному изобретению. Целью исследования было установить, метаболизируется ли Соединение А, соответствующее данному изобретению, до С-13 гидроксиметаболита в изолированных препаратах сердечной мышцы кролика. Доксорубицин, доксорубицинол и Соединение А тестировали на полосках наружной стенки правого предсердия и правого желудочка, выделенных у новозеландских белых кроликов, с использованием методик на основе флуоресцентной ВЭЖХ. Тонкие полоски предсердия и желудочка инкубировали в ванночках для мышц (30С), содержащих оксигенированный бикарбонатный буфер Кребса. Доксорубицин (175 мкМ) или Соединение А (175 мкМ) добавляли в ванночки и удаляли из них полоски предсердия или желудочка с интервалами 30 минут в течение 210 минут. Каждую полоску быстро промывали в нормальном физиологическом растворе, высушивали промоканием, разрезали пополам и взвешивали. Ткани хранили во флаконах при -70С для определения тканевых концентраций доксорубицина, доксорубицинола и Соединения А. Тканевые концентрации доксорубицина, доксорубицинола и Соединения А определяли по стандартным кривым в трех независимых экспериментах и выражали как среднее значение ±SEM (стандартная ошибка). Было отмечено времязависимое повышение концентрации Соединения А и доксорубицина в предсердии и желудочке. Через 210 минут инкубирования между концентрациями Соединения А и доксорубицина (нг/мг сырой массы) в ткани предсердия не было значительных различий (Соединение А: 743±89; доксорубицин: 617±35). Концентрации Соединения А в желудочке были значительно выше, чем концентрации доксорубицина в желудочке через 210 минут инкубирования (Соединение А: 626±31; доксорубицин: 407±30; Р<0,05). Однако только доксорубицин метаболизировался до С-13-гидроксиметаболита доксорубицинола. Никакой метаболизм Соединения А не был определен. Данные эксперименты указывают, что Соединение А не образует С-13-гидроксиметаболит в изолированных сердечных препаратах.

Целью исследования было определить, метаболизируется ли Соединение А до С-13-гидроксиметаболита в изолированных препаратах сердечной мышцы кролика.

Тесты проводили с использованием Соединения А, соответствующего данному изобретению, и доксорубицина.

Анализы выполняли с использованием целого желудочка кролика, ткани правого и левого предсердия, наружной стенки правого желудочка, бикарбонатного буфера Кребса (рН 7,4), нормального (0,9%) физиологического раствора, (NH₄)₂SO₄, изопропилового спирта, хлороформа, даунорубицина, доксорубицина, доксорубицинола и метанола.

Протокол теста включал инкубирование тонких полосок (каждая по 80-100 мг) наружной стенки правого желудочка и предсердия NZW (новозеландских) кроликов в ванночках для изолированных мышц (30С), содержащих оксигенированный бикарбонатный буфер Кребса (рН 7,4) следующего состава: 127 мМ NaCl, 2,5 мМ СаСl₂, 2,3 мМ KCl, 25 мМ NаНСО₃, 1,3 мМ KH₂PO₄, 0,6 мМ MgSO₄ и 5,6 мМ глюкоза, как было опубликовано ранее (см. статью P.S. Mushlin и соавт., Br. J. Pharmacol., 110:975-982, 1993).

В соответствии с синтезом доксорубицинола доксорубицинол синтезировали способом Takanashi и Bachur (см. статью S. Takanashi и N.R.Bachur, Drug Metab. Disp., 4:17-87, 1976) с незначительной модификацией (см. статью P.S.Mushlin и соавт., Br.J.Pharmacol., 110:975-982, 1993).

Согласно статистическому анализу результатов экспериментов концентрации в тканях (нг/мг сырой массы) доксорубицина, доксорубицинола и Соединения А определяли в трех различных экспериментах и выражали как среднее значение ±SEM (стандартная ошибка). Двухфакторный анализ (ANOVA) использовали для оценки эффектов лечения при различных интервалах времени с помощью программы Prizm (GraphPad).

Результаты наблюдений и исследований включают наблюдение времязависимого повышения концентрации Соединения А и доксорубицина в тканях наружной стенки как предсердия (таблица 1), так и правого желудочка кролика (таблица 2) (фигура 1). Концентрации Соединения А как в предсердиях, так и в желудочках были равны или превышали концентрации доксорубицина в предсердиях и в желудочках. Однако только доксорубицин метаболизировался до С-13-гидроксиметаболита доксорубицинола и времязависимая кумуляция доксорубицинола наблюдалась в тканях как предсердия (таблица 1), так и желудочка (таблица 2) кролика (фигура 2). Никакой метаболизм Соединения А не был отмечен (фигура 2).

На основании обсуждения и выводов из экспериментов заключают, что результаты экспериментов показывают, что Соединение А не образует С-13-гидроксиметаболит в изолированных препаратах сердца кролика. Однако доксорубицин, структурно близкое соединение, метаболизировалось до доксорубицинола, С-13-гидроксиметаболита. Кроме того, результаты экспериментов указывают на то, что метаболизм доксорубицина до доксорубицинола, по-видимому, выше в ткани предсердия, чем желудочка.

Фиг.2 иллюстрирует концентрацию доксорубицинола в препаратах правого предсердия (А) и желудочка (V), инкубированных в 175 мкМ Соединения А, соответствующего данному изобретению, или доксорубицина в течение времени. Как можно видеть из фиг.2, соединение, соответствующее данному изобретению, присутствует в значительно более низких концентрациях по сравнению с известным доксорубицином.

Другие исследования in vitro показали, что Соединение А, соответствующее данному изобретению, обладало такой же эффективностью, как доксорубицин при ингибировании роста раковых клеток человека.

В экспериментах, демонстрирующих эффективность соединения, соответствующего данному изобретению, в плане ингибирования роста раковых клеток сравнивали эффекты Соединения А, соответствующего данному изобретению, и доксорубицина на пролиферацию клеток in vitro.

Согласно экспериментам, демонстрирующим эффективность соединения, соответствующего данному изобретению, антипролиферативный эффект Соединения А сравнивали с доксорубицином на культивируемых клеточных линиях, полученных из человеческих и мышиных лейкозных клеток (HL60 и Р388) и рака молочной железы человека (MCF7 и MDA-MB 231).

Ингибирование пролиферации раковых клеток изучали путем измерения включения в клетки [³Н]-тимидина. Антипролиферативный эффект Соединения А сравнивали с доксорубицином в одних и тех же условиях культивирования. Концентрацию, приводящую к 50%-ному максимальному ингибированию (IC₅₀), получали с помощью анализа с использованием вычерчивания эмпирической кривой. Средние значения IC₅₀ (в нМ) и 95%-ные доверительные интервалы представлены ниже. Средние значения определяли по 3 или 4 независимым анализам в трех повторностях (см. таблицу А).

Оба, Соединение А и доксорубицин, полностью прекращали включение [³H]-тимидина в клетки каждой из четырех изученных клеточных линий. Данные исследования демонстрируют, что как Соединение А, так и доксорубицин являются сильными ингибиторами пролиферации раковых клеток in vitro, хотя, как показано по соотношению значений IC₅₀ (соотношение активностей), доксорубицин был несколько более активным, чем Соединение А при ингибировании включения [³H]-тимидина в клетки всех четырех линий (Р<0,05).50) для тест-соединения в каждой из четырех клеточных линий и для сравнения данного значения со значением, полученным для доксорубицина.

Разведения тест-соединений делали в специфических для клеток средах в следующих интервалах (см. таблицу В).

Разведения вносили во все лунки в трех повторностях в виде аликвот по 50 мкл и клетки выращивали в присутствии тест-соединений в течение 24 часов.

Статистический анализ включал непарный t-критерий, где это было приемлемо. Был выбран уровень значимости Р<0,05.3H]-тимидина. Концентрации, обеспечивающие 50%-ные значения максимальных реакций получали с помощью анализа с использованием вычерчивания эмпирической кривой. Значения IС₅₀ (в нМ) представлены ниже и отражают среднее значение (95%-ные доверительные интервалы приведены в скобках) по 3-4 анализам в трех повторностях (см. таблицу С).

Результаты показывают, что Соединение А является менее активным, чем доксорубицин в плане ингибирования пролиферации клеток во всех четырех клеточных линиях in vitro. Однако оба соединения являются в равной степени эффективными.

Обсуждение и выводы из результатов исследований in vitro показывают, что как Соединение А, так и доксорубицин полностью блокируют включение [³H]-тимидина в клетки каждой из четырех изученных клеточных линий. Как показано, по соотношению значений IC₅₀ (соотношение активностей) доксорубицин был более активным, чем Соединение А при ингибировании включения [³H]-тимидина в клетки всех четырех линий (Р<0,05) (см. фиг.3-6). Данные исследования демонстрируют, что как Соединение А, так и доксорубицин представляют собой сильные ингибиторы пролиферации раковых клеток in vitro. На фиг.8.1-8.3 представлены микрофотографии, которые иллюстрируют эффекты в отношении сердечной мышцы соединения, соответствующего данному изобретению, по сравнению с известным соединением доксорубицином и контрольным образцом.

Исследования in vivo показали, что Соединение А было эффективным в плане увеличения продолжительности жизни на модели мышиного лейкоза при более низкой системной токсичности, чем у доксорубицина, как показано ниже.

Эффекты Соединения А в отношении лейкоза Р388 на мышах описаны ниже.

Самцам мышей CDF1 внутрибрюшинно инокулировали 10⁶ клеток мышиного лейкоза Р388 в день 0. В дни 1-9 мышам внутрибрюшинно вводили доксорубицин или соединение А. Ежедневно измеряли массы тел и регистрировали выживаемость. В одном из таких исследований мышам вводили доксорубицин или Соединение А в дозе 0,8 мг/кг/день. В день 22 было 0/8 выживших животных в группе, которой вводили носитель, 7/8 в группе, которой вводили доксорубицин, и 5/8 в группе, которой вводили соединение А. Значения, полученные для доксорубицина и Соединения А, существенно отличались от значений, полученных для носителя, но не друг от друга.

В другом исследовании на той же модели мышиного лейкоза доксорубицин инъецировали в дозе 0,8 мг/кг/день, а Соединение А инъецировали в дозе 1,6, 2,4 или 3,2 мг/кг/день (см. таблицу 3).

На день 19 Соединение А в дозе 1,6 мг/кг/день было настолько же эффективным, как доксорубицин в плане супрессии набора массы тела, происходящего в результате роста лейкозных клеток в сочетании с ассоциированным асцитом. Обе дозы Соединения А, 2,4 и 3,2 мг/кг/день, были более эффективными, чем доксорубицин в плане супрессии набора массы тела. На день 25 все дозы Соединения А были настолько же эффективны, как доксорубицин в плане поддержания выживания. На день 32 только Соединение А в дозе 3,2 мг/кг/день было эффективным в плане пролонгирования выживания по сравнению с носителем и доксорубицином. Доза доксорубицина, использованная в данном исследовании, является максимально эффективной дозой для данной модели. Более высокие дозы доксорубицина в действительности снижали выживаемость. Таким образом, хотя Соединение А является менее активным, чем доксорубицин, оно более эффективно при более высоких дозах, чем доксорубицин в плане увеличения продолжительности жизни.

Было также показано, что у Соединения В, 13-дезоксианалога даунорубицина, отсутствуют кардиотоксические свойства даунорубицина в отношении сократительной функции сердца in vitro на модели с использованием сердца кролика, описанной Mushlin и соавт., supra. Это проиллюстрировано на фиг.7.

Было также показано, что у Соединения В, 13-дезоксианалога даунорубицина, отсутствуют кардиотоксические свойства даунорубицина на модели in vivo на крысах, описанной ниже. Приведенное ниже обсуждение демонстрирует отсутствие кардиотоксических эффектов Соединения В, соответствующего данному изобретению, у крыс после внутривенного введения.

Даунорубицина гидрохлорид или Соединения В гидрохлорид в воде инъецировали внутривенно в дозе 5 мг/кг/день в течение трех дней с интервалом в один день (общая доза 15 мг/кг) самцам крыс Spraque Dawley. Для каждого соединения изучали группу, которой вводили только носитель. На седьмой день после введения первой дозы крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением 50 мг/кг фенобарбитала натрия. В трахею вводили трубку, и крысы дышали 100%-ным кислородом. Температуру тела поддерживали на уровне 37С с помощью нагревательной лампы и температурного датчика. Катетер помещали в правую сонную артерию и вводили в аорту с целью регистрации среднего артериального давления (САД) и частоты сердечных сокращений (ЧС), используя датчик давления Statham и регистрирующее устройство Gould. Затем катетер продвигали в левый желудочек, чтобы зарегистрировать систолическое давление в левом желудочке (ЛЖСД), максимальное значение dP/dt левого желудочка (dP/dt) и конечное диастоличекое давление в левом желудочке (КЛЖДД).

У крыс, леченных даунорубицином, MAP, ЛЖСД и dP/dt были значительно и существенно подавлены по сравнению с контролями с введением носителя (таблица 4). У крыс, леченных даунорубицином, была также значительно понижена масса тела. Напротив, MAP, ЛЖСД, dP/dt и масса тела были близкими у крыс, леченных носителем и Соединением В (таблица 5). Данные показывают, что у Соединения В отсутствует кардиотоксичность при дозе, в которой даунорубицин вызывает значительное снижение сократимости и деятельности сердца. Результаты иллюстрируют возможность введения Соединения В в терапевтической дозе без возникновения кардиотоксичности, тогда как такая же терапевтическая доза даунорубицина вызывает нарушение сердечной функции.

Значения, приведенные в таблице 4, представляют собой средние значения ± стандартные ошибки; крысам внутривенно инъецировали соединение в дозе 5 мг/кг/день в течение 3 дней с интервалом в один день; измерения проводили на день 7 после первой инъекции. BW1 = масса тела в день 0, BW2 = масса тела в день 7. *р<0,05 относительно носителя.

Крысам внутривенно инъецировали соединение в дозе 5 мг/кг/день в течение 3 дней с интервалом в один день; измерения проводили на день 7 после первой инъекции. BW1 = масса тела в день 0, BW2 = масса тела в день 7.

Соединение А также оценивали на модели кардиотоксичности при регулярном введении доксорубицина кроликам. В данной модели доксорубицин вызывал нарушение функции сердца и гистопатологические изменения, аналогичные наблюдаемым у людей при регулярном длительном лечении доксорубицином. Гистопатологическое и/или функциональное нарушения в сердце кролика наблюдались у 5/6 кроликов, леченных доксорубицином. В тех же самых условиях Соединение А не вызывало соответствующей клинической кардиотоксичности.

Некардиотоксическая природа соединения, соответствующего данному изобретению, подтверждается следующим исследованием, в котором оценивают кардиотоксичность доксорубицина и Соединения А на модели непрерывного введения на кроликах.

В соответствии с данным исследованием двадцать четыре самца новозеландских белых кроликов случайным образом разделили на четыре группы. Шести кроликам инъецировали 1 мг/кг доксорубицина в краевую ушную вену 2 раза в неделю в течение 8 недель. Шести дополнительным кроликам инъецировали 1 мг/кг Соединения А в краевую ушную вену 2 раза в неделю в течение 8 недель. Потребление корма кроликами в группах, леченных доксорубицином и леченных Соединением А, мониторировали ежедневно и такое же количество корма давали подходящим по полу и возрасту кроликам, служащим попарным контролем питания, которым инъецировали носитель (0,9% NaCl) в краевую ушную вену 2 раза в неделю в течение 8 недель. Акселерацию корня аорты мониторировали еженедельно методом допплеровской ультрасонографии (допплерографическим способом) в течение исследования. Уменьшение фракции изгнания определяли один раз в две недели М-эхокардиографией, начиная с десятой недели исследования, и продолжали в течение исследования. Кроликов безболезненно умерщвляли, начиная с 20 недели после начала исследования или, когда сокращение фракции становилось меньше чем 25% или сохранялось на уровне 25-29% в течение, по меньшей мере, 3 недель. Образцы папиллярной мышцы левого желудочка, наружной стенки левого желудочка и верхушки сердца каждого умерщвленного кролика готовились для гистологического анализа и обрабатывались гистопатологом слепым методом. Поражения классифицировали как слабые, средние или сильные на основе степени вакуолизации, дегенерации миофибрилл, воспаления, вызываемого мононуклеарными клетками, и некроза. Аномальное уменьшение фракции изгнания наблюдалось у 4/6, 0/6, 1/6 и 0/6 кроликов в леченной доксорубицином, Соединением А, контрольной для доксорубицина и контрольной для соединения А группах соответственно. Аномальная акселерация корня аорты (значения ниже чем 9 m/s/s) наблюдали у 3/6, 0/6, 0/6 и 0/6 кроликов в леченной доксорубицином, Соединением А, контрольной для доксорубицина и контрольной для соединения А группах соответственно. У всех 6 кроликов в группе, леченных доксорубицином, была аномальная гистопатология, лежащая в пределах от слабой до сильной, у 2/6 кроликов в группе Соединения А были слабые гистологические аномалии. Отсутствие гистопатологических поражений наблюдалось в сердечной ткани кроликов из обеих контрольных групп. Общий сердечный статус определяли как аномальный, когда, по меньшей мере, 2 из 3 анализов на кардиотоксичность были аномальными. При использовании данных критериев 5/6 кроликов в группе, леченной доксорубицином, имели аномальный общий сердечный статус, 0/6 имели аномалии в других 3 группах (Р<0,05, критерий точности Фишера). По сравнению с доксорубицином у Соединения А практически отсутствует кардиотоксичность на уровне тестируемых доз. Кроме того, Соединение А не имело заметного эффекта на гематологию и набор массы тела, тогда как доксорубицин значительно изменял гематологию и подавлял набор массы тела. При существующей схеме дозирования Соединение А вызывает более низкую кардиотоксичность и системную токсичность у кроликов по сравнению с доксорубицином.

Цель оценки экспериментов по кардиотоксичности заключалась в сравнении кардиотоксичности Соединения А с доксорубицином на модели регулярного введения на кроликах.

У 67% (4/6) кроликов, леченных доксорубицином, развивалось аномальное сокращение фракции левого желудочка. У трех из шести леченных доксорубицином кроликов (50%) развивалась аномальная акселерация корня аорты. Напротив, ни у одного из кроликов, леченных Соединением А, не было функционального доказательства кардиотоксичности. Наиболее чувствительным индикатором кардиотоксичности являлась гистопатология. У всех кроликов, леченных доксорубицином, появлялись гистопатологические повреждения, характеризующиеся прежде всего вакуолизацией миоцитов и потерей микрофибрилл. У четырех из шести кроликов проявлялась слабая кардиотоксичность, у 1 кролика были средние повреждения и у 1 кролика были сильные повреждения. У двух из шести кроликов, леченных Соединением А, были слабые гистопатологические повреждения (см. фигуру 8). Когда результаты всех трех анализов на кардиотоксичность были объединены, аномальный кардиологический статус наблюдался у 5 из 6 кроликов в группе, леченных доксорубицином, но у 0 из 6 кроликов в группе, леченных Соединением А (Р<0,02, критерий точности Фишера). Общий сердечный статус определяли как аномальный, если, по меньшей мере, 2 из 3 анализов на кардиотоксичность были аномальными. Во время восьмой недели исследования собирали образцы крови из краевой ушной артерии для получения формулы крови. Лечение доксорубицином вызывало значительное уменьшение белых клеток, красных клеток, тромбоцитов, гемоглобина, средней концентрации эритроцитарного гемоглобина и амплитуды распределения красных клеток по сравнению с животными, леченными носителем или Соединением А, Р>0,05. Соединение А не изменяло данные переменные величины по сравнению с носителем за исключением незначительного повышения амплитуды распределения красных клеток. Кроме того, лечение доксорубицином ингибировало набор массы тела по сравнению с лечением Соединением А. Кролики, леченные соединением А, имели массу тела 3,17±0,06 кг в начале исследования и 4,10±0,10 кг в конце исследования, тогда как кролики, леченные доксорубицином, имели массу тела 3,19±0,10 кг в начале исследования и 3,54±0,06 кг в конце исследования (Р>0,05, однофакторный анализ anova, Новый многосторонний критерий диапазона Дункана (Dunkan’s New Multiple Range test)).

Аномальную акселерацию корня аорты определяют как значения ниже 9.0. Единицами акселерации являются m/s/s. N = нормальная сердечная функция; А = аномальная сердечная функция.

Кроликам инъецировали внутривенно 1 мг/кг доксорубицина (ДОК) или Соединения А (ДОКА) 2 раза в неделю в течение 8 недель (суммарная кумулятивная доза 16 мг/кг). Подходящим по возрасту животным, служащим попарным контролем питания для группы, которой вводили доксорубицин, и группы, которой вводили Соединение А, инъецировали только носитель.

Группа, которой вводили доксорубицин, значительно отличалась от групп, которым вводили Соединение А, СХ или С (Р<0,05; 2Х2 двухфакторны и анализ сопряженности признаков с помощью хи-квадратов).

Кроликам внутривенно инъецировали 1 мг/кг доксорубицина (ДОК) или Соединения A (DPXA) 2 раза в неделю в течение 8 недель (суммарная кумулятивная доза 16 мг/кг). Подходящим по возрасту животным, служащим попарным контролем питания для группы, которой вводили доксорубицин (С), и группы, которой вводили Соединение А (СХ), инъецировали только носитель.

N = нормальная сердечная функция или гистопатология; А= аномальная сердечная функция или гистопатология. Общий сердечный статус определял и как аномальный, когда, по меньшей мере, два из трех тестов на кардиотоксичность были аномальными. Аномальное сокращение фракции определяли как тенденции или обоснованные значения в районе двадцати пяти процентилей или ниже. Аномальная акселерация аорты была определена значениями ниже 9,0 mists. Аномальную гистопатологию определяли как присутствие вакуолей, повреждений микрофибрилл и воспаление, вызываемое мононуклеарными клетками (см. обсуждение способов выше).

Гистопатологию считали нормальной, слабой, средней или сильной, как описано выше. В группе, леченной доксорубицином, было значительно больше животных с аномальным общим сердечным статусом, чем в группах, леченных Соединением А, С и СХ (Р<0,02; двухфакторный критерий точности Фишера) (см. таблицу 6).

Среди выводов на основании изучения кардиотоксичности были выводы о том, что Соединение А не изменяло сердечную функцию в данных условиях и проявляло только слабые гистопатологические эффекты у 2/6 кроликов. С другой стороны, доксорубицин изменял сердечную функцию у 5/6 кроликов и у всех кроликов отмечали аномальную гистопатологию в данной модели кардиотоксичности при хроническом введении на кроликах. По сравнению с доксорубицином у Соединения А практически отсутствует кардиотоксичность на уровне исследованных доз. Кроме того, Соединение А не обладает заметным эффектом в отношении гематологии и набора массы тела. В существующей схеме дозирования Соединение А вызывает более низкую кардиотоксичность у кроликов по сравнению с доксорубицином.

В тестах на подострую токсичность на мышах также было показано, что Соединение А вызывает более низкую токсичность в отношении костного мозга, чем доксорубицин, как показано ниже (см. таблицу 7).

Лекарственные препараты вводили внутривенно в дни 1, 5 и 9. Измерения проводили в день 15. Значения представляют собой средние значения ±SE. +=отличие от носителя, р<0,05, #=отличие от Соединения А, р>0,05. Обе дозы являются максмальными сублетальными дозами.

Результаты вышеописанных исследований ясно показывают, что Соединение А представляет собой некардиотоксическую форму доксорубицина. Поскольку Соединение А сохраняет группу 14-ОН, является возможным, что Соединение А найдет применение при лечении сарком и карцином в дополнение к лейкозам. Не ожидается существования никакой дозаограничивающей кардиотоксичности, поскольку Соединение А не образует токсический 13-спиртовой метаболит. Следовательно, Соединение А в отличие от доксорубицина может вводиться так длительно, как это необходимо для получения ремиссии и/или для предупреждения рецидивов и метастазов. В этом плане Соединение А и другие 13-дезоксиантрациклины представляют собой основной прорыв в антрациклиновой химиотерапии рака.

Сравнительная оценка кардиотоксичности доксорубицина, GPX-150 и GPX-100 на хронической модели кроликов

Описание эксперимента

Двадцать четыре белых новозеландских кролика одного возраста весом 3,0 кг разбивают случайным образом на 4 группы (N=6 кроликов/группе). В данных группах постоянно применяют соответственно доксорубицин, GPX-150, GPX-100 и простой растворитель-наполнитель (0,9% NaCl) в качестве контроля. Дозу лекарства или наполнителя вводят внутривенно (iv) в ушную вену два раза/неделю (по вторникам и пятницам). Каждую неделю (по понедельникам) отбирают пробы сыворотки и крови, а для оценки работы сердца еженедельно или через неделю (по четвергам) проводят М-эхокардиографическое обследование с получением данных фракционного сокращения левого желудочка (LVFS). Ежедневно оценивают потребление корма, а массу тела измеряют еженедельно (см. фигуру 14). Контрольные кролики получают то же количество корма, что и кролики, на которых испытывают доксорубицин (парное кормление). После забивания животных получают образцы свободных стенок верхушки сердца и левого желудочка, которые сохраняют в 4%-ном глутаральдегиде (рН 7,4) для гистологического исследования и анализа посредством световой и трансмиссионной электронной микроскопии. Образцы ткани левого желудочка получают также для оценки кардиологических уровней антрациклинов и метаболитов. Кроликов забивают при появлении кардиотоксичности (LVFS<30% или снижение LVFS на 10% единиц, т.е. с 42% до 32% LVFS), проявлениях угрозы жизни или токсичности, вызывающей слабость (т.е. при сильной миелосупрессии или мукозите), или через 13 недель после начала исследования.

Схема дозирования

Оптимальные противоопухолевые дозы GPX-100 приблизительно в два раза превышают дозы доксорубицина, в то время как оптимальные противоопухолевые дозы GPX-150 превышают оптимальные дозы доксорубицина в 4-8 раз. Таким образом, были выбраны такие дозы GPX-100 и GPX-150, которые в два раза (для GPX-100) и в 7 раз (для GPX-150) превышают кумулятивную кардиотоксическую дозу доксорубицина (17,5 мг/кг). Доксорубицин вводят в дозе 1,25 мг/кг два раза/неделю в течение 7 недель (кумулятивная доза 17,5 мг/кг), GPX-100 вводят в дозе 2 мг/кг два раза/неделю в течение 10 недель (кумулятивная доза 40 мг/кг), а GPX-150 вводят в дозе 5 мг/кг два раза/неделю в течение 12 недель (кумулятивная доза 120 мг/кг).

Результаты

Наиболее чувствительным к действию доксорубицина типом клеток крови оказались красные кровяные клетки (RBC). На фигуре 17 продемонстрировано, что контрольный уровень RBC (верхний график - Еженедельные уровни RBC) оставался стабильным на протяжении всего эксперимента. В течение двух недель после начала эксперимента по введению аналогов антрациклина уровень RBC снижается во всех группах по сравнению с контролем (фигура 17). Действие GPX-150 на RBC является средним между воздействием доксорубицина и GPX-100, однако значительно отличается от контроля на протяжении эксперимента. Величина RBC в группе, получающей дрксорубицин, возрастает через 7 недель и возвращается к значениям, соответствующим контролю, в связи с прекращением лечения доксорубицином на седьмой неделе. Воздействие GPX-100 на уровни RBC и гематокрит (НТС) продолжает снижаться на протяжении всего исследования (см. фигуру 18). К концу эксперимента два кролика, получающие GPX-100, имеют гематокрит ниже 10%, а один из кроликов этой группы умирает во время эксперимента. Хотя причина смерти остается неизвестной, одним из факторов, способствующих его гибели, могла быть анемия.

Подсчет белых кровяных клеток (WBC) показал, что их уровень в меньшей степени подвержен действию антрациклинов, чем RBC (см. фигуру 16, верхний график - Еженедельные уровни WBC). GPX-100 и GPX-150 приводят к такому снижению числа WBC, которое сходно с реакцией на действие доксорубицина. Значения антрациклиновых групп отличаются от контрольных значений между 3 и 7 неделями. Группа, получающая GPX-100, была единственной группой, леченной антрациклином, которая имела существенно более низкое число нейтрофилов, чем контрольная группа (см. фигуру 19 - Еженедельные уровни нейтрофилов).

Подводя итог, можно заключить, что при используемых в данных экспериментах дозах СРХ-100 вызывает равное или большее снижение числа кровяных клеток, чем доксорубицин. Хотя GPX-150 также подавляет число кровяных клеток по сравнению с контролем, его величина в целом занимает промежуточное значение между той же величиной в доксорубициновой и контрольной группах.

Дозы GPX-100 и доксорубицина приводят к ухудшению прибавки в весе по сравнению с контрольными кроликами. Действие доксорубицина, приводящее к замедлению прибавки веса по сравнению с контролем, нельзя обьяснтъ различиями в потреблении корма, т.к. контрольная группа кроликов и доксорубициновая группа кроликов находятся в условиях парного кормления. GPX-100 вызывает аналогичные снижение потребления корма и замедление прибавки веса в сравнении с кроликами, леченными доксорубицином. Кролики, леченные GPX-150, показывают большее потребления корма по сравнению с контрольными кроликами (поскольку контрольная и доксорубициновая группы кроликов получают парное кормление), хотя они не имеют большую прибавку в весе, чем контрольные кролики, из чего можно предположить, что GPX-150 может также вмешиваться в механизмы, связанные с прибавкой веса у кроликов.

Доксорубицин вызывает сильную токсичность, которая не наблюдается в группах, леченных GPX-100 или GPX-150. У четырех из шести кроликов, леченных доксорубицином, был сильный мукозит, у двух сильно вздулись и кровоточили рот и губы. Эти эффекты (мукозит, вздутие или кровотечение из губ) не наблюдались ни у одного из кроликов, леченных GPX-100 или GPX-150. У трех из шести кроликов, леченных доксорубицином, наблюдалось истощение скелетных мышц, а у двух - отек (задних конечностей и стенки грудной клетки). Ни у одного из кроликов, леченных GPX-100 или GPX-150, не наблюдалось истощения мускулатуры, хотя у одного кролика, леченного GPX-100, при забивании был небольшой отек стенки грудной клетки. Все кролики, леченные доксорубицином, отличаются выпадением шерсти, т.е. шерсть выпадает либо умеренно, либо очень сильно. Только у двух из пяти кроликов, леченных GPX-100, выпала шерсть, а у четырех из шести кроликов, леченных GPX-150, выпадение шерсти было значительным.

GPX-100 вводят в максимально переносимой дозе, и один из шести кроликов, леченных GPX-100, погиб в конце эксперимента и не был обследован. К концу опыта кролики, леченные GPX-100, были вялыми, с бледными ушами, носом и глазами, а 4 из 5 кроликов были холодными на ощупь. Такие симптомы не наблюдаются у других кроликов, леченных GPX-150 или доксорубицином.

Доксорубицин также вызывает нарушение сердечной деятельности, что оценено с помощью М-эхокардиографии (LVFS). Еженедельные данные эхографии (см. фигуру 15) показывают прогрессирующее снижение фракционных сокращений левого желудочка (LVFS) после шести недель лечения доксорубицином. После забивания животных все шесть кроликов, леченных доксорубицином, имеют сердечные дисфункции по данным эхокардиографии, а LVFS у них значительно отличается от значений в контрольной группе (Р<0,001). В противоположность этому ни один из кроликов, леченных GPX-100 или GPX-150, в любой момент времени по ходу эксперимента не имеет каких-либо нарушений сердечной деятельности по данным эхокардиографии.

При забивании выделяют левое предсердие, разделяют его пополам и для оценки сердечной деятельности исследуют обе половинки в ванночке для тканей, где во время всего исследования остается постоянной предварительная нагрузка и нагрузка после опыта. Предсердие, полученное от кроликов, леченных доксорубицином, характеризуется ухудшением сердечной сократимости (dF/dt) по сравнению с контролем на протяжении целого диапазона сила-частота (1, 2 и 3 Гц). Для предсердия, полученного от кроликов, леченных GPX-100 и GPX-150, не характерно ухудшение dF/dt по сравнению с контролем. Сердечную сократимость оценивают также по первому сокращению, следующему за 20, 30 и 60 секундным интервалами отдыха (20, 30 и 60 секундные PRP). Усиленная сократимость следует в результате увеличения запасов кальция в саркоплазматическом ретикулуме (SR), который образуется во время интервала отдыха, а такие лекарства, как докоорубицин и кофеин, которые влияют на функционирование SR, также воздействуют на перерывы сердцебиений. Как и ожидалось, доксорубицин значительно ухудшает сократимость (dF/dt) сердцебиений периода отдыха (см. фигуру 20), но сократимость (dF/dt) предсердия, полученного от кроликов, леченных GPX-150, не ухудшилась по сравнению с контрольными значениями. Сократимость (dF/dt) сердцебиений периода отдыха предсердия, полученного от кроликов, леченных GPX-100, имеет промежуточные значения, которые значительно отличаются от значений контроля и доксорубицина.

Выводы

При одинаковых миелосупрессивных дозах GPX-100, GPX-150 и доксорубицина кролики, леченные GPX-100 и GPX-150, не имеют сердечных дисфункций in vivo, оцененных по LVFS, а все кролики, леченные доксорубицином, имеют различные нарушения сердечной деятельности in vivo. Ленты предсердия, полученного от кроликов, леченных GPX-150, при забивании не имеют изменений в сократимости (dF/dt) по сравнению с контролем. Предсердие, полученное от кроликов, леченных доксорубицином, демонстрирует ухудшенную сократимость (dF/dt) при всех частотах сердцебиения и при потенцированных сердцебиениях периода отдыха. Предсердие, полученное от кроликов, постоянно леченных GPX-100, не показывает каких-либо ухудшений в сократимости (dF/dt) на протяжении всего исследованного диапазона сила-частота, но оно имеет ухудшение сократимости потенцированных сердцебиений периода отдыха. Кроме того, кролики, леченные GPX-100 и GPX-150, имеют меньше проявлений стоматита (мукозита) и истощения мускулатуры, чем кролики, леченные доксорубицином.

Сравнительные исследования противоопухолевой активности GPX-100, GPX-150 и доксорубицина in vivo.

1) Краткое изложение эксперимента. Противоопухолевую активность GRX-100, GPX-150 и доксорубицина in vivo исследуют на модели мышиной лейкемии с применением мышей CD2F1, которым инъецируют клетки P388D1 (полученные от мыши раковые клетки лейкемии). Мышам CD2F1 внутрибрюшинно (ip) вводят 1 млн. клеток P388D1 в двух подгруппах мышей. Подгруппа 1 состояла из 10 групп по 10 мышей/группе, а подгруппа 2 состояла из 7 групп по 10 мышей/группе. Мышей CD2F1 случайным образом распределяли по экспериментальным группам.

В подгруппе 1 исследуют две дозы доксорубицина (dox) (0,8 мг/кг и 1,6 мг/кг непрерывно вводят в течение 9 дней в дни 1-9 эксперимента), три дозы GPX-100 (1,6 мг/кг, 3,2 мг/кг и 6,4 мг/кг вводят по той же схеме, как dox) и четыре дозы GPX-150 (0,8 мг/кг, 1,6 мг/кг, 3,2 мг/кг и 6,4 мг/кг вводят по той же схеме, как dox). Определяют величину показателя Т/С леченных мышей (выраженное в процентах отношение значений в леченных группах к значениям в контрольной группе) для 20%-ного, среднего и 80%-ного времени выживания (см. таблицы 8-10). Dox проявляет ожидаемую противоопухолевую активность, но GPX-100 и GPX-150 также проявляют противоопухолевую активность. Более того, GPX-150 дает наивысшее значение Т/С из наблюдаемых в ходе эксперимента (200% при 20%-ном времени выживания, табл.8).

Опыты, проведенные в подгруппе 2, имеют цель выяснения и распространения зависимости доза-эффект на использование 3 лекарственных средств в подгруппе 1. В качестве стандарта для сравнения выбирают дозу dox 0,8 мг/кг.

Дозы GPX-100 2,4 и 3,2 мг/кг приводят к ответным Т/С, которые сходны с ответными Т/С на действие dox (см. таблицы 8-10). Подобно результатам, полученным в подгруппе 1, наилучшие ответные Т/С в эксперименте наблюдаются при использовании GPX-150 (в дозе 9,6 мг/кг) во всех трех категориях времени выживания (т.е. 215%, 155% и 137% при 20%-ном, среднем и 80%-ном времени выживания соответственно).

GPX-100 и GPX-150 в дозах, использованных в данном исследовании, домонстрируют противоопухолевую активность, которая равна или превосходит активность, проявляемую доксорубицином. В дозах, использованных в данном исследовании, GPX-150 дает наивысший противоопухолевый эффект по сравнению с эффектом доксорубицина или GPX-100. Хотя в данных опытах GPX-150 оказался более эффективным, чем дрксорубицин или GPX-100, он был менее сильным, чем GPX-100 или доксорубицин. Таким образом, GPX-100 и GPX-150 обладают противоопухолевой активностью на модели Р388 мышиной лейкемии.

2) Здания и оборудование

Эксперименты проведены на базе следующих научных учреждений:

Mountain States Medical Research Institute

190 E. Bannock

Boise, ID 83172

Veteran Affairs Medical Center

500W. Fort Street

Boise, ID 83702

3) Спонсор

Gem Pharmaceuticals, Inc. Pelham, AL.

4) Цель исследования

Задача заключалась в том, чтобы определить, будут ли GPX-100 и GPX-150 проявлять противоопухолевую активность, равную активности доксорубицина, на модели Р388 мышиной лейкемии мышей CD2F1, инъецированных клетками Р388.

5). Методы.

а) Сведения о материалах, использованных в опытах:

GPX-100 (производства фирмы GEM, LOT # Q200698273; 31 мая 2000 г.) отвешивали для каждой дозы ежедневно и готовили в солевом растворе (0,9% NaCl). Лекарственное вещество хранили в холодильнике (4С). Доксорубицин (производства фирмы GEM) отвешивали для каждой дозы ежедневно и готовили в солевом растворе. Лекарственное вещество хранили в холодильнике (4С).

Клетки Р388 получены в коллекции АТСС 22 мая 1998 г. (LOT # 946949). GPX-150 получен от фирмы SynQuest, Inc., LOT # SMT-8-172-23-26, 26 октября 2000 г.

б) Сведения о животных

Самцы мышей CD2F1 весили 25-30 г в начале эксперимента. Исследование проводилось с 7 марта по 21 июля 2001 г.

6) Тест-протокол

В день 0 мышам CD2F1 делают внутрибрюшинную инъекцию (ip) 1,6 млн. свежесобранных опухолевых клеток Р388. Мышей разделяют на 2 подгруппы: подгруппа 1 состоит из 10 групп по 10 мышей/группе, а подгруппа 2 состоит из 7 групп по 10 мышей/группе.

Подгруппа 1 включает в себя следующие 10 групп мышей:

1) контрольная группа (100 мкл солевого раствора/мышь вводят ip в дни 1-9, n=10);

2) dox группа (0,8 мг/кг dox вводят ip в дни 1-9, n=10);

3) dox группа (1,6 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

4) GPX-100 группа (1,6 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

5) GPX-100 группа (3,2 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

6) GPX-100 группа (6,4 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

7) GPX-150 группа (0,8 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

8) GPX-150 группа (1,6 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

9) GPX-150 группа (3,2 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

10) GPX-150 группа (6,4 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10).

Подгруппа 2 включает в себя следующие 7 групп мышей:

1) контрольная группа (100 мкл солевого раствора/мышь вводят ip в дни 1-9, n=9);

2) dox группа (0,8 мг/кг dox вводят ip в дни 1-9, n=9);

3) GPX-100 группа (2,4 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=9);

4) GPX-100 группа (3,2 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=9);

5) GPX-150 группа (9,6 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

6) GPX-150 группа (12,8 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

7) GPX-150 группа (25,6 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10).

Мышей взвешивают через день и для каждой группы строят график массы тела на протяжении всего эксперимента. На протяжении всего эксперимента ежедневно контролируют смертность. Результаты в каждой группе выражают в виде процентного увеличения периода жизни леченных мышей (Т) по сравнению с контрольными (С); (Т/С100).

7) Результаты

Исследована противоопухолевая активность GPX-100 и GPX-150 и доксорубицина in vivo на модели мышиной лейкемии с применением мышей CD2F1, которым были инъецированы клетки P388D1 (полученные от мыши раковые клетки лейкемии). Мышам CD2F1 внутрибрюшинно (ip) вводили 1 млн. клеток P388D1 в двух подгруппах мышей. Подгруппа 1 состояла из 10 групп по 10 мышей/группе, а подгруппа 2 состояла из 7 групп по 10 мышей/группе. Мышей CD2F1 случайным образом распределяли по экспериментальным группам.

В подгруппе 1 исследовали две дозы доксорубицина (dox) (0,8 мг/кг и 1,6 мг/кг непрерывно вводят в течение 9 дней в дни 1-9 эксперимента), три дозы GPX-100 (1,6 мг/кг, 3,2 мг/кг и 6,4 мг/кг вводят по той же схеме, как dox) и четыре дозы GPX-150 (0,8 мг/кг, 1,6 мг/кг, 3,2 мг/кг и 6,4 мг/кг вводят по той же схеме, как dox). Определена величина показателя Т/С леченных мышей (выраженное в процентах отношение значений в леченных группах к значениям в контрольной группе) для 20%-ного, среднего и 80%-ного времени выживания (см. таблицы 8-10).

Наилучший эффект от действия доксорубицина был получен в дозе 0,8 мг/кг, поскольку доза 1,6 мг/кг оказалась токсичной при 80%-ном времени выживания (значения Т/С были меньше 100% (82% по данным таблицы 10)). Однако значения Т/С для дозы dox 1,6 мг/кг оказались сходными с дозами dox 0,8 мг/кг при 20%-ном и среднем времени выживания (по данным таблиц 8 и 9, 157% против 152% и 135% против 147% соответственно).

Дозы GPX-100 3,2 мг/кг и 6,4 мг/кг также оказались токсичными и давали значения Т/С меньше 100% для обеих доз при 20%-ном, среднем и 80%-ном времени выживания (таблицы 8-10). Доза GPX-100 1,6 мг/кг приводила к значениям Т/С, сходными со значениями Т/С при действии dox в дозе 0,8 мг/кг (таблицы 8-10).

Доза GPX-150 6,4 мг/кг приводила к наибольшим значениям Т/С во всех группах подгруппы 1 при 20%-ном времени выживания (Т/С=200%, таблица 8). Тем не менее, значения Т/С от действия GPX-150 при среднем и 80%-ном времени выживания оказались равными для доз 3,2 мг/кг и 6,4 мг/кг (142% против 142% и 153% против 153% соответственно по данным таблиц 9 и 10).

Опыты, проведенные в подгруппе 2, имели целью выяснить и распространить зависимость доза-эффект на использование 3 лекарственных средств в подгруппе 1. В качестве стандарта для сравнения использовалась доза dox 0,8 мг/кг.

Дозы GPX-100 2,4 и 3,2 мг/кг приводили к ответным Т/С, которые оказались сходными с ответными Т/С на действие dox (см. таблицы 8-10). Подобно результатам, полученным в подгруппе 1, наилучшие ответные Т/С в эксперименте наблюдались при использовании GPX-150 (в дозе 9,6 мг/кг) во всех трех категориях времени выживания (т.е. 215%, 155% и 137% при 20%-ном, среднем и 80%-ном времени выживания соответственно).

8) Обсуждение и выводы

GPX-100 и GPX-150 в дозах, использованных в данном исследовании, демонстрируют противоопухолевую активность, которая равна или превосходит активность, проявляемую доксорубицином. В дозах, использованных в данном исследовании, GPX-150 дает наивысший противоопухолевый эффект по сравнению с эффектом при действии доксорубицина или GPX-100. Хотя в данных опытах GPX-150 оказался более эффективным, чем доксорубицин или GPX-100, он является менее сильным, чем GPX-100 или доксорубицин. Таким образом, GPX-100 и GPX-150 обладают противоопухолевой активностью, исследованной на модели Р388 мышиной лейкемии.

Результаты демонстрируют, что производные антрациклинов, подобные Соединению А, были бы клинически более эффективны, чем их не-13-дезоксиантрациклиновые аналоги, поскольку они могут вводиться в более высоких эффективных дозах и в течение более длительных периодов времени, так как они вызывают более низкую системную токсичность и не обладают дозаограничивающей кумулятивной кардиотоксичностью. Производные 13-дезоксиантрациклина, используемые в соответствии с данным изобретением при лечении пациентов, страдающих от форм рака, которые лечат доксорубицином и даунорубицином, представляют возможность введения их в дозах, по меньшей мере, в 1,5 раза превышающих эффективную или имеющую равную активность кумулятивную дозу по сравнению с их 13-кетоаналогами.

Данное изобретение представляет также усовершенствованные способы получения производных 13-дезоксиантрациклина. В таблице 11 представлены примеры производных 13-дезоксиантрациклина, которые могут быть синтезированы согласно данному изобретению. Как обсуждалось выше, известно, что такие соединения, как те, что представлены в таблице 11, обладают противоопухолевыми свойствами.

В отличие от известных процессов способы, соответствующие данному изобретению, являются менее температурочувствительными. Например, процессы можно вести при температуре от приблизительно 0С до приблизительно 75С.

Предпочтительно, когда процессы ведут при температуре от приблизительно 65С до приблизительно 75С. Более предпочтительно, когда процессы ведут при температуре от приблизительно 68С до приблизительно 72С. Температуры свыше приблизительно 72С обычно приводят к разложению реагентов и продуктов.

Способ, соответствующий данному изобретению, включает ряд основных условий. Например, процессы предпочтительно ведут в кислых условиях. Говоря другими словами, рН должен иметь значение 6,5 или меньше. Было обнаружено, что известные способы получения вышеуказанных соединений, в которых реакционная смесь находится в основных условиях, вызывают разложение реагентов и продуктов. Реакция или какая-либо ее часть, например только нагревание в колбе с обратным холодильником, может проводиться при температуре до приблизительно 75С в отсутствие кислорода, в отсутствие воды и/или под азотом.

Кроме того, как кислород, так и воду следует исключить из реакций. Предпочтительно, когда реакцию проводят в атмосфере азота или инертного газа, используя безводные растворители.

Способы, соответствующие данному изобретению, обеспечивают гораздо более высокий выход, чем известные способы получения соединений. Например, было показано, что известные процессы имеют выход приблизительно 30%. С другой стороны, способы, соответствующие данному изобретению, как было обнаружено, имеют выход от приблизительно 70% до приблизительно 80%.

Согласно вышеизложенному в данном изобретении представляют способы получения соединений основной формулы I, приведенной выше.

Следующие формулы представляют собой примеры трансформации молекулы в процессе реакции.

где R₁, R₂, R₃, R₄ и R₅ определены, как указано выше.

Следующая схема иллюстрирует пример варианта осуществления соответствующего данному изобретению способа получения 13-дезоксидоксорубицина, который представляет собой 13-дезоксиантрациклиновое производное.

Далее представлены примеры производных антрациклинов, синтез которых описан в данном контексте.

В соединениях R₅ может представлять собой модифицированный вариант аналогов различных антрациклинов. Кроме того, цикл D может быть фторированным.

В основном способы, соответствующие данному изобретению, включают получение раствора 13-дезоксиантрациклина с восстанавливающим агентом. Раствор осторожно нагревают в колбе с обратным холодильником. Затем реакционную смесь охлаждают. Согласно одному примеру реакционную смесь охлаждают до температуры от приблизительно 0С до приблизительно 4С. Затем к реакционной смеси добавляют основание. Основание может быть холодным. Например, основание имеет температуру от приблизительно 0С до приблизительно 4С. Одним из примеров оснований является насыщенный водный раствор NаНСО₃. В реакционную смесь может быть добавлен растворитель, представленный галогензамещенным углеводородом. Галогензамещенный углеводородный растворитель может быть добавлен в реакционную смесь одновременно с основанием. Галогензамещенный углеводородный растворитель может быть холодным. Например, галогензамещенный углеводородный растворитель может иметь температуру от приблизительно 0С до приблизительно 4С. Примером галогензамещенного углеводородного растворителя, который может быть использован, является СНСl₃. Затем реакционную смесь фильтруют. Фильтрация также имеет место при пониженной температуре. Например, фильтрация может иметь место при температуре от приблизительно 4С до приблизительно 15С.

Вышеописанное добавление основания и галогензамещенного углеводородного растворителя предпочтительно инициирует осаждение в результате гидролиза. Осадок представлен осадком неорганических солей, которые могут быть отфильтрованы из реакционной смеси. После фильтрации фильтрат может быть подкислен. Фильтрат может быть подвергнут колоночной хроматографии на силикагеле. Гидрофобные примеси можно выделить элюцией менее полярными растворителями. Затем 13-дезоксиантрациклиновые продукты могут быть элюированы и элюат может быть дополнительно очищен.

Предпочтительно, когда способы, соответствующие данному изобретению, включают образование раствора 13-тозилгидразонантрациклинов в безводном метаноле с добавлением р-толуолсульфокислоты и цианборгидрида натрия. Раствор осторожно нагревают в колбе с обратным холодильником под азотом, а затем охлаждают. Добавляют насыщенный водный раствор бикарбоната натрия и хлороформ. Соли осаждают и фильтруют и подкисляют фильтрат хлористым водородом в диэтиловом эфире, а затем выделяют на колонке с силикагелем. Гидрофобные примеси, полученные в результате разложения, элюируют смешанным раствором хлороформа и метанола. Продукты, 13-дезоксиантрациклины, элюируют метанолом. Метанольный элюат дополнительно очищают препаративной ВЭЖХ.

Согласно любому из вышеописанных способов перед или после выделения 13-дезоксиантрациклинов 13-дезоксиантрациклины могут быть обработаны одним или более восстанавливающих и/или иных агентов, способных восстанавливать 13-кетоструктуру до метиленовой группы.

Далее представляют пример способа, соответствующего данному изобретению.

Пример

Получение 13-дезоксидоксорубицина гидрохлорида

1 г гидрохлорида 13-тозилгидразондоксорубицина и 2,4 г р-толуолсульфокислоты растворяют в 50 мл безводного метанола. К данному раствору добавляют 0,8 г цианборидгида натрия. Полученный раствор нагревают до 68-72С и продолжают осторожно нагревать в колбе с обратным холодильником в течение одного часа в атмосфере азота.

Затем реакционную смесь концентрируют до приблизительно 20 мл и охлаждают в замораживателе до 0-4С. Добавляют 2 мл насыщенного водного раствора сульфата натрия, а затем 200 мл хлороформа. Добавляют безводный сульфат натрия и отфильтровывают соли после встряхивания. Фильтрат подкисляют хлоридом водорода в диэтиловом эфире.

Затем раствор пропускают через колонку с силикагелем (2,55 см). Потом колонку промывают смесью хлороформ/метанол (10/1) до тех пор, пока элюат не станет бесцветным. Связанную фракцию, содержащую продукт, элюируют метанолом. Метанольный элюат выпаривают и остаток растворяют в 30%-ном ацетонитриле в аммоний-формиатном буфере (рН 4,0, 0,5%) и выделяют препаративной ВЭЖХ. Используют колонку, содержащую фенильные группы, а отделение продукта от других примесей достигается путем использования градиента ацетонитрила/формиата аммония (от 27% до 30% ацетонитрила в течение 30 мин.). Фракцию, очищенную с помощью ВЭЖХ, лиофилизируют, получая 13-дезоксидоксорубицина гидроформиат в твердой форме, который затем растворяют в метаноле, содержащем хлористый водород. Растворитель выпаривают, продукт осаждают метанолом в этиловом эфире и получают 600 мг 13-дезоксидоксорубицина гидрохлорида. Выход составляет 80%.

УФ-спектр: _mах=233, 252, 293, 485 нм

Масс-спектрометрия: 530 (М+Н),

¹H-ЯМР (метанол d₄): (см. ниже)

1,30 (d, 3 Н, 6’-Н₃),

1,85 (m, 2H, 13-Н₂),

2,05 (m, 2H, 10-Н₂),

2,60 (d, 1Н, 12-Н),

3,05 (d, 1Н, 12-Н),

3,55 (m, 1Н, 5’-Н),

3,90 (m, 2H, 14-Н₂),

4,05 (m, 3Н, O-СН₃),

4,25 (m, 1H, 4’-Н),

4,95 (m, 1H, 3’-Н),

5,40 (m, 1H, 1"-Н),

7,50 (dd, 1H, 3-Н) и

7,80 (m, 2H, 1- и -2-Н).

Данное изобретение включает также способы лечения млекопитающих-хозяев, нуждающихся в противораковом лечении. Способы включают введение хозяевам эффективного противоракового количества, по меньшей мере, одного соединения формулы I

Эффективное противораковое количество соединения, соответствующего данному изобретению, может быть введено с учетом вида млекопитающего, массы тела, возраста, индивидуального состояния, а также формы введения. Соединения, соответствующие данному изобретению, могут быть введены обычными средствами, пригодными для применения в сочетании с фармацевтическими препаратами либо в виде индивидуальных терапевтических агентов, либо в комбинации терапевтических агентов. Они могут вводиться в виде монотерапии, но в основном их вводят с фармацевтическим носителем, выбранным на основе избранного способа введения и стандартной фармацевтической практики.

Введенная доза, конечно, будет изменяться в зависимости от известных факторов, таких как фармакодинамические характеристики определенного агента и его вид и способ введения, возраст, состояние здоровья и масса тела реципиента, природа и степень выраженности симптомов, род совместного лечения, частота введений и желаемый эффект. Можно ожидать, что дневная доза активного ингредиента составит 0,001-1000 миллиграмм (мг)/килограмм (кг) массы тела при предпочтительной дозе, составляющей от 0,1 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг.

Лекарственные формы (композиции, пригодные для применения) содержат от приблизительно 1 мг до приблизительно 100 мг активного ингредиента/единицу. В данных фармацевтических композициях активный ингредиент будет обыкновенно присутствовать в количестве приблизительно 0,5-95 мас.% от общей массы композиции.

Активный ингредиент может вводиться перорально в твердых лекарственных формах, таких как капсулы, таблетки и порошки, или в жидких лекарственных формах, таких как эликсиры, сиропы и суспензии. Он может также вводиться парентерально в стерильных жидких лекарственных формах. Активный ингредиент может также вводиться интраназально (капли для носа) или путем ингаляции. Другие лекарственные формы являются потенциально возможными, такие как чрескожное введение с использованием механизма пластыря или мази.

Желатиновые капсулы содержат активный ингредиент и носители в виде порошка, такие как лактоза, крахмал, производные целлюлозы, стеарат магния, стеариновая кислота и т.п. Аналогичные наполнители могут быть использованы для приготовления прессованных таблеток. Как таблетки, так и капсулы могут производиться в форме продуктов с задержанным выходом для обеспечения непрерывного выхода лекарственного средства в течение периода времени, измеряемого часами. Прессованные таблетки могут быть покрыты оболочкой из сахара или оболочкой из пленки, чтобы замаскировать неприятный вкус и защитить таблетку от атмосферного воздействия, или иметь энтеросолюбильную оболочку для избирательного разрушения в желудочно-кишечном тракте.

Жидкие лекарственные формы для перорального применения могут содержать подкрашивающие и вкусовые и ароматизирующие вещества для улучшения отношения к ним со стороны пациента.

В общем пригодными носителями для парентеральных растворов являются вода, приемлемое масло, физиологический раствор, водный раствор декстрозы (глюкозы) и аналогичные растворы сахаров и гликолей, таких как пропиленгликоль или полиэтиленгликоли. Растворы для парентерального введения предпочтительно содержат водораствормую соль активного ингредиента, подходящие стабилизирующие агенты и, при необходимости, буферные субстанции. Подходящими стабилизирующими агентами являются антиоксиданты, такие как бисульфит натрия, сульфит натрия или аскорбиновая кислота, в виде монокомпонентов или в комбинации. Используют также лимонную кислоту и ее соли и натриевую соль EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоты).

Кроме того, лекарственные формы для внутривенного или внутрибрюшинного введения могут содержать лиофилизированный порошок для восстановления стерильной водой или стерильным физиологическим раствором для инъекций. Данные растворы могут содержать такие консерванты, как хлорид бензалкония, метил- или пропилпарабен и хлорбутанол.

Приемлемые фармацевтические носители описаны в Справочнике по фармацевтическим наукам Ремингтона, Mack Publishing Company, стандартном литературном источнике, на который ссылаются в данной области.