выделенная днк, представляющая собой промотор (варианты), вектор, содержащий эту днк, и способ получения трансгенного растения с помощью этой днк (варианты)

Формула изобретения

1. ДНК для экспрессии кодирующей последовательности, имеющая нуклеотидную последовательность, на 50% или более идентичную нуклеотидной последовательности SEQ ID N0:2, и включающая промоторную последовательность, которая обладает способностью обеспечивать экспрессию связанной кодирующей последовательности специфично в тапетуме, ткани эндотеция и соединительной ткани пыльников, но не в микроспорах или пыльце, причем экспрессия кодирующей последовательности начинается на стадии тетрады и достигает максимального уровня на стадии вакуолизированной пыльцы.

2. ДНК по п. 1, отличающаяся тем, что последовательность включает нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID N0:2.

3. ДНК по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что кодирующая последовательность находится в антисмысловой ориентации.

4. ДНК по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что кодирующая последовательность кодирует полипептид, который может нарушать образование жизнеспособной пыльцы при экспрессии в клетках пыльника.

5. ДНК по п. 4, отличающаяся тем, что кодирующая последовательность кодирует полипептид, выбранный из группы, включающей РНКазу, DTA, TURF-13, пектатлиазу, gin-рекомбиназу, iaaL и токсин cytA.

6. ДНК для экспрессии кодирующей последовательности, имеющая нуклеотидную последовательность, на 50% или более идентичную нуклеотидной последовательности SEQ ID N0:3, и включающая промоторную последовательность, которая обладает способностью обеспечивать экспрессию связанной кодирующей последовательности специфично в тапетуме, ткани эндотеция и соединительной ткани пыльников, но не в микроспорах или пыльце, причем экспрессия кодирующей последовательности начинается на стадии тетрады и достигает максимального уровня на стадии вакуолизированной пыльцы.

7. ДНК по п. 6, отличающаяся тем, что промоторная последовательность имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID N0:3.

8. ДНК по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что промоторная последовательность включает дополнительную последовательность, которая может быть функционально связана с представляющей интерес кодирующей последовательностью.

9. ДНК по п. 8, отличающаяся тем, что дополнительная последовательность включает последовательность, которая на 50% или более идентична последовательности, представленной в SEQ ID N0:10.

10. ДНК по п. 8, отличающаяся тем, что дополнительная последовательность включает SEQ ID N0:10.

11. ДНК по пп. 8-10, отличающаяся тем, что промоторная последовательность и дополнительная последовательность на 50% или более идентична последовательностям, соответствующим SEQ ID N0:2.

12. ДНК по пп. 8-10, отличающаяся тем, что промоторная последовательность и дополнительная последовательность имеют нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID N0:2.

13. ДНК по п. 12, отличающаяся тем, что промотор включает фрагмент, получаемый из SEQ ID N0:2.

14. Вектор для экспрессии кодирующей последовательности интересуемого гена в организме-хозяине, таком, как микроорганизм или растение, включающий ДНК по любому из пп. 1-13.

15. Способ получения трансгенного растения и его потомства, полученного половым и/или бесполым путем, включающий трансформацию растения или растительного материала последовательностью ДНК по любому из пп. 1-13.

16. Способ по п. 15, где трансгенное растение обладает мужской стерильностью.

17. Способ по п. 15 или 16, отличающийся тем, что растение представляет собой рис, пшеницу, кукурузу, Sorghum bicolor или ежу сборную.

18. Способ получения трансгенного растения, заключающийся в том, что растение трансформируют с помощью ДНК, содержащей промоторную последовательность, которая обеспечивает экспрессию кодирующей последовательности специфично в тапетуме, ткани эндотеция и соединительной ткани пыльников, но не в микроспорах или пыльце, и связанную с ней кодирующую последовательность, с последующим отбором растений, у которых экспрессия кодирующей последовательности начинается на стадии тетрады и достигает максимального уровня на стадии вакуолизации пыльцы.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что растение представляет собой рис, пшеницу, кукурузу, Sorghum bicolor или ежу сборную.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к области генной инженерии растений.

Прежде всего, оно относится к новым последовательностям ДНК, которые функционируют в качестве промоторов специфичной для пыльника транскрипции кодирующих последовательностей ДНК в рекомбинантных или химерных последовательностях ДНК. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным или химерным последовательностям ДНК, которые специфично экспрессируются в пыльнике растения. Эти рекомбинантные или химерные последовательности ДНК могут применяться для создания трансгенных растений, но прежде всего трансгенных растений с мужской стерильностью.

Создание растений с мужской стерильностью имеет важное экономическое значение для получения гибридных семян. Мужская стерильность предупреждает самоопыление, которое в противном случае происходит у многих видов растений и мешает селекции и получению гибридного семенного материала. Пыльник представляет собой мужской репродуктивный орган цветковых растений, который состоит из нескольких тканей, таких как тапетум, эндотеций, соединительные ткани, сосудистые ткани и т.п., и он ответствен за производство пыльцы. Развитие пыльника может быть разделено на две общие фазы. Во время фазы 1 происходит развитие морфологических особенностей пыльника и клетки материнской микроспоры подвергаются мейозу, что приводит к образованию тетрад микроспор. Во время фазы 2 происходит дифференцировка пыльцевых зерен и пыльников, и происходит дегенерация ткани, раскрытие пыльника и высвобождение пыльцевого зерна. Среди многочисленных различных генов, принимающих участие в этих процессах развития, только небольшая часть представлена специфичными для пыльника генами.

Известные к настоящему времени специфичные для пыльника гены включают гены Osc4, Osc6, YY1 и YY2 [Hihara Y, и др., Plant Mol. Biol., 30:1181-1193(1996); TsuchiyaT., и др., Plant Mol. Biol., 26:1737-1747 (1994)], гены ТА29 и ТА32 табака [Koltunow A.M. и др., Plant Cell, 2:1201-1224 (1990)], гены SF2 и SF18 подсолнечника [Domon С. и др., Plant Mol. Biol., 15: 643-646 (1990)], гены 108 томата [Smith A.G., и др., Mol. Gen. Genet., 222:9-16 (1990)], NTM 19 табака [Oldenhof M.T. и др. Plant Mol Biol 31:213-225 (1996)] и гены ВА42, ВА112 и А9 Brassica napus [Scott R. и др., Plant Mol. Biol., 17:195-207 (1991); Shen, J.B. и др., Mol. Gen. Genet., 234:379-389 (1992)].

Некоторые из этих генов обнаружены исключительно в спорофитных тканях пыльников, другие являются специфичными для пыльцы или присутствуют и в спорофитных, и в гаметофитных тканях пыльников.

Рис является примером растения, которое размножается путем самоопыления. Это затрудняет получение гибридных сортов риса только с помощью аллогамии. Из известного уровня техники известен метод, предназначенный для облегчения получения гибридных сортов риса с помощью аллогамии, согласно которому пыльники удаляют из цветков риса для получения растений риса с мужской стерильностью, а затем на них переносят пыльцу с другого растения риса. Однако недостатком этого метода является то, что для его осуществления требуется много времени, и он является трудоемким.

Таким образом, с целью получения растения риса или другого вида самоопыляющегося растения, характеризующегося мужской стерильностью, не имеющих описанных выше недостатков, при создании настоящего изобретения предприняты попытки разработки способа, основанного на применении гена, который индуцирует аномальное развитие пыльника.

Таким образом, в изобретении предложены:

Молекулы ДНК и способы специфичной экспрессии представляющей интерес кодирующей области в тапетуме, эндотеции, соединительных тканях пыльника, но не в микроспорах или пыльце, причем экспрессия представляющей интерес кодирующей последовательности начинается на стадии образования тетрады и достигает максимального уровня на стадии вакуолизированной пыльцы. В частности, представлены молекулы ДНК и способы, отличающиеся тем, что:

- ДНК имеет нуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 50%, предпочтительно на 65%, более предпочтительно на 80% и наиболее предпочтительно на 90% или более, последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1

- ДНК по изобретению включает нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1

- молекулы ДНК специфично конструируют таким образом, чтобы кодирующая последовательность находилась в антисмысловой ориентации.

В изобретении также предложены молекулы ДНК и способы, отличающиеся тем, что кодирующая последовательность кодирует полипептид, который обладает способностью нарушать формирование жизнеспособной пыльцы при экспрессии в клетках пыльника. Согласно конкретному варианту осуществления кодирующая последовательность кодирует полипептид, выбранный из группы, включающей РНКазу, DTA, TURF-13, пектатлиазу, gin-рекомбиназу, iaaL и токсин cytA.

Изобретение также относится к указанным выше молекулам ДНК и способам, отличающимся тем, что последовательность ДНК по изобретению идентична более чем на 80%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% фрагменту, состоящему из 30 последовательных оснований, расположенному в любой области SEQ ID NО:1.

В изобретении также предложены молекулы ДНК, включающие промоторную последовательность, которая обладает способностью обеспечивать экспрессию связанной кодирующей последовательности специфично в тапетуме, эндотеции и соединительной ткани пыльника, но не в микроспорах или пыльце, причем экспрессия кодирующей последовательности начинается на стадии образования тетрады и достигает максимального уровня на стадии вакуолизированной пыльцы.

В частности, в настоящем изобретении предложены указанные ранее способы и молекулы ДНК, отличающиеся тем, что

- промоторная последовательность идентична на 50%, предпочтительно на 65%, более предпочтительно на 80% и наиболее предпочтительно на 90% или более нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3,

- промоторная последовательность имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3,

- промоторная последовательность включает дополнительную последовательность, которая может быть функционально связана с представляющей интерес кодирующей последовательностью,

- дополнительная последовательность включает последовательность, идентичную на 50%, предпочтительно на 65%, более предпочтительно на 80% и наиболее предпочтительно на 90% или более последовательности, представленной в SEQ ID NO:10,

- дополнительная последовательность включает SEQ ID NO:10,

- промоторная последовательность и дополнительная последовательность идентичны на 50%, предпочтительно на 65%, более предпочтительно на 80% и наиболее предпочтительно на 90% или более последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2,

- промоторная последовательность и дополнительная последовательность характеризуются нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:2.

Кроме того, предложены молекулы ДНК, в которых промотор включает фрагмент, который может быть получен из SEQ ID NO:2, предпочтительно фрагмент, который обладает способностью обеспечивать экспрессию связанной кодирующей последовательности специфично в тапетуме, эндотеции и соединительной ткани пыльника, но не в микроспорах или пыльце, причем экспрессия кодирующей последовательности начинается на стадии образования тетрады и достигает максимального уровня на стадии вакуолизированной пыльцы.

В изобретении также описаны молекулы ДНК, включающие открытую рамку считывания, кодирующую протеин, характеризующийся аминокислотной последовательностью, идентичной на 50%, предпочтительно на 65%, более предпочтительно на 80% и наиболее предпочтительно на 90% или более последовательности, приведенной в SEQ ID NO:4. Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения открытая рамка считывания кодирует протеин, характеризующийся аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:4. Согласно конкретному варианту осуществления изобретения указанная ранее молекула ДНК характеризуется последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:7.

Кроме того, в изобретении описаны экспрессионные векторы, включающие первую кассету экспрессии, которая содержит ДНК по изобретению для экспрессии в организме-хозяине, таком как микроорганизм или растение, и необязательно вторую кассету экспрессии, которая содержит представляющий интерес ген. Согласно конкретному варианту осуществления изобретения вторая кассета экспрессии содержит маркерный ген.

Изобретение также относится к протеину, кодируемому описанной выше открытой рамкой считывания.

Кроме того, изобретение относится к трансгенным растениям и растительному материалу и их потомству, полученному половым и/или бесполым путем, которые были трансформированы последовательностью ДНК по изобретению. В частности, в изобретении описаны

- трансгенное растение с мужской стерильностью, трансформированное последовательностью ДНК по изобретению,

- трансгенные растение или растительный материал по изобретению, где растение представляет собой рис, пшеницу, кукурузу, Sorghum bicolor или ежу сборную.

Кроме того, в изобретении предложен способ получения трансгенного растения, содержащего ДНК, включающую промоторную последовательность и связанную с ней кодирующую последовательность, причем промоторная последовательность обеспечивает экспрессию кодирующей последовательности специфично в тапетуме, эндотеции и соединительных тканях, но не в микроспорах или пыльце, причем экспрессия кодирующей последовательности начинается на стадии образования тетрады и достигает максимального уровня на стадии вакуолизированной пыльцы. Способ прежде всего пригоден для растений риса, пшеницы, кукурузы, Sorghum bicolor или ежи сборной.

Сущность и значение изобретения

Согласно конкретному варианту осуществления настоящее изобретение относится к специфичному для пыльника гену рису (Oryza sativa L.), имеющему последовательность оснований, представленную в SEQ ID NO:1, и гену, идентичному более чем на 80%, 30 последовательным основаниям в любой области этого гена.

Кроме того, настоящее изобретение относится к специфичной для пыльника регуляторной последовательности, которая включает промоторную последовательность и дополнительную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, соответствующую последовательности оснований между положениями -1196 и 240 указанного гена, которая представлена нуклеотидами (nt) с 1 по 1436 SEQ ID NO:1.

Настоящее изобретение также относится к промотору, обеспечивающему специфичную для пыльника экспрессию, который имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, которая соответствует последовательностям оснований в положениях от -1196 до -1 указанного гена, соответствующим nt 1 - nt 1196 SEQ ID NO:1.

Определения

С целью облегчения понимания описания и формулы изобретения ниже приведены следующие определения:

Химерный: понятие используют для того, чтобы указать, что последовательность ДНК, такая как вектор или ген, включает больше одной последовательности ДНК различного происхождения, которые слиты с помощью методов рекомбинантной ДНК с образованием последовательности ДНК, которая не встречается в естественных условиях, и которая, в частности, не встречается в растении, подлежащем трансформации.

Экспрессия: обозначает транскрипцию и/или трансляцию эндогенного гена или трансгена в растениях. В случае, например, антисмысловых конструкций понятие "экспрессия" может относиться к транскрипции только антисмысловой ДНК.

Ген: обозначает кодирующую последовательность и связанную с ней регуляторную последовательность, причем кодирующая последовательность транскрибируется с образованием РНК, такой как мРНК, рРНК, тРНК, snPHK (М.я.РНК), смысловая РНК и антисмысловая РНК. Примерами регуляторных последовательностей являются промоторные последовательности, 5’- и 3’-нетранслируемые последовательности и терминирующие последовательности. Могут присутствовать дополнительные элементы, например интроны.

Маркерный ген: обозначает ген, который кодирует селектируемый признак или признак, который может быть отобран в результате скрининга.

nt: представляет собой сокращение для "нуклеотида".

Понятие функционально связана с/соединена с: говорят, что регуляторная последовательность ДНК, "функционально связана с" или "соединена с" последовательностью ДНК, которая кодирует РНК или протеин, если две последовательности расположены так, что регуляторная последовательность ДНК оказывает воздействие на экспрессию кодирующей последовательности ДНК.

Растение: обозначает любое растение, в частности семенной материал растений.

Растительный материал: обозначает листья, стебли, корни, цветки или части цветков, плоды, пыльцу, пыльцевые трубки, семяпочки, зародышевые мешки, яйцеклетки, зиготы, зародыши, семена, отводки, культуры клеток или тканей, или любую другую часть или продукт растения.

Промотор: обозначает последовательность ДНК, которая инициирует транскрипцию связанной с ней последовательности ДНК. Промоторная область также может включать элементы, которые действуют как регуляторы экспрессии генов, такие как активаторы, энхансеры и/или репрессоры.

Молекула рекомбинантной ДНК: обозначает комбинацию последовательностей ДНК, которые соединены вместе с помощью метода рекомбинантной ДНК.

Метод рекомбинантной ДНК: процедуры, применяемые для соединения вместе последовательностей ДНК, описанные, например, у Sambrook и др., 1989, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Маркерный ген, который может быть отобран в результате скрининга: обозначает ген, экспрессия которого не придает трансформированной клетке избирательного преимущества, но экспрессия которого делает трансформированную клетку фенотипически отличной от нетрансформированных клеток.

Селектируемый маркерный ген: ген, экспрессия которого в клетке растения придает клетке избирательное преимущество. Избирательное преимущество, которое имеют клетки, трансформированные селектируемым маркерным геном, может заключаться в их способности расти в присутствии отрицательного агента селекции, такого как антибиотик или гербицид, по сравнению с ростом нетрансформированных клеток. Избирательное преимущество, которое имеют трансформированные клетки по сравнению с нетрансформированными клетками, может заключаться в их усиленной или вновь приобретенной способности использовать добавленное соединение в качестве питательного вещества, фактора роста или энергетического источника. Понятие "селектируемый маркерный ген" также относится к гену или к комбинации генов, экспрессия которых в растительной клетке придает клетке как отрицательное, так и положительное избирательное преимущество.

Идентичность последовательностей: процент идентичности последовательностей определяют с помощью компьютерных программ, основанных на алгоритмах динамического программирования. Компьютерные программы, предпочтительные согласно настоящему изобретению, включают BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), набор поисковых программ, созданных для исследования всех доступных баз данных последовательностей безотносительно к тому, что анализируется, протеин или ДНК. Версия BLAST 2.0 (Gapped BLAST) этого инструмента поиска доступна научной общественности через Интернет (современный адрес http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Она основана на эвристическом алгоритме локального поиска в отличие от глобального сравнительного анализа и поэтому пригодна для обнаружения связи между последовательностями на основе только выделенных областей. Баллы, приписываемые при поиске с использованием программ BLAST, имеют хорошо определенную статистическую интерпретацию. Эти программы предпочтительно осуществлять с необязательными параметрами, приписываемыми к недостающим данным.

Трансформация: обозначает процесс интродукции нуклеиновой кислоты в клетку. В частности, понятие относится к стабильной интеграции молекулы ДНК в геном представляющего интерес организма.

Краткое описание последовательностей, представленных в перечне последовательностей

SEQ ID NO:1 нуклеотидная последовательность гена RA8 риса

SEQ ID NO:2 регулятор специфичной для пыльника экспрессии, включающий промотор RA8 плюс первый экзон, первый интрон и часть экзона 2

SEQ ID NO:3 промотор RA8

SEQ ID NO:4 выведенная аминокислотная последовательность протеина, кодируемого геном RA8 риса

SEQ ID NO:5 праймер 1

SEQ ID NO:6 праймер 2

SEQ ID NO:7 последовательность кДНК RA8

SEQ ID NO:8 ПЦР-праймер

SEQ ID NO:9 ПЦР-праймер

SEQ ID NO:10 нуклеотидная последовательность первого экзона, первого интрона и части экзона 2 гена RA8 риса

Депонирование

Депонированный материал	Регистрационный номер	Дата депонирования
плазмида pGA1173-9	КСТС 8899Р	29 июля 1998 г.

Депонирование осуществлено в Корейском научно-исследовательском институте биологии и биотехнологии (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology), филиала Корейского института перспективных исследований в области науки и технологии (Korea Advanced Institute of Science and Technology) (KAIST).

Ниже настоящее изобретение описано более подробно.

Ген по настоящему изобретению выделяют из риса (Oryza saliva L.), он специфично экспрессируется в пыльнике, и его геномная последовательность представлена в SEQ ID NO:1. Последовательность кДНК гена RA8 приведена в SEQ ID NO:7. Путем сравнения последовательности кДНК и геномной последовательности установлено присутствие 2 интронов и 3 экзонов в кодирующей последовательности гена RA8. Интрон 1 длиной 134 пары оснований локализован между 14 и 15 кодонами, соответствующими nt 1289 - nt 1422 SEQ ID NO:1, и nt 1556 - nt 2149 SEQ ID NO:1, а интрон 2 длиной 594 пары оснований локализован на 59 кодоне в кодирующей области аминокислотной последовательности, выведенной из этой последовательности оснований, которая соответствует nt 1556 - nt 2149 SEQ ID NO:1. Оба интрона содержат консенсусные последовательности GT и AG на 5’- и 3’-концах соответственно. В SEQ ID NO:1 три экзона локализованы следующим образом: экзон 1: nt 1247 - nt 1288; экзон 2: nt 1423 - 1555; экзон 3: nt 2150 - nt 2766. В 5’-некодирующей фланкирующей последовательности этой кодирующей области последовательность СААТ-бокса, СААТ, локализована на основаниях в положениях от -82 до -79, что соответствует nt 1116 - nt 1119 SEQ ID NO:1, а последовательность ТАТА-бокса, ТАТААТА, локализована на основаниях в положениях от -53 до -47, что соответствует nt 1145 - nt 1151 SEQ ID NO:1. Поли-(А)-хвост локализован на 164-ом основании (нуклеотид 2932 SEQ ID NO:1) по ходу транскрипции от кодона терминации трансляции TGA. В 3’-некодирующей области присутствует консенсусная последовательность сигнала полиаделирования ААТАА. Последовательность, окружающая первый ATG, практически соответствует консенсусной последовательности инициации трансляции однодольных растений, известной из литературы [Joshi С.Р. и др., Plant Mol. BioL, 35:993-1001 (1997)].

Открытая рамка считывания этой кодирующей области состоит из 264 аминокислотных остатков и имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4.

Выведенный из этой открытой рамки считывания протеин имеет молекулярную массу 26,4 кДа и значение рI 6.1. Основные аминокислоты, входящие в состав протеина, представлены аланином (21,9%), глицином (9,9%) и пролином (10,2%), а его аминокислотная последовательность включает гидрофобную N-концевую область, которая может принимать участие в направленном переносе протеина в мембранную фракцию или во внеклеточное пространство, экстенсинподобный мотив SPPPPPP и богатую глицином область. Согласно анализу гомологии с использованием базы данных Genebank такая аминокислотная последовательность является новой и не обладает существенной идентичностью ни с одной из последовательностей генов, известных в настоящее время.

Экспрессия гена по настоящему изобретению отличается тем, что она регулируется временными и пространственными факторами. Пространственная схема экспрессии включает экспрессию гена только в таком органе цветка риса, как пыльник, но при этом экспрессия отсутствует в других органах цветка, отличных от пыльника, в листьях, корнях и т.д., а в пыльнике экспрессия, прежде всего, происходит в тапетуме, эндотеции и соединительных тканях, но не в сосудистых тканях. Временная схема экспрессии отличается тем, что уровни экспрессии гена возрастают по мере созревания цветков, причем слабая экспрессия гена начинается на стадии, предшествующей мейозу, но его экспрессия впервые может быть обнаружена в то время, когда микроспоры высвобождаются из тетрад. Максимальные уровни обнаруживаются на стадии вакуолизированной пыльцы, и они резко снижаются на стадии зрелой пыльцы непосредственно перед цветением.

Ген по настоящему изобретению может быть получен с помощью различных методов гибридизации. Например, с помощью метода, предусматривающего гибридизацию библиотеки кДНК пыльника с библиотекой кДНК, имеющей происхождение не из пыльника, например из листьев, корней или проростков, с получением в результате этого клона кДНК, специфичного для пыльника гена, который дает отрицательную реакцию с библиотекой кДНК, имеющей происхождение не из пыльника. Кроме того, полученный клон кДНК применяют в качестве зонда для гибридизации с геномной библиотекой и выделяют клон, который дает положительную реакцию, и его субклонируют для получения геномного клона, специфичного для пыльника гена. Другой метод получения гена включает метод, согласно которому последовательности оснований SEQ ID NО:1 используют для синтеза соответствующего праймера для общепринятого метода ПЦР. Согласно конкретному варианту осуществления изобретения полученный ген клонируют в векторе pBluescript SK (-) и продукт обозначен как плазмида pGA1173-9. Эта плазмида депонирована в Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, аннексированной организации Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) под регистрационным номером КСТС 8899Р 29 июля 1998 г.

Область, содержащая промотор RA8, которая приведена в SEQ ID NO:3, соответствует nt 1-1196 SEQ ID NO:1. Транскрибируемые нуклеотиды гена RA8 начинаются в положении 1197 SEQ ID NO:1. Элемент, который регулирует специфичную для пыльника экспрессию гена по настоящему изобретению, локализован в области, содержащей промотор, экзон 1, интрон 1 и часть экзона 2, и эта область может быть представлена в виде SEQ ID NO:2, которая соответствует последовательности оснований между nt 1 и nt 1436 последовательности оснований, приведенной в SEQ ID NO:214. Этот регуляторный элемент может быть получен обычным методом клонирования из геномной ДНК риса или плазмиды pGA1173-9, например, когда последовательность оснований SEQ ID NO:22 применяют для синтеза соответствующего праймера и после этого осуществляют обычную ПЦР.

Растительный экспрессионный вектор по настоящему изобретению содержит, например, регуляторный элемент, который приведен в SEQ ID NO:22, причем регулятор специфичной для пыльника экспрессии слит с другим представляющим интерес геном. В качестве требуемого гена может применяться репортерный ген, такой как ген -глюкуронидазы (GUS), а для целей индукции аномального развития пыльников риса может применяться DTA (ген токсичного продукта, который разрушает клетки), ген РНКазы и т.д. (см. ниже), но представляющий интерес ген не ограничен ими.

Растительный экспрессионный вектор может содержать вторую кассету экспрессии, включающую маркерный ген, который дает возможность; осуществлять отбор трансформантов. Примеры селектируемых маркерных генов или маркерных генов, которые могут быть отобраны в результате скрининга, приведены ниже. Для определенных видов-мишеней предпочтительными могут оказаться различные маркеры для селекции по признаку устойчивости к антибиотику или гербициду. Обычно применяемые для трансформации селектирующие маркеры включают ген nptII, который придает устойчивость к канамицину, паромомицину, генетицину и родственным антибиотикам (Vieira и Messing, Gene, 19: 259-268 (1982); Bevan и др., Nature 304: 184-187 (1983)), бактериальный ген aadA, который кодирует спектиномициндетоксицирующий фермент аминогликозид-3’-аденилтрансферазу и обусловливает устойчивость к стрептомицину или спектиномицину (Goldschmidt-Clermont M., Nucl. Acids Res. 19: 4083-4089 (1991)), ген hph, который придает устойчивость к антибиотику гигромицину (Blochinger и Diggelmann, Mol. Cell BioL, 4: 2929-2931 (1984)), и ген dhfr, который придает устойчивость к метотрексату (Bourouis и др., ЕМВО J., 2: 1099-1104 (1983)). Другие маркеры, которые могут быть использованы, включают ген фосфинотрицинацетилтрансферазы, обусловливающий устойчивость к гербициду фосфинотрицину (White и др., Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990); Spencer и др., Theor. Appl. Genet. 79: 625-631 (1990)), мутантный ген EPSP-синтазы, кодирующий устойчивость к глифосату (Нinchee и др., Bio/Technology 6: 915-922 (1988)), мутантный ген ацетолактатсинтазы (ALS), обусловливающий устойчивость к имидазолиону или сульфонилмочевине (Lee и др., ЕМВО J., 7: 1241-1248 (1988)), мутантный ген psbA, обусловливающий устойчивость к атразину (Smeda и др., Plant Physiol. 103: 911-917 (1993)), или мутантный ген протопорфириногеноксидазы, описанный в ЕР 769059. Можно также применять селектирующие маркеры, позволяющие осуществлять положительный отбор, такие как ген фосфоманнозоизомеразы, описанный в заявке на патент WO 93/05163.

Идентификация трансформированных клеток также может быть осуществлена с помощью экспрессии пригодных для скрининга маркерных генов, таких как гены, кодирующие хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), -глюкуронидазу (GUS), люциферазу и зеленый флуоресцентный протеин (GFP), или любые другие протеины, обусловливающие фенотипически различимые признаки у трансформированных клеток.

Экспрессионный вектор может быть сконструирован слиянием указанного регулятора специфичного для пыльника экспрессии с требуемым геном и последующего встраивания его путем лигирования в соответствующий растительный экспрессионный вектор. Например, регуляторный элемент сливают с GUS без изменений рамки считывания и затем слитый продукт лигируют с бинарным вектором pGA1633, который обладает способностью экспрессироваться в растениях, получая экспрессионный вектор pGA1647.

Рекомбинантные последовательности ДНК по изобретению могут быть интродуцированы в растительную клетку с помощью многочисленных хорошо известных методов. Специалистам в данной области должно быть ясно, что выбор способа должен определяться типом растения, подлежащим трансформации, а именно однодольным или двудольным растением. Пригодные методы трансформации растительных клеток включают микроинъекцию (Crossway и др., BioTechniques 4: 320-334 (1986)), электропорацию (Riggs и др., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 83: 5602-5606 (1986), опосредуемую Agrobacterium трансформацию (Hinchee и др., Biotechnology 6: 915-921 (1988), непосредственный перенос гена (Paszkowski и др., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984), и способ баллистического ускорения частиц с использованием устройств, выпускаемых фирмами Agracetus, Inc., Мэдисон, штат Висконсин и Dupont, Inc., Вилмингтон, штат Делавар (см., например, патент США 4945050; и McCabe и др., Biotechnology 6: 923-926 (1988)). Подлежащие трансформации клетки могут представлять собой дифференцированные клетки листа, эмбриогенные клетки или любой другой тип клеток.

Для непосредственной трансформации протопластов поглощение экзогенного генетического материала протопластом может быть усилено применением химического агента или электрического поля. Ранее проведено исследование с использованием двудольного растения табака, которое позволило осуществить включение чужеродной ДНК и трансформацию потомства растений (Paszkowski и др., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984); Potrykus и др., 1985, Mol. Gen. Genet 199: 169-177). С помощью этой методики трансформируют протопласты однодольных растений, например Triticum monococcum, Lolium multiflorum (райграс итальянский), кукурузы и черной мексиканской сладкой кукурузы. Дополнительным предпочтительным вариантом осуществления является метод трансформации протопласта кукурузы, описанный в ЕР 0292435, а также в ЕР 0846771. Методы трансформации кукурузы также описаны у Koziel и др., Bio/Technology 11:194-200 (1993). Трансформация риса может быть осуществлена с помощью методик непосредственного переноса генов с использованием протопластов или с помощью бомбардировки частицами. Опосредуемая протопластом трансформация описана для японских и индийских типов риса (Zhang и др., Plant Cell Rep. 7: 379-384 (1988); Shimamoto и др., Nature 338: 274-277 (1989); Datta и др., Biotechnology 8: 736-740 (1990)). Оба типа риса также трансформируют стандартными методами с использованием бомбардировки частицами (Christou и др., Biotechnology 9: 957-962 (1991)). В заявке на патент ЕР 0332581 описаны методы получения, трансформации и регенерации протопластов растений сем. мятликовых (Pooideae). Эти методы дают возможность осуществлять трансформацию всех видов ежи (Dactylis spp.) и пшеницы. Кроме того, трансформация пшеницы описана в ЕР 0674715 и у Weekes с соавторами, 1993 (Plant Physiol. 102: 1077-1084). Сконструированный таким образом растительный экспрессионный вектор может, например, быть интродуцирован в каллюсы риса с помощью общепринятого метода трансформации растений, при этом индуцируется дифференцировка корней и листьев и затем растения могут быть перенесены в цветочный горшок для культивирования, получая тем самым трансформированные растения риса.

Предпочтительным методом трансформации растений является опосредуемая Agrobacterium трансформация. В качестве репрезентативного примера опосредуемой Agrobacterium трансформации экспрессионный вектор PGA1647 переносят в Agrobacterium tumefaciens, несущую бинарную Ti-плазмиду, используя метод замораживания-оттаивания (An G. и др., (ред.) Plant Molecular Biology Manual, стр. А3/1-А3/19, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1998)), а затем выращивают в жидкой АВ-среде, дополненной соответствующими антибиотиками (Chilton M-D, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 3672-3676 (1974)), и полученный таким образом продукт совместно культивируют с каллюсами на среде 2N6-As, дополненной 1 мМ бетаина (Hiei Y. и др., Plant J., 6: 271-282 (1994)) в темноте при 25°С в течение 2-3 дней. Совместно культивируемые каллюсы промывают стерильной водой, содержащей цефотаксим, и вновь инкубируют в N6-среде, содержащей соответствующий антибиотик и цефотаксим, в течение 3-4 недель, получая активно растущие каллюсы. Эти каллюсы переносят в соответствующую среду для селекции, например MS-среду (фирма Life Technologies), дополненную 0,2 мг/л НУК (нафталинуксусная кислота), 2 мг/л кинетина, 2% сорбита, 1,6% фитагара (фирма Gibco), соответствующим антибиотиком и 250 мг/л цефотаксима, а затем культивируют в течение 2-3 недель в условиях непрерывного освещения с интенсивностью 30-60 мкмолей м^-2 с^-1, предпочтительно 40 мкмолей м^-2 с^-1, получая проростки. Эти проростки высаживают и выращивают в вегетационной камере в условиях 10 ч свет/14 ч темноты, получая трансгенные растения риса.

В случае, когда применяемый согласно этому методу вектор содержит слитый ген регуляторного элемента по настоящему изобретению и гены DTA или РНКазы и т.д., трансформированное вектором растение имеет признак мужской стерильности.

Кодирующая последовательность ДНК по настоящему изобретению может представлять собой любую последовательность ДНК, кодирующую требуемый полипептид. Однако особенно предпочтительными согласно настоящему изобретению являются кодирующие последовательности ДНК, которые кодируют полипептидный продукт, при экспрессии которого в ткани пыльника растение не может образовывать жизнеспособную пыльцу. Примеры таких кодирующих последовательностей ДНК включают гены, описанные в приведенных ниже ссылках, которые полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки:

а) ген цепи А дифтерийного токсина (DTA), который ингибирует синтез протеинов (Greenfield и др., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80: 6853 (1983); Palmiter и др., Cell 50: 435-443 (1987));

б) ген пектат-лиазы peIE Erwinia chrysanthemi EC16, который расщепляет пектин, вызывая лизис клеток (Keen и др., J. Bacteriology 168: 595 (1986));

в) ген T-urf13 (TURF-13) из cms-T митохондриальных геномов кукурузы: этот ген кодирует полипептид, обозначенный как URF13, который разрушает митохондриальные или плазматические мембраны (Braun и др., Plant Cell 2: 153 (1990); Dewey и др., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84: 5374 (1987) и Dewey и др., Cell 44: 439 (1986));

г) ген gin-рекомбиназы гена Ми фага, кодирующий сайтспецифичную ДНК-рекомбиназу, которая может вызывать реаранжировки генома и снижение жизнеспособности клеток при экспрессии в растительных клетках (Maeser и др., Mol. Gen. Genet. 230: 170-176 (1991));

д) ген синтетазы индолуксусная кислота-лизин (iaaL) Pseudomonas syringae, кодирующий фермент, который обеспечивает конъюгацию лизина с индолуксусной кислотой (IAA). При экспрессии в клетках растений он приводит к нарушению развития вследствие удаления IAA из клеток в результате конъюгации (Romano и др., Genes and Development 5: 438-446 (1991); Spena и др. Mol. Gen. Genet. 227: 205-212 (1991); Roberto и др., Pro Natl Acad Sci USA, 87: 5795-5801 (1990); и

е) ген токсина CytA Bacillus thuringiensis israeliensis, который кодирует москитоцидный (токсичный для комаров) и гемолитический протеин. При экспрессии в растительных клетках он вызывает гибель клеток из-за разрушения клеточной мембраны (McLean и др., J. Bacteriology 169: 1017-1023 (1987); Ellar и др., патент США 4918006, 1990).

ПРИМЕРЫ

Ниже настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на примеры, которые не направлены никоим образом на ограничение объема настоящего изобретения.

Пример 1: Выделение специфичного для пыльника риса гена RA8

Стадия 1: Выделение гена RA8

Цветки риса (Oryza sativa L. Nakdong) на стадии поздней вакуолизированной поперечно разрезают на три части. В качестве образца с высоким содержанием пыльников используют среднюю область, которая содержит интактные пыльники и части верхней и нижней цветковой чешуи. Из этой области с высоким содержанием пыльников выделяют мРНК, используя набор для выделения мРНК "poly (A) Quick mRNA Isolation" (фирма Stratagene, США). Конструируют библиотеки кДНК с помощью набора "ZAP-сДНК Gigapack 2 Gold Cloning" (фирма Stratagene), в которых в качестве матрицы используют мРНК.

Эту же методику применяют для листьев, которые собирают у 6-дневных проростков риса для конструирования библиотек кДНК листа.

Из сконструированных библиотек кДНК пыльника произвольно отбирают 33 клона кДНК и после этого области кДНК, которые получают расщеплением соответствующего клона ДНК с помощью EcoRI, метят радиоактивным изотопом ³²Р и гибридизуют с бляшками из библиотеки кДНК листа.

В результате этого 6 клонов кДНК пыльника, которые не дают положительной реакции с бляшками из библиотеки кДНК листа, и среди этих клонов отбирают один клон, который наиболее часто присутствует в библиотеке кДНК пыльника, и обозначают как RA8.

Фаг-хелпер f1 R408 (фирма Stratagene) применяют для получения рекомбинантной плазмиды pGA1173-4 (RA8) из этого клона RA8, в который фрагмент кДНК встраивают путем вырезания in vivo, и последовательности оснований кДНК RA8, которую клонируют в вышеуказанной плазмиде, определяют методом Sanger и др. (Sanger F. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977)).

Эти последовательности оснований представлены в SEQ ID NO:27. Как видно из SEQ ID NO:27, нуклеотидная последовательность кДНК RA8 состоит из 1008 пар оснований. Открытая рамка считывания простирается от nt 51 до nt 842 SEQ ID NO:27, состоящей из 264 аминокислотных остатков. Протеин, выведенный из этой открытой рамки считывания, имеет молекулярную массу 26,4 кДа и рI 6,1. Последовательность, окружающая первый ATG, хорошо соответствует консенсусной последовательности инициации трансляции однодольных растений, известной из литературы [Joshi С.Р. и др.. Plant Mol. Biol, 35:993-1001 (1997)], поли-А-хвост локализован в положении 164 последовательности оснований, расположенной по ходу транскрипции относительно кодона терминации трансляции TGA. В 3’-некодирующей области присутствует консенсусная последовательность сигнала полиаделирования ААТАА.

Основные аминокислоты, входящие в состав указанной выше аминокислотной последовательности, представлены аланином (21,9%), глицином (9,9%) и пролином (10,2%), а их аминокислотная последовательность включает гидрофобную N-концевую область, которая может принимать участие в направленном переносе протеина в мембранную фракцию или во внеклеточное пространство, экстенсинподобный мотив SPPPPPP и богатую глицином область. Согласно анализу гомологии с использованием базы данных Genebank такая аминокислотная последовательность является новой, и ее последовательность не является в значительной степени идентичной ни одной из последовательностей генов, известных к настоящему времени.

Стадия 2: Анализ РНК методом блоттинга

Для подтверждения того, что полученный на приведенной выше стадии 1 ген RA8 специфично экспрессируется в пыльнике, общую РНК выделяют из листьев, корней, молодых цветков, зрелых цветков и верхней/нижней цветковой чешуи, пестиков и тычинок цветков риса, подвергают электрофорезу и затем переносят на найлоновую мембрану. Для осуществления блоттинга РНК в качестве зонда используют меченную с помощью ³²Р-кДНК RA8.

мРНК RA8 присутствует только в цветках на различных стадиях развития, но отсутствует в листьях и корнях. Уровень экспрессии гена RA8 возрастает по мере развития цветка, достигая максимума в зрелых цветках. Для того, чтобы определить специфичность экспрессии в отношении определенного органа цветка, эксперимент с блоттированием РНК осуществляют с использованием общей РНК, выделенной из различных органов цветка. Каждый из органов цветка рассекают под препаровальной лупой для того, чтобы минимизировать загрязнение другими органами. Результат свидетельствует о том, что мРНК RA8 присутствует в пыльниках, но отсутствует в плодолистике или верхней/нижней цветковой чешуе.

Стадия 3: Выделение геномного клона RA8

Бляшки геномных библиотек риса (которые конструируют стандартными методами и получают от Steve Kay и Nam-Hi Chua из Университета Рокфеллера в форме ДНК фага лямбда EMBL, в которую встраивают геномную ДНК риса) переносят на найлоновую мембрану (типа Hybond, фирма Amersham) и гибридизуют с радиоактивномеченной с помощью ³²Р кДНК RA8 в качестве зондов для гибридизации. Гибридизованную найлоновую мембрану экспонируют на рентгеновскую пленку и получают клоны фага из бляшек, дающих положительную реакцию. ДНК фага лямбда выделяют из этих клонов фага, расщепляют с помощью BamHI, получая геномный фрагмент длиной 13,7 т.п.н. и в нем субклонируют SacI-EcoRI-фрагмент длиной 4,3 т.п.н.

SacI-фрагмент длиной 2,9 т.п.н. из SacI-EcoRI-фрагмента длиной 4,3 т.п.н. содержит 5’-фланкирующую последовательность и 5’-кодирующую область, в то время как примыкающий SacI-EcoRI-фрагмент длиной 1,5 т.п.н. содержит остальную кодирующую область и 3-’ фланкирующую последовательность. Два интрона (интрон 1 и интрон 2) и 3 экзона присутствуют в кодирующей области. Относительно SEQ ID NO:1 эти 3 экзона локализованы следующим образом: экзон 1: nt 1247 - nt 1288; экзон 2: nt 1423-1555; экзон 3: nt 2150 - nt 2766. Интрон 1 состоит из 134 пар оснований и локализован между 14-ым и 15-ым кодонами, что соответствует nt 1289 - nt 1422 SEQ ID NO:1, а интрон 2 состоит из 594 пар оснований и локализован на 59-ом кодоне, что соответствует nt 1556 - nt 2149 SEQ ID NO:21. Оба интрона содержат консенсусные последовательности GT и AT на 5’- и 3’-концах соответственно. 5’-Фланкирующая последовательность кодирующей области RA8 содержит последовательность СААТ-бокса, СААТ простирается от основания -82 до -79, что соответствует nt 1116 - nt 1119 SEQ ID NO:21, а последовательность ТАТА-бокса, ТАТААТА простирается от положения от -53 до -47, что соответствует nt 1145 - nt 1151 SEQ ID NO:21.

Sacl-фрагмент длиной 2,9 т.п.н. клонируют в плазмидном векторе pBluescript SK (-), и эту плазмиду обозначают как pGA1173-9. Эта плазмида депонирована Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, филиала Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 29 июля 1998 г под регистрационным номером КСТС 8899Р.

Последовательности оснований фрагмента геномной ДНК, которые клонируют в плазмиде pGA1173-9, анализируют, используя метод Sanger и др., и определяют промоторную область длиной примерно 2,5 т.п.н. в сравнении с кДНК.

Для изучения геномной вариабельности клона RA8 геномную ДНК, выделенную из листьев двухнедельных проростков риса, расщепляют с помощью EcoRI, HindIII или PstI и затем подвергают ДНК-блоттингу с кДНК RA8. кДНК-зонд RA8 гибридизуется с одной полосой геномной ДНК риса, что доказывает, что ген RA8 существуют в одной копии в геноме риса.

Пример 2: Получение растительного экспрессионного вектора

Бинарный вектор, который содержит репортерный ген GUS и ген для селекции hph (гигромицин-фосфотрансфераза), конструируют следующим образом.

Плазмиду pGA748 (An G., Binary Ti plasmid vectors, Agrobacterium protocols, Humana Press, стр.47-58) расщепляют с помощью BamHI и HindIII, и затем в нее встраивают промотор CaMV35S (Benrey и др., Science, 250: 959-966 (1993)). Ген, обусловливающий устойчивость к гигромицину (гигромицин-фосфотрансфераза, hph) (Gritz и др., (1983)) встраивают в сайт BglII полученной таким образом плазмиды. Эту плазмиду расщепляют с помощью HindIII и ClaI, "затупляют" конец и затем лигируют. Полученную таким образом плазмиду расщепляют с помощью SacI для удаления фрагмента длиной примерно 0,5 т.п.н. и затем повторно лигируют. В сайт BamHI этой плазмиды встраивают синтетический адаптор, несущий сайты расщепления BamHI, HindIII, XbaI, SacI, HpaI, Kpnl, ClaI и BglII, создавая плазмиду pGA1182.

Осуществляют ПЦР, используя плазмиду PGA1182 в качестве матрицы, 5’-TTGGCATGCACATAC-3’ (SEQ ID NO:5) в качестве праймера 1 и 5’-CGGGATCCGTGTTTGACAGG-3’ (SEQ ID NO:6) в качестве праймера 2.

Полученный фрагмент длиной примерно 120 пар оснований расщепляют с помощью BamHI и SphI, а затем встраивают путем лигирования в фрагмент длиной примерно 9 т.п.н., который получают путем расщепления плазмиды pGA1182 с помощью этих же рестриктаз. Между сайтами BamHI и Clal полученной таким образом плазмиды встраивают ген GUS (Jefferson и др., ЕМВО J, 6: 3901-3907 (1987)), создавая бинарный вектор pGA1633.

Плазмиду pGA1173-9, которая содержит геномную ДНК RA8 длиной 2,9 т.п.н., сконструированную на стадии 3 примера 1, подвергают ПЦР с использованием синтетических олигомерных праймеров, представленных в SEQ ID NO:8 (AATTAACCCTCACTAAAGGG) и SEQ ID NO:9 (GCGGATCCAGGTT-GAACCAC). Синтетический олигомер, последовательность которого приведена в SEQ ID NO:29, обеспечивает создание сайта BamHI в экзоне 2 гена RA8.

Затем конструируют плазмиду pGA1639, содержащую амплифицированную последовательность, указанную выше. Плазмида pGA1639 содержит SacI-BamHI-фрагмент длиной 2,7 т.п.н., включающий 5’-фланкирующую область экзона 1, интрон 1 и часть экзона 2 гена RA8.

Этот фрагмент соединяют с кодирующей последовательностью -глюкуронидазы в pGA1633, создавая растительный экспрессионный вектор pGA1647. В векторе pGA1647 описанную выше происходящую из гена RA8 последовательность сливают во вновь интродуцированном сайте BamHI в экзоне 2 с геном GUS без какого-либо расщепления открытой рамки считывания. Таким образом получают трансляционное слияние между частью гена RA8 и кодирующей последовательностью -глюкуронидазы.

Пример 3: Получение трансгенного растения риса

Экспрессионным вектором pGA1647, сконструированным согласно способу, описанному в примере 2, трансформируют штамм Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Hoekema и др., Nature, 303: 179-181 (1983)) несущий бинарную Ti-пламиду pAL4404, используя метод замораживания-оттаивания (An G. и др., (ред.) Plant Molecular Biology Manual, стр. А3/1-А3/19, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988)).

Трансформированный штамм Agrobacterium tumefaciens LBA4404 выращивают в течение 3 дней в жидкой АВ-среде, дополненной 30 мг/л гигромицина В и 3 мг/л тетрациклина, и его совместно культивируют с трехнедельными каллюсами, рост которых индуцируют из скутеллума зрелых семян в среде N6 (Chu С.С. и др., Sci, Sin., 18: 659-668 (1975)), содержащей 2 мг/л 2,5-Д, в среде 2N6-As, дополненной 1 мМ бетаина (Hiei Y. и др., Plant J., 6: 271-282 (1994)) в темноте при 25°С в течение 2-3 дней. Совместно культивируемые каллюсы промывают стерильной водой, содержащей 100 мг/л цефотаксима, и вновь инкубируют в N6-cpeдe, содержащей 40 мг/л гигромицина и 250 мг/л цефотаксима, в течение 3-х недель. Активно растущие, устойчивые к гигромицину каллюсы переносят в среду для селекции [например, MS-среду (фирма Life Technologies) + 0,2 мг/л НУК (нафталинуксусная кислота) + 2 мг/л кинетина + 2% сорбита + 1,6% фитагара (фирма Gibco) + 50 мг/л гигромицина В + 250 мг/л цефотаксима], а затем культивируют в течение 2-3 недель в условиях непрерывного освещения с интенсивностью 40 мкмолей м^-2 с^-1. Полученные таким образом проростки высаживают и выращивают в вегетационной камере в условиях 10 ч света/14 ч темноты, получая в целом 22 трансгенных растения риса.

Для отбора линии растения с наиболее высоким уровнем экспрессии в пыльниках среди этих двадцати двух (22) трансгенных растений риса осуществляют гистохимическое окрашивание на GUS цветковой области трансгенного растения риса согласно методу Dai и др. [Dai Z. и др., Plant Mol. Biol., 32: 1055-1065 (1996)], с той модификацией, что в растворе для окрашивания содержится 20% метанола, и затем фиксируют в фиксирующем растворе (50% этанола, 5% уксусной кислоты и 3,7% формальдегида). Исследование образцов проводят с помощью препаровальной лупы (×7,5-кратной увеличение). На основе этих результатов отбирают растение риса с наиболее высоким уровнем экспрессии GUS в пыльниках и обозначают как трансгенная линия растения A11279.

Пример 4: Гистохимический анализ GUS в трансгенных растениях риса

Для изучения пространственной и временной схем экспрессии гена RA8, молодые цветки, цветки на ранней стадии вакуолизированной пыльцы, зрелые цветки, листья и корни трансгенной линии риса А11279, полученной в примере 3, подвергают гистохимическому анализу в отношении активности GUS согласно методике, описанной в примере 3, и затем обследуют под микроскопом. В качестве контроля используют цветок нетрансформированного растения риса.

Экспрессия GUS под контролем промотора RA8 обнаружена только в пыльниках цветков риса, но не выявлена в других органах цветка или в листьях или корнях. Кроме того, уровень экспрессии репортерного гена GUS повышался по мере созревания цветков, и экспрессия совсем не происходила в молодых цветках на стадии, предшествующей мейозу.

Для изучения схем специфичной для пыльника экспрессии конструкции промотор RA8 - репортерный ген после окрашивания и фиксации 4 пыльника из цветков риса на различных стадиях развития согласно методике, описанной в примере 3, погружают в парапласт (фирма Sigma) и делают срезы толщиной 10 мкм. Срезы обследуют с помощью светового микроскопа (×100-кратное увеличение), используя темнопольное освещение. На стадии, предшествующей мейозу, активность GUS не обнаружена ни в одной из частей пыльника. Экспрессия GUS впервые выявлена в момент времени, когда микроспоры высвобождаются из тетрад. Наиболее высокий уровень активности GUS обнаружен в пыльниках на стадии вакуолизированной пыльцы. Однако в пыльниках на стадии зрелой пыльцы непосредственно перед раскрытием или после него активность GUS резко снижается. Установлено, что окрашивание в отношении GUS ограничено тапетумом, соединительной тканью и тканью эндотеция.

Пример 5: Получение трансгенного растения кукурузы

Трансформацию кукурузы с помощью нового гена, полученного с помощью описанного выше способа, осуществляют путем бомбардировки микроснарядами либо незрелых зиготических зародышей, либо серийно размножаемого эмбриогенного каллюса типа I.

Из незрелых зародышей длиной 1,5-2,5 мм, полученных из выращенного в теплице материала, инициируют развитие культур эмбриогенного каллюса типа I кукурузы (Green и др., Miami Winter Symposium 20, 1983). Зародыши выделяют в асептических условиях из початков со стерилизованной поверхностью приблизительно через 14 дней после опыления. Зародыши либо помещают на D-среду для инициации развития каллюса, содержащую 2% сахарозы и 5 мг/л хлорамбена (Duncan и др., Planta 165: 322-332 (1985)), либо в КМ-среду для инициации развития каллюса, содержащую 3% сахарозы и 0,75 мг/л 2,4-Д (Као и Michayluk, Planta 126: 105-110 (1975)). Затем зародыши и эмбриогенный каллюс культивируют в темноте. Из эксплантатов примерно через 14 дней выделяют зародыши, дающие эмбриогенную реакцию. Дающие эмбриогенную реакцию зародыши из D-среды, инициирующей развитие каллюса, помещают в D-среду для поддержания развития каллюса, содержащую 2% сахарозы и 0,5 5 мг/л 2,4-Д, а дающие эмбриогенную реакцию зародыши из КМ-среды, инициирующей развитие каллюса, помещают в КМ-среду для поддержания развития каллюса, содержащую 2% сахарозы и 5 мг/л Дикамба. После инкубации в течение 3-8 недель с еженедельным пересевом в свежую среду для поддержания развития каллюса получают компактные эмбриогенные культуры высокого качества. Кусочки активно растущего эмбриогенного каллюса отбирают в качестве ткани-мишени для введения гена. Кусочки каллюса помещают на пластины-мишени, содержащие поддерживающую среду, с 12% сахарозы, примерно за 4 ч до введения гена. Кусочки каллюса размещают по окружностям радиусами 8 и 10 мм от центра пластины-мишени. Плазмидную ДНК осаждают на золотые микроносители согласно руководству фирмы DuPont Biolistic. Два-три мкг каждой плазмиды используют для обработки 6 используемых в качестве снарядов микроносителей. Гены вводят в клетки ткани-мишени с помощью устройства типа PDS-1000He Biolistics. Устройство типа Biolistics имеет следующие параметры настройки: расстояние между разрушающимся диском и макроносителем 8 мм, расстояние между макроносителем и задерживающим экраном 10 мм и расстояние между задерживающим экраном и мишенью 7 см. Каждую пластину-мишень обстреливают дважды, используя диски, разрушаемые при давлении залпа 650 фунтов/кв. дюйм. Между задерживающим экраном и тканью-мишенью помещают экран из нержавеющей стали размером 200х200 меш (McMaster-Carr, Нью-Брунсвик, штат Нью Джерси).

Через 7 дней после введения гена кусочки ткани-мишени переносят из среды с высоким осмотическим давлением в среду для отбора. Для отбора с использованием гена BAR кусочки ткани-мишени помещают в поддерживающую среду, содержащую 100 мг/л глуфосината аммония (Basta®) или 20 мг/л биалафоса (Herbiace®). Все аминокислоты удаляют из среды для селекции. Через 5-8 недель выращивания в этой среде с высоким давлением отбора любой растущий каллюс пересевают в среду, содержащую 3-20 мг/л Basta®.

Для отбора с использованием гена маннозофосфат-изомеразы ткани-мишени помешают в соответствующие среды, не содержащие сахарозы, но содержащие 1% маннозы. Из этих сред аминокислоты не удаляют. Через 5-8 недель растущий каллюс либо пересевают в среду D для поддержания развития каллюса, не содержащую сахарозу и содержащую 1,5% маннозы, или в КМ-среду для поддержания развития каллюса, содержащую 1% сахарозы и 0,5% маннозы. Растущий в среде для селекции эмбриогенный каллюс пересевают каждые 2 недели в течение 4-8 недель до получения количества каллюсов, достаточных для регенерации 10-20 растений. Выжившую после селекции ткань из исходного кусочка ткани-мишени пересевают в виде единичной колонии и обозначают как независимый случай трансформации.

В этот момент времени, колонии, отобранные в среде с добавлением Basta®, переносят в модифицированную MS-среду (Murashige и Skoog, Physiol. Plant 15: 473-497, 1962), содержащую 3% сахарозы (MS3S), без селектирующего агента и помещают на свет. В эту среду добавляют либо 0,25 мг/л анцимидола и 0,5 мг/л кенетина для того, чтобы индуцировать развитие зародыша, либо 2 мг/л бензиладенина. Колонии, отобранные с помощью маннозы, переносят на модифицированную MS-среду, содержащую 2% сахарозы и 1% маннозы (MS2S + 1М) с описанными выше добавками анцимидола и кинетина, или на модифицированную MS-среду, содержащую 2% сахарозы и 0,5% маннозы (MS2S + 0,5М) с описанной выше добавкой бензиладенина.

Через 2 недели регенерирующие колонии, отобранные на среде с добавлением Basta®, переносят на среду MS3S без анцимидола и кенетина или бензиладенина соответственно. Регенерирующие колонии, отобранные с помощью маннозы, через 2 недели переносят на безгормональную среду MS2S +1М и MS2S +0,5М соответственно. Регенерирующие побеги с корнями и без корней из всех колоний переносят в ящики Magenta, содержащие среду MS3S, и в конце концов получают небольшие растения с корнями, которые переносят в почву в теплицу.

Растения тестируют в отношении экспрессии гена PMI на основе модифицированного анализа в 48-луночных планшетах с хлорфенолом красным с использованием среды, которая не содержит сахарозу и содержит 0.5% маннозы. Образцы листа (~ 5 мм × 5 мм) помещают на среду для анализа и выращивают в темноте в течение ~72 ч. Если в растении происходит экспрессия гена PMI, то оно может метаболизировать маннозу, и среда приобретает желтое окрашивание. Если экспрессия не происходит, то среда сохраняет красный цвет.

Случаи трансформации также создают с использованием каллюса типа I, полученного из незрелых зиготических зародышей с помощью стандартных методов культивирования. Для введения гена примерно 300 мг каллюса типа I получают, пересевая на свежую среду за 1-2 дня до введения гена, отбирая кусочки ткани-мишени и размещая по окружностям радиусом 10 мм от центра пластины-мишени на среду, которая снова содержит 12% сахарозы. Примерно через 4 ч ткань подвергают бомбардировке с помощью устройства типа PDS-1000Не Biolistics фирмы DuPont. Представляющие интерес плазмиды осаждают на золотые частицы размером 1 мкм, используя стандартный протокол фирмы DuPont. Гены вводят, обстреливая пластину-мишень дважды, используя диски, которые разрушаются при давлении залпа 650 фунтов/кв. дюйм.

Примерно через 16 ч после введения гена каллюс переносят на стандартную среду для культивирования, содержащую 2% сахарозы без селектирующего агента. Через 12-13 дней после введения гена кусочки ткани-мишени переносят на среду для селекции, содержащую 40 мг/л фосфинотрицина в виде либо Basta, либо биалафоса. Каллюс пересевают на среду для селекции в течение 12-16 недель, после чего выживший и растущий каллюс переносят на стандартную среду для регенерации, содержащую 3 мг/л фосфинотрицина в виде Basta для получения растений.

Пример 6: Трансформация пшеницы

Предпочтительный метод трансформации пшеницы предусматривает бомбардировку частицами незрелых зародышей пшеницы и включает перед введением гена стадию культивирования на среде с высоким содержанием либо сахарозы, либо с высоким содержанием мальтозы. Перед бомбардировкой любое количество зародышей (длиной 0,75-1 мм) помещают на MS-среду с 3% сахарозы (Murashige and Skoog, 1962) и 3 мг/л 2,4-Д для индукции соматических зародышей и выдерживают в темноте. В выбранный день, предназначенный для бомбардировки, зародыши удаляют из среды для индукции и переносят в осмотикум (т.е. в среду для индукции с добавлением требуемой концентрации сахарозы или мальтозы, как правило, 15%). Зародышам дают пройти стадию плазмолиза в течение 2-3 ч и затем подвергают бомбардировке. На пластину-мишень помещают, как правило, 20 зародышей, хотя это количество не имеет решающего значения. Соответствующую несущую ген плазмиду осаждают на золотые частицы размером около микрометра, используя стандартные методики. Каждую пластину с зародышами обстреливают с помощью устройства на основе гелия типа DuPont Biolistics, используя давление залпа ~1000 фунтов/кв. дюйм и стандартный экран с размером пор 80 меш. После бомбардировки зародыши вновь переносят в темноту для восстановления в течение примерно 24 ч (все еще в осмотикуме). Через 24 ч зародыши удаляют из осмотикума и помещают на среду для индукции, где их культивируют в течение примерно 1 месяца до регенерации. Примерно через 1 месяц эксплантаты зародышей с развивающимся эмбриогенным каллюсом переносят в среду для регенерации (MS + 1 мг/л НУК, 5 мг/л GA), которая дополнительно включает соответствующий селектирующий агент. Примерно через 1 месяц развившиеся проростки переносят в большие стерильные контейнеры, называемые GA7, которые содержат MS-среду половинной крепости, 2% сахарозы и такую же концентрацию селектирующего агента. Стабильная трансформация пшеницы описана подробно в ЕР 0674715.

Перечень последовательностей приведен в конце описания.